Method Article

Diseño e implementación de un sistema automatizado de Iluminador, cultivo y sistema de muestreo para Aplicaciones microbiana Optogenética

DOI:

10.3791/54894

⸱

February 19th, 2017

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se diseñó un aparato de cultivo continuo para uso con sistemas de optogenética para iluminar cultivos de microbios y periódicamente celdas de imagen en el efluente con un microscopio invertido. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas a la iluminación pueden ser medidos durante varios días.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

optogenética sistemas utilizan proteínas codificadas genéticamente que cambian la conformación en respuesta a longitudes de onda específicas de luz para alterar los procesos celulares. Hay una necesidad para el cultivo y la medición de los sistemas que incorporan programados iluminación y la estimulación de los sistemas de optogenética. Se presenta un protocolo para la construcción y el uso de un aparato de cultivo continuo para iluminar las células microbianas con las dosis programadas de la luz, y automáticamente adquirir y analizar imágenes de las células en el efluente. El funcionamiento de este aparato como un quimiostato permite que la tasa de crecimiento y el medio ambiente celular para ser estrechamente controlados. El efluente del cultivo celular continua se muestrea regularmente y las células se imágenes de microscopía de múltiples canales. El cultivo, el muestreo, tratamiento de imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas para que las respuestas dinámicas de la intensidad de la fluorescencia y la morfología celular de células de la muestra del efluente de la cultura se miden a través de múltiples díassin intervención del usuario. Se demuestra la utilidad de este aparato de cultivo mediante la inducción de la producción de proteínas de forma dinámica en una cepa de Saccharomyces cerevisiae con un sistema de ingeniería optogenético que activa la transcripción.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemas Optogenética utilizan la luz para controlar una lista creciente de procesos celulares que incluyen la expresión génica, 1, 2, 3, 4, 5 la localización de proteínas, actividad de la proteína 6, 6, 7, 8 la proteína de unión, 8, 9, 10 y degradación de proteínas. 11 Un método para el cultivo de células en un entorno controlado con la estimulación óptica programada y para medir su respuesta en escalas de tiempo biológicamente relevantes es necesario para explotar el potencial de estas herramientas para la investigación en biología celular y biotecnología. Nuestro método se aprovecha de chemostasis para mantener una tasa de crecimiento constante de celda en un bien mezclada, aeclasificar y recipiente de cultivo de vidrio de temperatura controlada 12, 13 que está expuesto a la iluminación programado. Nosotros imagen células individuales en el efluente de cultivo con un microscopio invertido para medir la respuesta de la cultura a la iluminación programado. El cultivo, toma de muestras, imágenes y análisis de imágenes son totalmente automatizadas de manera que la intensidad de fluorescencia y la morfología celular del cultivo celular efluente se pueden medir a través de múltiples días sin intervención del usuario.

Este protocolo se puede implementar en la mayoría de laboratorios familiarizados con creciente cultivo celular y microscopía, y el aparato utilizado es barato y está hecho de componentes fácilmente disponibles. Un recipiente de cultivo transparente se coloca por encima de una matriz de diodos emisores de luz (LED) capaces de emitir 1 mW / cm 2 -10 mW / cm 2 de la luz. Los microbios se cultivan en el recipiente de cultivo de forma continua; una bomba peristáltica se utiliza para agregar los medios de comunicación en eltasa de dilución, otro se usa para retirar de cultivo a una tasa menor para el microscopio, y la diferencia se escapa a través de una salida de rebosamiento. Una almohadilla de calefacción mantiene la temperatura. Se bombea aire continuamente en el recipiente de cultivo para mantener una presión positiva, así como para mezclar y airear el cultivo. A excepción de la bomba de aire, la energía a estos dispositivos está regulado por un microcontrolador que también recibe la entrada desde un termómetro y un ordenador de sobremesa conectado. El cultivo celular efluente se bombea a un dispositivo de microfluidos de la etapa de un microscopio invertido. No fluorescente y las imágenes fluorescentes se adquieren automáticamente. Las células en las imágenes se caracterizan por un algoritmo que localiza cada célula como una región de interés (ROI) y mide las propiedades de cada ROI.

Para demostrar una aplicación de este protocolo, se midió la respuesta a diferentes intensidades de luz de células de Saccharomyces cerevisiae ingeniería con una responsa de luz azulve sistema optogenético que controla la transcripción de la proteína fluorescente. S. cerevisiae, comúnmente conocida como la levadura de panadero, se seleccionó debido a múltiples sistemas optogenética para controlar la expresión génica en este sistema ya existen 14, 15, 16. Además, este organismo modelo se utiliza comúnmente para estudios en la biología de sistemas 17 y como un chasis para aplicaciones biotecnológicas 18, 19, 20. Nuestros resultados representativos demuestran que este protocolo se puede utilizar para controlar la transcripción de un cultivo durante varios días mediante la variación de las intensidades de luz de entrada y la medición de la producción de un indicador fluorescente.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

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Figura 1: El aparato de cultivo continuo. Este diagrama simplificado muestra cómo el aparato debe ser montado cuando se utiliza para la cultura, iluminar, y medir las propiedades ópticas de los microbios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Visión general del protocolo. Los pasos en la región sombreada se deben repetir cada vez que se utiliza el protocolo. Control de bucle cerrado 34 es posible, pero no se implementa en este protocolo.

