Artículo de método

La manipulación de epileptiforme Electrocorticograms (ECoGs) y del sueño en ratas y ratones por acupuntura

DOI:

10.3791/54896

⸱

22 de diciembre de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Sports, Health & Leisure, College of Tourism, Leisure and Sports, Aletheia University, Tainan Campus, 2Department of Neurology, Mackay Memorial Hospital and Mackay Medical College, 3Department of Veterinary Medicine, School of Veterinary Medicine, National Taiwan University, 4Graduate Institute of Brain & Mind Sciences, College of Medicine, National Taiwan University, 5Graduate Institute of Acupuncture Science, College of Chinese Medicine, China Medical University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este artículo demuestra el rendimiento de la acupuntura, modelos de epilepsia y el análisis del sueño en roedores. Se describe el procedimiento de acupuntura y la identificación de los puntos de acupuntura. La pilocarpina o pentilenetetrazol (PTZ) se usa para inducir la epilepsia. Para el análisis del sueño se emplean el electrocorticograma (ECoG), el electromiograma (EMG), la temperatura cerebral y los registros de la actividad locomotora.

Resumen

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La antigua literatura china ha documentado que la acupuntura posee efectos terapéuticos eficientes sobre la epilepsia y el insomnio. Sin embargo, hay poca investigación que revele los posibles mecanismos detrás de estos efectos. Para investigar el efecto de la acupuntura sobre la epilepsia y el sueño, es necesario abordar varios problemas. La primera es identificar los puntos de acupuntura, que corresponden entre humanos, ratas y ratones. Además, es necesario determinar la profundidad de inserción de la aguja de acupuntura, el grado de torsión de la aguja en la acupuntura manual con aguja y los parámetros de estimulación para la electroacupuntura (EA). Para evaluar los efectos de la acupuntura sobre la epilepsia y el sueño, se requiere un modelo factible de epilepsia en roedores. Administramos pilocarpina en el núcleo central izquierdo de la amígdala (CeA) para simular la epilepsia del lóbulo temporal focal (TLE) en ratas. La inyección intraperitoneal (IP) de pilocarpina induce epilepsia generalizada y estado epiléptico (EE) en ratas. Cinco inyecciones IP de pentilenetetrazol (PTZ) con un intervalo de un día entre cada inyección induce con éxito la epilepsia generalizada espontánea en ratones. Los registros de electrocorticogramas (ECoGs), electromiogramas (EMG), temperatura cerebral y actividad locomotora se utilizan para el análisis del sueño en ratas, mientras que los ECoGs, EMG y la actividad locomotora se emplean para el análisis del sueño en ratones. Los electrodos ECoG se implantan en las cortezas occipital frontal, parietal y contralateral, y se implanta un termistor sobre la corteza cerebral mediante cirugía estereotáctica. Los electrodos EMG se implantan en los músculos del cuello y un detector de infrarrojos determina la actividad locomotora. Los criterios para categorizar las etapas de vigilancia, incluida la vigilia, el sueño de movimientos oculares rápidos (REM) y el sueño no REM (NREM), se basan en la información de ECoG, EMG, temperatura cerebral y actividad locomotora. Los criterios de clasificación detallados se establecen en el texto.