1. Montar el termómetro al tablero de circuitos


Figura 3: Conexiones para leer los valores del termómetro. Este diagrama muestra cómo el termómetro digital debe estar conectado a la PCB de modo que el microcontrolador puede obtener retroalimentación para controlar la temperatura del cultivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
  1. Soldar la tierra, los datos y las líneas de tensión positiva del termómetro digital para sus respectivos agujeros pasantes marcados "GD + V".
  2. Clip de un pin de un conector de 3 pines hembra y recortar los 2 pines restantes con máquinas de cortar el alambre, de manera que puede encajar en los dos agujeros pasantes de la etiqueta "R2" y no obstruir el microcontrolador. Soldar esto en su lugar. Conectar los dos pasadores soldadas mediante la inserción de una resistencia de 4,7 kW en la cabecera del pasador.

2. Conectar la alimentación de ConComponentes de control a la tarjeta de circuitos

figure-protocol-3
Figura 4: Conexiones de control de potencia a la resistencia de calentamiento. Este diagrama muestra cómo las partes de PCB y los accesorios deben ser montados con el fin de controlar el poder de la resistencia de calentamiento. Las partes para el control de las bombas peristálticas están conectados de una manera similar. Tenga en cuenta que los componentes para el termómetro se han eliminado para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Se quita a 1 cm de los pasadores de cinco cabeceras de 3 pines hembra. Soldar estos a las posiciones de la placa de circuito impreso (PCB) marcado como "# 1", "# 2", "# 3", "# 4", y "CB E."
  2. Se quita 1 cm de los pines de un encabezado de 6 pines y 8 pines hembra. Soldar éstas lado a lado parala columna de orificios pasantes a través de la etiqueta K1 K14.
  3. Conecte la resistencia de calentamiento de la placa de circuito.
    1. Inserte los extremos de una resistencia de 100 kW en el K1 orificios pasantes etiquetados y K2 en el PCB. Insertar un transistor de metal-óxido-semiconductor de efecto de campo (MOSFET) en la posición marcada # 1 en el PCB, con la etiqueta de la MOSFET que mira hacia el K1 a K14 a través de los orificios pasantes de manera que el pasador de fuente es más cercano a la "# "etiqueta, y la clavija de drenaje está más alejado de la" etiqueta # ".
    2. Cortar la línea de tierra del cable de 5 V de corriente continua (DC) fuente de alimentación y conectarlo a J2. Conectar la línea de tierra de la resistencia de calentamiento a J1. Conectar K3 al pin 3 con una resistencia de 1 kW. Corriente ahora solo debería fluir de J1 a J2 cuando el pin 3 se ajusta a + 5V.z
      NOTA: Las funciones de ajuste de resistencia / MOSFET como un interruptor que permite que la corriente fluya desde J1 J2 pin para cuando el pin 3 del microcontrolador se establece en 5 V.
  4. Conectarla bomba peristáltica lento.
    1. Inserte los extremos de una resistencia de 100 kW en el K4 orificios pasantes etiquetados y K5 en el PCB. Insertar un MOSFET en la posición marcada # 2 en el PCB, con la etiqueta de la MOSFET que mira hacia el K1 a K14 a través de los orificios pasantes de manera que el pasador de fuente es la más cercana a la etiqueta "#", y el pasador de drenaje está más alejado del la etiqueta "#".
    2. Cortar la línea de tierra del cable de alimentación de 12 V CC de la bomba peristáltica lento. Conectar la bomba peristáltica mirando hacia el extremo de J3 y la verruga de la pared mirando hacia el extremo de J4. Conectar K6 al pin 4 con una resistencia de 1 kW. Corriente ahora solo debería fluir de J3 J4 que cuando el pin 4 está ajustado a +5 V.
  5. Conectar la bomba peristáltica rápida
    1. Inserte los extremos de una resistencia de 100 kW en el K7 orificios pasantes etiquetados y K9 en el PCB. Inserte un MOSFET en la posición marcada # 3 en el circuito impreso, con la etiqueta del MOSFET que mira hacia el K1 a K14 a través de los orificios pasantes s o que el pasador de fuente es la más cercana a la etiqueta "#", y el pasador de drenaje está más alejado de la etiqueta "#".
    2. Cortar la línea de tierra del cable de alimentación de 12 V CC de la bomba peristáltica rápido. Conectar la bomba peristáltica hacia fin a J5 y la verruga de la pared mirando hacia el extremo de J6. Conectar K9 al pin 5 con una resistencia de 1 kW. Corriente ahora solo debería fluir de J5 J6 cuando el pin 5 se establece en 5 V.

3. Conectar la matriz de LED a la tarjeta de circuitos

figure-protocol-4
Figura 5: Conexiones para controlar la matriz de LED. Este diagrama muestra cómo la matriz de LED se debe conectar a la PCB. También muestra que la PCB se pueden apilar en el microcontrolador. Tenga en cuenta que los componentes para el termómetro y para controlar la potencia DC a otros dispositivos se han quitado para mayor claridad.en / ftp_upload / 54894 / 54894fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Soldar el 6 pines, 10 pines, y los dos conectores macho hembra de 8 pines en los orificios pasantes en los lados de la PCB de modo que pueda ser apilados uno encima del microcontrolador.
  2. Soldar el 100 nF y los condensadores 10 mF a sus posiciones marcadas en el PCB, señalando que el terminal negativo del condensador de 10 mF (plomo más corto) debe estar conectado al agujero a través marcado con un signo negativo.
  3. Soldar el conductor del LED al 2 por 12 conjunto de orificios de paso, con la muesca del conductor lejos de los orificios pasantes reservados para la matriz de LED.
  4. Soldar 2 columnas de cabezales de pin macho a los agujeros pasantes marcados para la matriz de LED, y recortar los extremos de éstos por debajo del tablero de tal manera que no obstruyan el microcontrolador. Las conexiones a través de dos tiras de 8 hilos de cables hembra / hembra de los puentes. Conectar un segundo conjunto de machoconectores macho en el otro extremo de los cables de puente.
  5. Inserte la matriz de LED sobre la mediana de la placa, y luego insertar el segundo conjunto de conectores macho a las columnas a cada lado de la matriz. Asegúrese de que las conexiones eléctricas son los mismos que si la matriz de LED se ha conectado directamente a la PCB con la cara de la etiqueta de la matriz que corresponde a la columna con la etiqueta de orificios pasantes.
  6. Clip de un pin de un conector de 3 pines hembra y recortar los 2 pines restantes con máquinas de cortar el alambre, de manera que puede encajar en los dos orificios pasantes etiquetados con "R1" y no obstruir el microcontrolador. Soldar esto. Conectar los dos pasadores soldadas mediante la inserción de una resistencia de 1 kW en la cabecera del pasador.
    Nota: El recipiente de cultivo se apilan sobre la matriz de LED. Si las cintas de alambre obstruyen el recipiente, ellos desplazamiento de la matriz. A continuación, utilice cable de núcleo sólido para cerrar la brecha entre los pasadores de la matriz y los pasadores de cinta de alambre, de tal manera que las conexiones eléctricas no CHange.

4. Instalar el software y conectar con el hardware

  1. Apilar el PCB en el microcontrolador.
  2. Sigue los enlaces en la lista de materiales para descargar el entorno de desarrollo integrado (IDE) y el código personalizado para el microcontrolador.
  3. Conectar el microcontrolador a la computadora mediante un cable microscopio AB bus serie universal (USB). Compilar y cargar el código personalizado para el microcontrolador.
  4. Descargar Micro-Manager 21, 22 y 23 de FIJI. Configurar Micro-Manager como un plug-in FIJI copiando todos los archivos ".dll", el directorio "mmplugins", y el directorio "mmautofocus" desde el directorio en el Micro-Manager se descargó en el directorio "Fiji.app". También, copiar los "plugins / Micro-Manager" de directorio en el directorio "Fiji.app/plugins".
  5. Descargar el "BioreactorController.jar" int archivoo el directorio "Fiji.app/mmplugins".
  6. Abrir Micro-Manager desde Fiji> Plugins> Micro-Manager> Micro-Studio Manager. Utilice el asistente de configuración de hardware para configurar el software para controlar el microscopio. Incluir el dispositivo "FreeSerialPort" en el Asistente con la etiqueta del puerto al que está conectado el cable USB AB.

5. Hacer y caracterizar el recinto a prueba de luz para el recipiente de cultivo

  1. Apilar tres zócalos IC 8 pines como bloques de construcción en el tablero en cada esquina de la matriz de LED de tal manera que el recipiente de cultivo puede descansar sobre ellos por encima de la matriz.
  2. Fijar una porción de papel de difusión bajo la capa superior de las tomas de corriente, de tal manera que la luz que incide sobre el recipiente de cultivo de la matriz de LED es difusa.
  3. Cortar tres 8 "por 6" porciones de espuma negro. Recortar una parte que es del mismo tamaño que el tablero electrónico (2,3 "x 3,5") desde el interior de la primera two y una porción que es el tamaño del rectángulo hecha por los sockets IC (0,9 "x 1,8") desde el interior de la tercera. Pila de estas capas más de la matriz de LED de manera que la capa final que contiene la abertura de 0,9 "x 1,8" se encuentra con la parte superior de los zócalos IC, y rodea la matriz de LED.
  4. Cortar una hoja adicional de espuma de negro por la mitad para formar un rectángulo de 6 "por 24". Rollo de esto en una columna hueca de espuma negro que el recipiente de cultivo puede encajar en con espacio para tubos y cables, de manera que se térmicamente y ópticamente aislar el recipiente de cultivo.
  5. Centre la columna hueca de espuma negro sobre la matriz de LED, y marcar el límite de la columna de la capa de espuma negro debajo de ella. Este límite marcará donde debe estar centrado en el futuro.
  6. Recortar una parte de 3 "x 3" de espuma negro. Utilice esta tarde como una tapa que puede ser pegado en la parte superior de la columna para bloquear la luz externa.
  7. Coloque el sensor de potencia fotodiodo a th e cultivando una gorra de vaso con cinta, coloque la tapa e inserte el recipiente de cultivo en el recinto.
  8. En Micro-Manager, vaya a Complementos> Controlador biorreactor. Establecer la matriz para iluminar en un subconjunto de la gama de posibles intensidades en intervalos de 30 s.
  9. Registrar las intensidades de luz como se muestra en la consola metros de potencia conectado al sensor de potencia. Estas medidas permitirán a la intensidad real de la luz que se conocerá cuando se ajusta el número de LEDs que se encienden y la corriente (PWM) por ancho de pulso modulado a los LEDs.