Introducción

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La epilepsia es un trastorno neurológico común en el que se producen convulsiones recurrentes durante toda la vida de un paciente. La mayoría de las recurrencias epilépticos pueden ser bien controlados por los fármacos antiepilépticos (FAE). Sin embargo, aproximadamente 30% de los pacientes epilépticos desarrollar epilepsia refractaria 1. causas de la epilepsia, trastornos del sueño, que pueden exacerbar aún más la recurrencia. La evidencia demuestra que la epilepsia puede perturbar el sueño, ya sea por la noche o puede causar excesiva somnolencia durante el día 2,3. Nuestros estudios previos indican además que la epilepsia se produce en el momento zeitgeber (ZT) 0, es decir, el inicio del período de luz a la luz: oscuridad ciclo, disminuye el sueño; este es mediada por la hormona liberadora de corticotropina (CRH), un factor homeostático. Epilepsia en ZT13 (el comienzo del periodo de oscuridad) aumenta la expresión de otro factor homeostático, la interleucina-1 (IL-1), lo que aumenta el sueño. Sueño ritmos circadianos se alteran cuando la epilepsia se produce en ZT6, el medio de laperíodo de luz 4,5. Por otra parte, los problemas de sueño exacerbar aún más la progresión y recurrencia de la epilepsia 6. Sobre la base de la evidencia mencionada, tratamos de revelar un método terapéutico óptimo para controlar simultáneamente la epilepsia y prevenir las alteraciones del sueño en pacientes con epilepsia. Hemos encontrado previamente que la electroacupuntura (EA) con una frecuencia de estimulación de 10 Hz, en el que se suministra una cierta cantidad de corriente en el punto de acupuntura través de una aguja de acero inoxidable, suprime con éxito electrocorticograma (ECoG) actividades de epilepsia y trastornos del sueño epilepsia inducida 7 . EA con una frecuencia de estimulación de 100 Hz se deteriora aún más las actividades de epilepsia y trastornos del sueño en ratas 8,9. Este experimento exitoso depende de tres factores: en primer lugar, un modelo animal de epilepsia factible; en segundo lugar, un método para la grabación de sueño y el análisis en roedores; y en tercer lugar, el funcionamiento exacto de la acupuntura y la precisión del punto de acupuntura Locations.

La epilepsia se ha clasificado en dos tipos principales: la epilepsia focal y epilepsia generalizada. Estamos interesados ​​en la epilepsia focal del lóbulo temporal (TLE), la epilepsia generalizada, estado epiléptico (SE), y la recurrencia de la epilepsia generalizada espontánea. Por lo tanto, diferentes manipulaciones se aplican para crear modelos de epilepsia adecuados para nuestros experimentos. Para establecer TLE focal, una dosis baja de pilocarpina se administra en el núcleo central de la amígdala izquierda (CEA). Para verificar este modelo, seis electrodos ECoG se implantan en el frontal (F1 y F2), parietal (P1 y P2), y occipital (O1 y O2) lóbulos en ambos hemisferios izquierdo y derecho, y otros dos electrodos de referencia (R1 y R2) se coloca sobre el cerebelo en ambos hemisferios. Una guía microinyección cánula adicional se implanta quirúrgicamente en el izquierdo CEA (AP, 2,8 mm de bregma; ml, 4,2 mm; DV, 7,8 mm con respecto al bregma). Las coordenadas son una adaptación de la Paxinos y Watlas rata atson 10. Si el TLE focal se induce con éxito, sólo la grabación desde el electrodo sobre la corteza parietal izquierda (P1), que está cerca del CEA izquierda, debería adquirir las ECoGs epileptiformes dominantes, sin ECoGs epileptiformes significativos registrados a partir de los otros electrodos ECoG. Intraperitoneal (ip) del pilocarpina en ratas inducen epilepsia generalizada y SE, pero esto puede ser fatal. Cinco inyecciones IP de pentilentetrazol (PTZ) con un intervalo de un día entre cada inyección inducen con éxito la epilepsia generalizada espontánea en ratones y también asegurar la supervivencia de los ratones. Dos electrodos ECoG alambre se implantan en la corteza frontal y parietal en los ratones para recibir señales de ECoG y para verificar la epilepsia de manera espontánea recurrente.