6. Preparar el recipiente de cultivo

figure-protocol-5
Figura 6: Conexiones del buque. Este diagrama muestra cómo el recipiente y el tubo del aparato deben conectarse antes de ser tratado en autoclave.blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Marcar la altura correspondiente a cada 2 ml de la subasta de líquido en el intervalo de 10 ml a 30 ml en el recipiente de cultivo. Introduzca 10 ml de agua desionizada estéril, marque el nivel de agua, añadir 2 ml, marque el nivel del agua, y repetir hasta que el nivel de 30 ml se marca. Cubrir las inscripciones con cinta adhesiva transparente para que no se eliminan fácilmente, y desechar el líquido.
  2. Coloque el extremo largo del puerto de aluminio a través de la junta de silicona, en el recipiente de cultivo. Tornillo en la tapa.
  3. Cubrir una salida de puerto de aluminio corto con tubo de silicona ID 1/16 ". Enchufe el extremo distal mediante la inserción de un luer hembra de bloqueo y, a continuación la conexión de un conector de bloqueo luer macho. Esta salida es complementaria, y no será utilizado (tubo 6 en la Figura 6 ).
  4. Conectar dos segmentos cortos de 1/16 "tubo de silicona ID con cerraduras Luer macho y hembra. Conectar un extremo a una toma de puerto de aluminio corto y conecte el distal finales con un luer macho y conector luer hembra. El recipiente se inocula a través de este tubo (tubo 7 / 7.1 en la Figura 6).
  5. Conectar dos tubos de 1/16 "de identificación a los extremos del 1/16" ID del tubo peristáltico y los conectores. Conecte un extremo a un puerto de aluminio corta y el otro (tubo 4 en la Figura 6). Más tarde, este será conectado al matraz de medios de comunicación.

7. Preparar el frasco de Medios

  1. Conectar un "tubo de diámetro interior (ID) de silicona en el puerto de aluminio más largo. El tubo debe ser lo suficientemente largo como para alcanzar el matraz de medios de comunicación. Conectar un 1/8" 1/16 de cierre luer macho Identificación de un segmento corto de 1/16 " Identificación tubo, conecte este al tubo anterior ,, y luego insertar este corto segmento en el tapón de goma del frasco de los medios de comunicación (tubo 3 en la Figura 6).
  2. Sujetar el tubo. Esta conexión permite que el aire fluya desde el matraz de medios de comunicación para el recipiente de cultivo. Cuando el matraz de medios de comunicación se bombea más tarde con un aired este tubo se suelta, la cultura será mezclado, aireado, y se mantiene a una presión positiva por las burbujas entrantes.
  3. Inserte un "tubo de Identificación el tiempo suficiente para llegar al fondo del vaso en el tapón, a través del cual se transferirán los medios de comunicación. Conecte otro 1/16" 1/16 tubo de ID a éste, y luego un tubo de 3/16 "Identificación de eso. el tapón esto con un "ID de bloqueo luer hembra de 3/16 y un conector de bloqueo luer macho (tubo de 1 / 1.1 en la Figura 6).
  4. El tercer agujero en el tapón debe estar lleno de un segmento corto de 1/16 "tubo de ID, conectado a otros dos segmentos de tubo de diámetro medio y conectado en el extremo distal (tubo 2 / 2.1 en la Figura 6). Este se conectará a una bomba de vacío y después a una bomba de acuario.
    NOTA: Si el tubo no puede caber fácilmente a través de los agujeros en el tapón de goma, cortar los extremos de la tubería en una inclinación. Entonces, el extremo inclinado que se empuja a través del orificio se puede utilizar para tirar el resto a través.

  1. Insertar un cierre luer macho en un segmento de 1/16 "tubo de silicona ID, y luego inserte firmemente 0.022" tubo de politetrafluoroetileno ID (PTFE). Por separado, adjuntar un cierre luer hembra a un 1/16 "tubo de ID. A continuación, un extremo del hilo a lo largo del tubo de PTFE para conectar las cerraduras y el otro a un puerto de aluminio corto (tubo 5 en la Figura 6).
  2. Conectar el "tubo de silicona de identificación al 1/50" 1/50 expuesta tubo y conectores peristáltica ID. Para ello, conecte tres segmentos de 1/50 "tubo de Identificación y dos segmentos de 0.022" tubo de PTFE ID, alternándolos. Conectar esta al matraz de efluente a través de 1/16 "tubo de ID (tubo 5 en la Figura 6).
  3. Conectar un extremo de un tubo de 1/16 "silicona ID al tubo segundos más largo del puerto de aluminio y el otro extremo al matraz efluente. Este tubo de aluminio establece el volumen de cultivo, y el exceso de cultura desborda en el recipiente de efluente (tubo 8 en
  4. Esterilizar en autoclave el conjunto de cultivo a 121 ° C y 15 psi (esterilización general) durante 30 min.
    Nota: Los tubos a través del cual se llena el matraz de medios de comunicación, a través del cual se aspira el matraz de medios de comunicación, y a través del cual se inocula el recipiente de cultivo tener múltiples segmentos de tubo de modo que si el segmento distal está contaminado, se puede retirar para revelar una estéril segmento.

9. Preparar el canal de microfluidos

  1. Mezclar polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado en una relación de 9: 1. Degas y vierta en el molde maestro de silicio.
  2. Curar los PDMS de 2 horas a 65 ° C y luego se corta a partir de la máscara con una hoja de afeitar. Corte alrededor de los PDMS hasta que se libere del molde. Evitar empujar hacia abajo y romper la oblea frágil.
  3. Use un 1,2 mm de diámetro interior perforadora biopsia para perforar agujeros en ambos extremos del canal.
  4. Vínculo plasma el PDMS en el cristal de la cubierta 24.
  5. Tape el tiempo extremos de la cubierta de vidrio a la estructura de aluminio de apoyo de manera que el canal de PDMS se centra en el marco de aluminio, y luego hornear el PDMS de nuevo durante 2 horas a 65 ° C.

10. Llenar el frasco de Medios

figure-protocol-6
Figura 7: Adición de los medios de comunicación. Este diagrama muestra cómo los medios deberían ser filtró al vacío en el matraz medios de comunicación. Se asegura de que los medios de comunicación sigue siendo estéril. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Hacer los medios de comunicación apropiados. Si el sistema de cultivo continuo será operado como un quimiostato, utilizar medios limitados para un nutriente específico.
    NOTA: Los ejemplos de la composición del medio estándar para los estudios con S. cerevisiae se han publicado previamente 25,= "xref"> 26, 27, 28, 29.
  2. Coloque el filtro de vacío a una botella de 100 ml, retire la cubierta del pezón, luego retire el enchufe blanco del pezón del filtro de vacío con pinzas estériles.
  3. Conectar el tubo de silicona 3/16 "ID para el pezón, otro tubo libre del frasco de los medios de comunicación a una bomba de vacío (tubos 1 y 2 en la figura 7, respectivamente), y asegúrese de que el tubo que conecta el matraz de medios de comunicación para el recipiente de cultivo se sujeta cerrar (tubo 3 en la Figura 7).
  4. Llenar el filtro con los medios de comunicación, encender la bomba de vacío, y luego filtrar el resto de los medios de comunicación. Sujetar el tubo de silicona 1/16 "ID conectado al vacío (tubo 2 en la Figura 7) y apague la bomba de vacío.
  5. Quitar los leurs desde el segmento intermedio de 1/16 "tubo ID conectado a la bomba de vacío de modo que un extremo no contaminada del tubo es accesible. Inserte THextremo azul de correo de un filtro de aire de la jeringa estéril en este tubo.
  6. Cierre la tubería de 3/16 "de silicona ID (tubo 1 en la Figura 7) y desconectar el luer macho de la misma. Desconectar el enchufe de la clavija hembra del tubo de entrada de los medios de comunicación del recipiente de cultivo. Conecte estos luer macho y hembra para permitir que los medios de comunicación para ser bombeado en el recipiente de cultivo.
  7. Retire el filtro de vacío y la tapa de la botella ml de medios de comunicación que se adjuntan al filtro de vacío 100.
  8. Un día antes de que se inocula el recipiente de cultivo, inocular una única colonia del microbio optogenético en un tubo de ensayo con 4 ml de los medios de comunicación recogidos en el paso anterior, y se deja crecer durante la noche a 30 ° C o la temperatura de la temperatura de crecimiento óptima de la cultura con agitación.

11. Montar el aparato Alrededor del microscopio

  1. Coloque el montaje de cultivo continuo cerca del microscopio con los medios de comunicación frasco alto que el recipiente de cultivo y la efflumatraz ent más bajo que el recipiente de cultivo, de manera que el tubo compuesto de segmentos de 0,022 "tubo de PTFE ID (tubo 5 en la Figura 6) puede alcanzar la platina del microscopio. firmemente con cinta adhesiva los tapones de goma en el matraz de medios de comunicación y el contenedor de efluente.
  2. Desconectar los extremos del 0,022 "ID PTFE tubo del 1/50" tubo de silicona ID conectan (tubo 5 en la Figura 6), y conecte estos extremos en la entrada y la salida del dispositivo de microfluidos.
  3. Conecte el extremo blanco del filtro de aire de la jeringa a la bomba de acuario. La presión del aire empujará los medios de comunicación en el recipiente de cultivo.
  4. Cuando los medios de comunicación llega al nivel del puerto de efluentes, envolver el tubo "ID de medios de entrada y conectores alrededor de la bomba peristáltica lento (tubo 4 en la Figura 6) y el 1/50" 1/16 tubo de salida ID de la muestra y los conectores alrededor de la rápida bomba peristáltica (tubo 5 en la Figura 6).
  5. Airear los medios de comunicación por el desamarre del aire maser entre el matraz y los medios de comunicación recipiente de cultivo.
  6. Cinta de la resistencia de calentamiento y termómetro para el recipiente de cultivo de modo que su temperatura puede ser controlada. Enrolle el tubo de medios de todo el recipiente de cultivo por lo que los medios de comunicación que entran estarán a la misma temperatura que el buque.
    NOTA: La corriente PWM a la resistencia de calentamiento se regula por el microcontrolador que utiliza entradas desde el termómetro para mantener el recipiente de cultivo a su temperatura de punto de ajuste.
  7. Insertar el recipiente de cultivo en el recinto de espuma negro sobre la matriz de LED, y asegurarse de que los tubos no queden atrapados.
  8. En Micro-Manager, vaya a Complementos> Controlador biorreactor. Establecer la "relación de los medios de comunicación de la bomba en el" campo a 0.1 y la "relación de muestra de la bomba en el" campo a 0. El caudal será muy baja, pero mayor que la velocidad de evaporación.
  9. Sujetar el tubo de entrada de aire entre el matraz y los medios de comunicación recipiente de cultivo. Retire el tapón del tubo de la inoculación (tubo 7 en la figura
  10. Cubrir el recinto de manera que la luz no entra, y dejar que el cultivo crezca durante la noche.