La polisomnografía (PSG) es un método integral para registrar los cambios fisiológicos que se producen durante el sueño, y se puede clasificar de manera objetiva el sueño en diferentes etapas del movimiento no rápido de los ojos (NREM) yrAPID movimiento de los ojos (REM) del sueño. PSG registra los parámetros de las funciones del cuerpo, incluyendo las ondas cerebrales (electroencefalograma, EEG), los movimientos oculares (electrooculogram, EOG), tonos de músculo esquelético (electromiograma, EMG), ritmos cardíacos (electrocardiograma, ECG), y los niveles de oxígeno en la sangre y los parámetros respiratorios. En ratas, registramos ECoGs, EMG, la temperatura cortical y la actividad locomotora de clasificar los estados de vigilancia en la vigilia, el sueño NREM y el sueño REM. El análisis del sueño en ratones se llevó a cabo utilizando ECoGs, EMG, y los resultados de la actividad locomotora. Las ratas se implantan quirúrgicamente con tres ECoG tornillo de electrodos en el frontal, parietal, y la corteza cerebelosa contralateral por cirugía estereotáxica. determinación posterior a la adquisición de los estados de vigilancia (vigilia, sueño NREM y sueño REM) se lleva a cabo de acuerdo con los parámetros obtenidos de los ECoGs, EMG, la temperatura del cerebro, y la actividad locomotora. criterios detallados para categorizar el comportamiento del animal en ratas y ratones se describen en tél protocolo.

Ambas ratas y ratones necesitan ser anestesiados con una dosis baja de Zoletil (25 mg / kg), que es la mitad de la dosis de los anestésicos normalmente administrados durante la cirugía estereotáxica, antes de realizar la acupuntura manual o EA. Esta dosis permite que los animales se despiertan de 30 a 35 minutos después de la inyección. Cualquiera de acupuntura manual o EA se lleva a cabo al comienzo del período de oscuridad, con un período constante de tiempo de 30 min, y cada animal se trata consecutivamente durante dos a tres días. Estimular las corrientes de EA son entregados en un punto de acupuntura particular a través de una aguja de acero inoxidable que se inserta en el punto de acupuntura. La corriente de estímulo es un tren de pulsos cuadrados bifásicos, en el que la duración del pulso es de 150 ms y la intensidad de estimulación es 1 mA. Si se utiliza una aguja seca para la acupuntura manual, la aguja insertada en los puntos de acupuntura se retorció 10 veces cada 5 min. La parte difícil de la acupuntura manual o EA es localizar los puntos de acupuntura en los roedores. el locación de los puntos de acupuntura en ratas o ratones es similar a su localización anatómica en los seres humanos. Por ejemplo, los puntos de acupuntura bilaterales Fengchi se encuentran 3 mm de distancia de la línea media posterior sobre el cuello, entre las dos orejas, que es similar a su localización anatómica en humanos 11. Por otra parte, los puntos de acupuntura con baja impedancia en la piel se pueden confirmar aún más. acupuntura o EA farsa manipulación simulada es necesario que la acupuntura o experimentos de EA. La acupuntura simulada o EA farsa deben llevarse a cabo en un punto de acupuntura no se encuentra cerca del punto de acupuntura, por ejemplo, cerca de la axila 12.

Para investigar con éxito los efectos de la acupuntura o la EA sobre la epilepsia y los trastornos del sueño epilepsia inducida, los siguientes factores deben estar en su lugar: un posible modelo de epilepsia animal, el análisis preciso de ECoGs epileptiformes y la recurrencia de la epilepsia, un método para clasificar los estados de vigilancia y el funcionamiento exacto de la acupuntura o la EA en los roedores.

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Protocolo

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Todos los protocolos experimentales son aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad Nacional de Taiwán.

1. Cirugía estereotáxica para la implantación de electrodos ECoG, EMG electrodos, Brain termistor, y la Guía de inyección cánula

  1. Para las ratas (250-350 g, de 6 a 8 semanas de edad, las ratas Sprague-Dawley)
    1. Anestesiar las ratas por inyección ip con 50 mg / kg Zoletil. Confirmar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta después de pellizcar la pata trasera. Aplicar ungüento para los ojos, afeite la piel, y esterilizar la piel con una solución de povidona-yodo y 75% de etanol. Inyectar un antibiótico (penicilina G) para prevenir la infección.
    2. Preparar escalpelos, tijeras, pinzas, gasas, y la máquina de cauterio para la cirugía. Esterilizar engranaje quirúrgico y gasas por un autoclave y la cauterización por 75% de etanol.
    3. Coloque una barra de oído en el canal auditivo y montar la rata a la estereotaxia.
    4. Utilizandoun bisturí, crea un aproximado de 2 cm incisión en el cráneo a lo largo de una línea entre dos de las orejas, moviéndose en sentido caudal. Cortar las aletas de la piel con pinzas hemostáticas para exponer el cráneo y extraer el tejido sobre el cráneo con un bisturí.
    5. Perforar ocho orificios (F1, F2, P1, P2, O1, O2, R1, y R2), cada una de aproximadamente 0,7 mm de diámetro, sobre el cráneo con una herramienta rotativa. Tornillo de ocho electrodos ECoG sobre el frontal, parietal, occipital y los lóbulos y el cerebelo, tanto en los hemisferios derecho e izquierdo. Estos electrodos se utilizan para la detección de la epilepsia focal.
      1. Utilice las siguientes coordenadas para los electrodos de registro: frontal (F1 y F2): 2,0 mm anterior al bregma y 2,5 mm de la línea media, parietal (P1 y P2): -2.0 mm anterior al bregma y 3,0 mm de la línea media y occipital (O1 y O2): -5.5 mm anterior al bregma y 3,0 mm de la línea media.
      2. Coloque dos electrodos de referencia (R1 y R2) en el cerebelo (-11,0 mm anterior al bregma y 4,0 mm de la midlinordeste).
    6. En unos grupos separados de ratas, haga tres agujeros y el lugar dos electrodos de EEG de tornillo sobre el frontal derecho (F2) y lóbulos parietales (P2) de las cortezas con las mismas coordenadas, como se describe en el paso 1.1.5.1. Colocar un tercer electrodo EEG sobre el cerebelo izquierdo (R1), que sirve para conectar a tierra el animal y reducir los artefactos de señal. Estos electrodos se utilizan para confirmar epilepsia generalizada y el análisis de las etapas de vigilancia.
    7. Se separa la piel del cuello y los músculos e inserte dos electrodos de EMG en el músculo del cuello.
    8. Perforar otro agujero en el cráneo y colocar una cánula guía microinyección en la izquierda CEA (AP, 2,8 mm del bregma; ML, 4,2 mm; DV, 7,8 mm con respecto al bregma) en ratas. Las coordenadas son una adaptación de la rata atlas de Paxinos y Watson 10.
    9. Perforar un agujero más grande (con un diámetro de 1,6 mm) en el cráneo e insertar un calibrado termistor 30 kV en la superficie de la corteza parietal, que se consolidó después, a monitor la temperatura cortical en ratas.
    10. Utilice una gasa y cauterio para detener el sangrado cuando se produzca.
    11. Pase los cables con aislamiento de los electrodos ECoG y electrodos EMG a un pedestal y conectar el termistor a la correa de sujeción. Cimentar el pedestal y guiar la cánula al cráneo con acrílico dental.
    12. El tratamiento de la incisión por vía tópica con polisporina (bacitracina de zinc / sulfato de polimixina B) para prevenir la infección. Dar a los animales tanto el ibuprofeno y la penicilina G en el agua durante una semana después de la cirugía.
  2. Para los ratones (20 - 30 g, de 6 a 8 semanas de edad, ratones C57BL / C)
    1. Anestesiar a los ratones por inyección IP con 50 mg / kg Zoletil y confirmar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la observación de una falta de respuesta después de pellizcar la pata trasera. Aplicar ungüento para los ojos. Después de afeitar el pelo, esterilizar la piel con una solución de povidona-yodo y 75% de etanol. Inyectar un antibiótico (penicilina G) para prevenir la infección.
    2. Coloque una barra de oído en el canal auditivo ymontar el ratón a la estereotaxia.
    3. El uso de un bisturí, hacer un aproximado de 1.5 cm incisión en el cráneo a lo largo de una línea entre los dos oídos, moviéndose en sentido caudal. Clip los colgajos de piel con pinzas hemostáticas para exponer el cráneo y eliminar el tejido sobre el cráneo con un bisturí.
    4. Meter dos agujeros en el cráneo con tijeras quirúrgicas y colocar dos electrodos ECoG alambre en el lóbulo frontal derecho (F2: +2,0 mm a bregma y 1,5 a la línea media) y el lóbulo parietal izquierdo (P1: -3,0 mm y -2,5 a bregma mm de la línea media).
    5. Se separa la piel del cuello y los músculos e inserte dos electrodos de EMG en el músculo del cuello.
    6. Conecte los cables con aislamiento de los electrodos ECoG alambres y electrodos EMG a los terminales hembra y un conector de 2,54 mm, y luego de cemento en el cráneo con acrílico dental.
    7. El tratamiento de la incisión por vía tópica con polisporina (bacitracina de zinc / sulfato de polimixina B) para prevenir la infección. Dar a los animales tanto el ibuprofeno y la penicilina G en agua durante un week después de la cirugía.
  3. Permitir que todos los animales se recuperen durante siete días antes de la iniciación de los experimentos.
  4. Casa ratas o ratones por separado, en jaulas de grabación individuales, en la sala aislada donde la temperatura se mantiene a 23 ± 1 ° C y la luz: oscuridad (L: D) el ritmo es controlado en un 12: ciclo de 12 h (40 W x 4 tubos de iluminación). Proporcionar alimentos y agua ad libitum.
  5. Conectar el ECoG, EMG, y el termistor a través de una correa de sujeción a los amplificadores de una semana después de la cirugía para iniciar las grabaciones.