12. Calibre los gastos de bombeo

  1. En Micro-Manager, vaya a Complementos> Controlador biorreactor. Establecer la "relación de los medios de comunicación de la bomba en el" campo a 0,5 y la "relación de muestra de la bomba en el" campo a 0.
  2. Desconectar el tubo de desbordamiento del matraz efluente (tubo 8 en la Figura 6) y el tubo de toma de muestras del matraz efluente (tubo 8 en la Figura 6) y recoger efluente en recipientes separados. Recoger el efluente durante 1 hora, comenzando después de que las bombas han estado en marcha durante 15 min.
  3. Calcular la velocidad de flujo de medios de comunicación en el recipiente de cultivo a partir del volumen recogido en el recipiente como:
    figure-protocol-7
  4. Ajuste el valor de la "relación de compresión de medios en" campo de esta estimación lineal:
    figure-protocol-8
    dónde
    figure-protocol-9
  5. Iterar a través de este procedimiento de calibración hasta que la diferencia entre el caudal deseado y el caudal medido es <0,2 ml / h, en donde la velocidad de flujo se promedia durante un período de 1 h.
  6. Aumentar el valor de la "relación de muestra en" campo y calibrar de una manera similar hasta aproximadamente 4/5 del volumen TH dejando el recipiente de cultivo se bombea por la bomba de toma de muestras y aproximadamente 1/5 del volumen abandona a través el puerto de desbordamiento.
  7. Deje que la densidad de cultivo en el aparato de cultivo continuo equilibre en estas condiciones durante la noche.
    NOTA: Si los caudales deseados no pueden ser alcanzados, el cambioel tubo de la bomba peristáltica. El líquido se bombea a una tasa más alta cuando se utiliza la tubería de mayor diámetro. Siga el paso 14 y luego volver al paso 8.4.

13. Recoger Microscopio Imágenes de microbios cultivados

  1. Llene la Lista Posición etapa en Micro-Manager con un conjunto de posiciones que no se solapan en el que las imágenes de las células inyectado en el canal de microfluidos estarán en el plano focal.
  2. Abrir el plugin "biorreactor Controller". Seleccione el curso deseado tiempo de matriz de LED, canales de imagen, y otros parámetros experimentales de las indicaciones. Recoger y analizar imágenes.
  3. Si bien el experimento funciona, asegúrese de que los medios de comunicación en el matraz de comunicación sigue siendo clara. Si está nublado, entonces se ha contaminado.

14. Post-experimento

  1. Disponer de medios de comunicación, el exceso de cultivo celular y efluentes.
  2. Llenar el matraz de medios de comunicación con 200 ml de 20% EtOH se mezcla con agua desionizada. Ejecutar el quimiostato como lo había hecho anteriormenteha ejecutado durante el experimento para lavar los restos celulares y los medios de comunicación.
  3. Cuando la solución de alcohol se haya drenado del matraz medios, desmontar el quimiostato totalmente.
  4. Lavar la cristalería y los tubos con agua tibia y un detergente suave y enjuagar bien con agua desionizada. Dejar secar.
  5. Abra el archivo "microcontrollerRecords.csv" para revisar la temperatura y el estado de la matriz de LED en el transcurso del experimento, el archivo "Summary.csv" para revisar los datos de resumen de cada conjunto de imágenes y los "Resultados .csv" para revisar los archivos de datos que resumen cada ROI de cada período de tiempo, donde n es el enésimo conjunto de datos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este aparato se utiliza para estimular un cultivo de S. cerevisiae que expresa la proteína fluorescente amarilla (YFP) en respuesta a la luz azul a través de un sistema de transcripción optogenético inducible basado en el par de proteínas CRY2 / CIB1 30. Las células fueron cultivadas en medios limitados chemostatically-fosfato con una tasa de dilución media de 0,2 ± 0,008. Limitación de fosfato se utiliza comúnmente en experimentos de S. cerevisiae

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos diseñado este aparato pensando en la flexibilidad. Todo el código utilizado es libre y de código abierto. El proceso de análisis de imagen por defecto en las células del segmento es simple y funciona rápidamente. Análisis personalizado podría ser implementado mediante el registro de entrada del usuario, mientras que el análisis de una imagen representativa con la interfaz gráfica de usuario FIJI, la conversión de la entrada a un guión beanshell y después configurar el plugin para llamar al script. Cuando se le lla...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