2. Establecimiento de TLE Focal Epilepsia, SE, y espontáneamente recurrentes Epilepsia

  1. Para las ratas
    1. Administrar 0,5 l de pilocarpina (2,4 mg / l) en el CEA izquierdo a través de la cánula guía de inyección usando una bomba de microinyección. La velocidad de inyección debe fijarse en 0,2 l / min para inducir TLE focal.
    2. IP inyectar 300 mg / kg de pilocarpina para inducir epi generalizadaLepsy con recurrentes SE.
  2. Para los ratones
    1. IP administrar PTZ (0,035 mg / g de peso corporal del ratón) en un punto ZT particular, cada dos días. Cinco inyecciones consecutivas harán que el desarrollo de la epilepsia generalizada de forma espontánea y de forma recurrente.
  3. Por tanto en ratas y ratones
    1. Amplificar las señales de ECoG por 5.000 y el filtro de paso de banda de las analógicas entre 0,1 y 40 Hz.
    2. Utilice una placa A / D conversión A para convertir las señales analógicas ECoGs en señales digitales con una tasa de muestreo de 128 Hz.
    3. Utilice un software para la puntuación visual y analizar la aparición y la duración de la epilepsia. Medir la escala de tiempo con el fin de representar la duración.
    4. Definir ECoG epilepsia por la aparición de puntas epilépticas con amplitudes mayores de 2 mV y con una duración de más de 30 s 13.

3. Clasificación de Vigilancia Unidos

  1. Para las ratas
    1. Determinar los estados de vigilancia mediante el uso de los parámetros adquiridos de ECoGs, EMG, temperaturas del cerebro, y la locomoción a menos de 12 s episodio de grabación. Conectar el ECoG, EMG, y el termistor a través de una correa de sujeción a los amplificadores de una semana después de la cirugía para comenzar la grabación. Puntuación de los estados con un software hecho a medida de acuerdo a los pasos 3.1.5 - 3.1.7.
    2. Medir la actividad locomotriz utilizando un detector de movimiento por infrarrojos, integrar las señales de cada 1 s, y almacenar las señales.
    3. Medir la temperatura cortical y almacenar las señales.
    4. Clasificar los estados de vigilancia de acuerdo con nuestros criterios previamente definidos 14.
    5. Puntuación vigilia mediante el uso de las siguientes características: ECoGs de pequeña amplitud con espectros de alta frecuencia, mayor potencia delta (0,5 - 4,0 Hz), y menor consumo de energía theta (6,0 - 9,0 Hz); la actividad locomotora dominante; alta actividad EMG; y aumentando gradualmente la temperatura cortical.
    6. Puntuación sueño NREM mediante el uso de la followincaracterísticas: g-ondas delta ECoGs dominantes con grandes amplitudes, se redujo la actividad EMG, la reducción de la temperatura cortical, y ninguna actividad locomotora.
    7. Puntuación sueño REM mediante el uso de las siguientes características: disminución de la amplitud de ECoGs con la frecuencia dominante theta, de repente aumento de la temperatura cortical, la actividad EMG mínima y baja actividad locomotriz con contracciones nerviosas del cuerpo.
  2. Para los ratones
    1. Repetir la clasificación de los estados de vigilancia en los ratones como llevó a cabo en las ratas, excepto que no hay temperatura cortical grabado desde el termistor.

4. Rendimiento de la acupuntura manual y EA en ratas

  1. La rata es anestesiada para el protocolo de EA.
  2. Busque el punto de acupuntura por la anatomía y confirme la baja impedancia de la piel en el punto de acupuntura. La luz parpadea cuando se detecta la baja impedancia de la piel. Nota: los puntos de acupuntura Fengchi se encuentran a 3 mm de la línea media posterior seainterpolar las dos orejas, en el cuello.
  3. Insertar agujas de acero inoxidable en los puntos de acupuntura en una profundidad de 2 mm.
  4. Twitch las agujas insertadas 10 veces cada 5 min.
  5. El uso de un estimulador eléctrico funcional, entregar un tren de pulsos bifásicos (150-mu s de duración cada una) con una intensidad de 1 mA a los puntos de acupuntura a través de la aguja.
  6. Realizar una acupuntura falsa o simulada EA como control.

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Resultados

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Existen diferentes modelos de rata y ratón para satisfacer las necesidades de los diferentes tipos de epilepsia. Para inducir la TLE focal, 0,5 l de pilocarpina se administra (2,4 mg / l) en el CEA izquierda. Los ECoGs epileptiformes predominantes se adquieren desde el electrodo de ECoG en el lóbulo parietal del hemisferio izquierdo (Figura 1A: b) se recogen, y las actividades epilépticos raras desde el resto de los electrodos ECoG (Figura 1A: a,...

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Discusión

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La elección de un modelo animal de epilepsia viable es esencial para cada propósito experimental. Uno de nuestros objetivos es dilucidar los efectos de la EA en la supresión de la epilepsia. EA es una medicina alternativa que puede exhibir efecto terapéutico en la epilepsia y ha sido documentado en la literatura china antigua. Sin embargo, hay una falta de evidencia científica para demostrarlo. Para determinar los efectos de la EA en la epilepsia, nos hemos centrado principalmente en los efectos de la EA en la epilepsia...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST) MOST104-2410-H-002-053 y NSC99-2320-B-002-026-MY3. Este manuscrito fue editado y corregido por el Sr. Brian Chang, quien tiene experiencia en la revisión de documentos profesionales.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Fármacos
ZoletilVirbac50 mg/kg i.p.
pilocarpinaSigma-AldrichP6503300 mg/kg i.p.; 1,2 mg microinyección
PTZ Sigma-AldrichP65000,035 mg/
polisporinade ratón Pfizer
Surgery
ECoGelectrodo Plásticos Unelectrodo de tornilloE363/20
PedestalPlastics OneMS363
CanulaPlastics OneC315G/spc
ThermistorOmega Engineering44008
Acrílico dentalTempron
Stereotaxic InstrumentStoeltingDural
Recording equipments
ECoG amplificadorColbourn InstrumentsV75-01
A/D BoardNational InstrumentsNI PCI-6033E
Detectores de movimiento basados en infrarrojosBiobserve GmbHhecho
ICELUSG-System
AxoScope 10 SoftwareMolecular Devices
Acupuntura necesidades
Agujas de acero inoxidableShanghai Yanglong Medical Articles Co.Calibre 32 x 1"
Funciones Estimulador eléctricoI.T.O., JapanTrio 300
AcuPenLhasa OMSPointer Excel II
para ratas armsa medida

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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