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Nos gustaría reconocer Molly Lazar y Verónica Delgado para la asistencia en la prueba del protocolo, Kieran Sweeney útil para los debates y la edición, y Taylor Scott, My An-adirekkun, y Stephanie Geller para la lectura crítica del manuscrito. Megan Nicole McClean, Ph.D. posee una concesión de carrera en la interfaz de la Ciencia del Fondo Burroughs Wellcome.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Extenso manual de laboratorioGitHubNAUn extenso manual de laboratorio actualizado periódicamente está disponible en el " Archivos de Quimiostatos Optogenéticos" Repositorio de GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). Esto también incluye una descripción del molde microfluídico utilizado para generar los resultados representativos.
Fritzing Design ViewerFritzingNAEl software gratuito y de código abierto para ver y editar los diseños de placas de circuito tipo .fzz está disponible en "http://fritzing.org/download/"
Arduino Uno R3 (Atmega328 - ensamblado)Microcontrolador Adafruit50. 1 requerido.
Kit de cabezales apilables ArduinoSparkFun Electronics10007Cabezales de pines hembra para conectar PCB al microcontrolador. Se requiere 1.
Soldador ajustable 30W 110V - XY-258 110VAdafruit180Para realizar conexiones eléctricas a la PCB. Se requiere 1.
Soporte para soldadorAdafruit150Para realizar conexiones eléctricas a la placa de circuito impreso. Se requiere 1.
Mini carrete de soldadura - 60/40 plomo soldadura con núcleo de colofonia 0.031" de diámetro - 100gAdafruit145Para realizar conexiones eléctricas a la PCB. Se requiere 1.
0.1 μ Condensador FSparkFun ElectronicsCOM-08375Estabiliza el voltaje en PCB. Se requiere 1.
10 μ Condensador FSparkFun ElectronicsCOM-00523Estabiliza el voltaje en PCB. Se requiere 1.
MAX7219CNG Controlador de pantalla LED de matriz / dígitos - MAX7219MaximMAX7219CNGcontrolador LED. Se requiere 1.
8 pines IC SocketMouser Electronics575-14430816 requeridos. Estos se apilarán uno encima del otro para soportar el recipiente de cultivo por encima de la matriz de LED.
Zócalo IC de 24 pinesMouser Electronics535-24-3518-10Opcional. Utilícelo para conectar de forma reversible el controlador MAXIM 7219CNG a la placa de circuito impreso.
Multímetro digitalAdafruit2034Para la resolución de problemas electrónicos. Se requiere 1.
Cabezales de ruptura - 40 pines macho (centro largo, PTH, 0.1")SparkFun ElectronicsPRT-12693Cabezales de pin macho para conectar una matriz de LED a una placa de circuito impreso. Los extremos se pueden recortar con cortadores de alambre. Se requiere 1 juego.
Cortacables diagonales enrasadosAdafruit152Para recortar cabezales de clavijas largas y cortar cables de alimentación. Se requiere 1.
Cables de puente hembra/hembra premium - 40 x 12" (300 mm)Adafruit793para conectar la placa de pruebas a la matriz LED. Se puede conectar de extremo a extremo con cabezales de clavija macho para que sea más largo. 1 obligatorio.
Placa de pruebas de tamaño medioAdafruit64La matriz LED se conectará a ella y el recipiente de cultivo descansará sobre ella.
en miniatura 8x8 Blue LED MatrixAdafruit956. La longitud de onda dominante es de 470 nm (azul). 1 obligatorio. Las matrices LED en miniatura alternativas del mismo proveedor están disponibles con longitudes de onda dominantes: 624 nm (rojo), 588 nm (amarillo), 525 nm (verde), 572 nm (amarillo-verde) y blanco.
Cabezal apilable-3 pinesSe requiere SparkFun Electronics138758.
Kit de resistencias - 1/4W (500 en total)SparkFun Electronics10969Para electrónica. Se requiere 1.
  IRL520N MOSFETInternational RectificarIRL520NInterruptor de regulación de voltaje para controlar la corriente continua. Se requieren 4.
Cable de conexión - Surtido (núcleo sólido, 22 AWG)SparkFun ElectronicsPRT 11367Cable para electrónica. Se requiere 1.
Fuente de alimentación conmutada de 5 V 2 A (2000 mA) - Listada por ULAdafruit276Fuente de alimentación para la almohadilla térmica y Arduino. Se requieren 2.
Adaptador de corriente de conmutación regulada de 12 VDC 1000mA - Aprobado por ULAdafruit798Para bombas peristálticas. Se requieren 2.
Almohadilla térmica eléctrica - 10cm x 5cmAdafruit1481Para calentar el biorreactor. Se requiere 1.
Bomba peristáltica de caudal variable de bajo caudalFisher Scientific13-876-1Para medios de bombeo. Se requiere 1
bomba peristáltica de caudal variable de caudal medioFisher Scientific13-876-2Para el cultivo de bombeo. Se requiere 1.
Adaptador de alimentación conmutada regulado de 9 VDC 1000mA - Adafruit63por UL Para fuente de alimentación de microcontrolador. Orden 1.
Alta temperatura Resistente al agua DS18B20 Sensor de temperatura digital + extrasAdafruit642Termómetro para el biorreactor. Se requiere 1.
MicromanagerMicromanagerNAEl software de control de microscopio gratuito y de código abierto está disponible en "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release"
FIJIImageJNAEl software de análisis de imágenes gratuito y de código abierto está disponible en "http://fiji.sc/"
Arduino Integrated Development EnvironmentArduinoNAEl IDE gratuito y de código abierto está disponible en "https://www.arduino.cc/en/Main/Software"
Código personalizadoGitHubNAEl código de microcontrolador personalizado y el complemento "Bioreactor Controller" están disponibles en el " Archivos de Quimiostatos Optogenéticos" Repositorio de GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Cable USB A a B - 6 piesSparkFun ElectronicsCAB-00512Se utiliza para descargar datos al microcontrolador. Se requiere 1.
bioreactorTimecourse_example.csvGitHubNALa ventaja de cargar los valores de la matriz de LED desde un archivo CSV es que el complemento puede llamar a un programa para actualizar esos valores en función de los resultados del análisis de imágenes, y esos valores se pueden volver a cargar en el microcontrolador, lo que permite el control de retroalimentación. Está disponible en el " Archivos de Quimiostatos Optogenéticos" Repositorio de GitHub (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files).
Geles Tota-frost (papel de difusión)B& H B& H # LOFSFTL
MFR # T1-72		Para matriz LED. 1 requerido.
Hoja de kitting Crosslink 1/4x12x24inGrainger, inc20JL37Espuma negra para el recinto de la vasija de cultivo. Se requieren 4.
Sensor de potencia de fotodiodo estándar, Si, 200 - 1100 nm, 50 mW ThorlabsS120VCPara medir la intensidad de la luz. Se requiere 1.
Cinta de etiquetadoFisher Scientific159015NPara etiquetar y asegurar componentes sueltos. Se requiere 1.
Consola compacta de medidor de potencia y energía, LCD digital de 4"ThorlabsPM100DPara medir la intensidad de la luz. Se requiere 1.
Botella de vidrio de hibridación GL45 de 100 mlBellco Glass, Inc.(7910-40150)Recipiente del biorreactor. Se requiere 1.
Ensamblaje de seis puertosBellco Glass, Inc.Personalizado Para la vasija del biorreactor. Especificaciones del tubo: .125" OD x .055" ID. Puerto A: 1.0" de largo por encima del taco de la tapa y hasta la parte inferior del tubo. Puertos B, C, E, F: 1.0" de largo por encima del taco de la tapa, 33 mm de largo por debajo. Puerto D: 1.0" de largo por encima del taco de la tapa, 65 mm  muy por debajo. 1 obligatorio. Incluye tapón de rosca abierto de polipropileno de 45 mm de diámetro y una junta de silicona blanca para garantizar un sellado hermético entre el tapón y la embarcación.
Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 pulgadas, Pack de 3AmazonB0009F3P3UCinta adhesiva transparente. Esto está disponible en muchos otros proveedores. Se utiliza para cubrir las marcas en el recipiente de cultivo y para asegurar el cubreobjetos con el canal PDMS al marco de soporte de aluminio.
1/16" de diámetro interno x 3/16" de diámetro exterior x 1/16" de pared Tygon Tubo de silicona sanitarioUnited States Plastic Corp.57288Tubos. ~25' requeridos.
Cole-Parmer Tapón de goma blanca Twistit, tamaño 10Cole-ParmerEW-62992-32Tapón de matraz de medios y tapón de matraz de efluentes. Se requieren 2.
Matraz de laboratorio de 2 litrosPyrex4980Matraz de medios y matraz de efluentes. Se requieren 2.
Llave de pinza de díaFisher Scientific5867Para pellizcar tubos cerrados. Se requieren 3.
Conjunto de tubería de repuesto 1/16" IDProductos trazables3372Las bombas peristálticas vienen con un juego de tubos, pero se desgastan después de semanas de uso.
Conjunto de tubería de repuesto 1/50" IDProductos trazables3371Las bombas peristálticas vienen con un juego de tubos, pero se desgastan después de semanas de uso.
Luer macho con anillo de bloqueo x lengüeta de manguera de 1/16", nylon, 25/pkConectores Cole-ParmerEW-45505-00. Se requieren ~ 10 luers.
Luer macho con anillo de bloqueo x lengüeta de manguera de 1/8", Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-04Conectores. Se requieren 5, uno para cada orificio del tapón de goma para llenar con tubo.
Adaptador de lengüeta de manguera luer hembra x 1/16", nylon, 25/pkConectores Cole-ParmerEW-45502-00. ~ 10 luers requeridos.
Luer hembra x Adaptador de lengüeta de manguera de 3/16"Cole-ParmerEW-45502-08Conectores. ~ 10 luers requeridos.
Accesorio Luer Cole-Parmer, Tapa Luer Hembra, Nylon, 25/PKCole-ParmerSC-45502-28
Cole-Parmer Accesorio Luer, Tapón de Bloqueo Luer Macho, Nylon, 25/PKCole-ParmerEW-45505-56
Tubo de PTFE Microcalibre, 0.022" de diámetro interno x 0.042" de diámetro exterior, 100 pies/rolloCole-ParmerEW-06417-21. Se requiere 1 rollo.
Tubo de silicona curado con platino Masterflex, L/S 13,Cole-ParmerEW-96410-13pies. ~25' requerido.
3/16" de diámetro interno x 1/4" de diámetro exterior x 1/32" de pared Tygon Tubo de silicona sanitarioUnited States Plastic Corp.57293Tubos. ~1' requerido.
Filtro de vacíoFisher Scientific974107Filtro de vacío Nalgene para medios filtrantes estériles.
Aquel Oxy-Boost 200Rena Aquatic SupplyAP200Bomba de aire de flujo ajustable de doble diafragma para airear y mezclar medios. Se requiere 1.
0.2 μ m filtro de jeringa para porosCorning International 431229Esto asegura que el aire de la bomba del acuario no contamine el aparato. 1 requerido.
Slygard 184 Kit de elastómero de siliconaDow CorningSlygard 184Para dispositivo microfluídico. Se requiere 1.
Maquinilla de afeitar de seguridad americana GEM Scientific Hojas de afeitar de un solo filoFisher Scientific17989000Para cortar tubos y PDMS. Se requiere 1 hoja.
Perforadora Harris Uni-Core 1.2mm IDSigma-AldrichWHAWB100028 ALDRICHPara perforar entradas/salidas en dispositivos microfluídicos. Se requiere 1.
Cubreobjetos para microscopio 22x60-1.5Fisher Scientific12-544-GPara dispositivo microfluídico. Se requiere 1.
Marco rectangular de aluminio con ventana cuadradaCustomCustomPara soportar el canal microfluídico. Dimensiones exteriores: 3 pulgadas x 1,25 pulgadas.
Dimensiones interiores (parte recortada): 7/8 pulgadas x 7/8 pulgadas
Grosor: ~1/32 pulgadas
Cinta de alambre Fuente de luz listado Tubo tubo de 25

References

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