Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

Micro-neutralización (MN) ensayos se utilizan en virología para la cuantificación de anticuerpos neutralizantes y de las actividades antivirales. Como una alternativa de inhibición de la hemaglutinación (HI), ensayos de MN pueden superar los efectos no antigénicos influenciados por los cambios de afinidad de unión al receptor en los virus de influenza, que puede complicar la interpretación de los resultados de HI ^1,2,3. Hasta hace poco, la mayoría de los ensayos de MN se basaron en los efectos citopáticos (CPE) o ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) ^4,5. MN ensayos basados en la reducción de enfoque y la placa se desarrollaron en 1990 ^6,7,8. ensayos de reducción de placas se basan en el recuento de placas visibles para cuantificar la infectividad. Sin embargo, los conteos visuales sólo cubren grandes placas que son resolubles por los ojos humanos, a pesar de que la mayoría de las placas son pequeños e invisibles para muchos virus circulantes actuales. Esta cobertura incompleta puede causar una variación significativa entre los examinadores y entre experimentos, lo que lleva a incomparable resultados. También es imposible utilizar el método cuando algunos virus muestran infección abortiva de células individuales o muy pequeñas placas.

La resolución de contaje pobre se puede mejorar mediante la introducción de un protocolo basado en formación de imágenes. Con los avances en la tecnología, microscopía óptica y de alto rendimiento de los lectores de placas bien pueden proporcionar medios precisos para contar las células infectadas ^9. Bajo el microscopio trans-iluminación, las células infectadas etiquetados con ciertos marcadores pueden ser visualizados por su absorción o fluorescencia contraste en la resolución subcelular. Una muestra puede ser analizada en una pantalla de ordenador.

Desafortunadamente, debido a la limitación en el campo de vista, se requieren más de un centenar de imágenes en mosaico para cubrir un solo pozo. El análisis de una placa con 96 pozos requeriría la formación de imágenes y procesamiento de cerca de diez mil imágenes. Tal proceso laborioso es largo y costoso, y la resolución obtenida es en génerosl innecesario para la caracterización de rutina de infecciones virales. Laboratorios con un presupuesto limitado pueden encontrar que el enfoque en torno a un escáner de superficie plana ofrece una alternativa de alto rendimiento rentable.

En este trabajo se describe un ensayo de reducción de placas MN mejorado que es adecuado para la caracterización antigénica de un gran número de virus y para medir cuantitativamente las actividades antivirales y anticuerpos de neutralización. El ensayo tiene varias ventajas: en primer lugar, es un ensayo basado en formación de imágenes que es capaz de medir las infecciones de virus en el nivel celular, independientemente del tamaño de la placa. Contando la población total de células infectadas (ICP) dentro de un bien aumenta en gran medida la sensibilidad de detección, por lo que es posible caracterizar el virus con baja infectividad. En segundo lugar, una valoración cuantitativa más precisa se introduce antes de la neutralización para determinar la cantidad de virus de entrada. El virus de entrada cuantitativa reduce significativamente la variación entre los diferentes experimentos y hace que los resultados sean más comparables entre los laboratorios. En tercer lugar, los títulos de neutralización pueden determinarse directamente mediante el análisis de imágenes, por lo que la cuantificación rápida y fácil de usar. Por último, el protocolo ofrece una alternativa rentable y de alto rendimiento con la resolución y la precisión requerida. La cuantificación se basa en un escáner de superficie plana y software de procesamiento de datos libre. Todo el conjunto tiene un tamaño reducido y se puede implementar en la mayoría de los laboratorios.

El protocolo presentado en este documento consta de cuatro pasos importantes, incluyendo la titulación del virus, la cuantificación de titulación, la neutralización del virus, y la cuantificación de neutralización. Titulación del virus es un experimento de preparación que determina la cantidad de virus de entrada que se utilizará en la neutralización. Durante una titulación, una serie de concentraciones virales se aplican a las monocapas de células en una placa de 96 pocillos. Las células infectadas se cuantifican a continuación en la sección 2. El Dilu viralción que produce el 20% -85% ICP se aplica a su vez como virus de entrada correspondiente a la neutralización de 3. Los títulos de la sección del protocolo de neutralización se cuantifican utilizando la sección 4. Los experimentos que siguieron los protocolos anteriores se presentan en los resultados representativos. El ensayo ha sido probado a fondo durante los últimos dos años con la mayoría de los virus de la gripe que circulan corrientes, tales como A pdm09 (H1N1), A (H3N2), virus A y B. Los resultados de la caracterización virus de la gripe se incluyeron en los informes para la reunión de consulta de la OMS que dio recomendaciones sobre vacunas contra la gripe para su uso en el hemisferio sur en 2016 y en el Hemisferio Norte 2016-2017.

NOTA: El nivel de bioseguridad (BSL) para el siguiente protocolo es BSL 2 para los virus de la gripe estacional y BSL 3+ para los virus de influenza pandémica potenciales. se requiere la titulación viral antes de un experimento de neutralización para decidir la concentración viral del control viral (VC).

Titulación 1. Virus

NOTA: En función del número de virus y el número de duplicados, una placa se puede configurar con los siguientes flexibilidades: (1) La dilución viral puede ser arreglado a lo largo de las filas o las columnas (Figura 1). Cada virus debe ocupar una fila / columna separada. (2) El incremento de la dilución viral es flexible, pero debe comenzar con la más alta concentración viral en la esquina superior izquierda. (3) No hay ninguna restricción sobre el número de duplicados.

NOTA: Madin Darby de riñón canino (MDCK) y MDCK-SIAT1 células (SIAT) fueron amablemente proporcionados por el Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germuchos ^10. células SIAT son células MDCK transfectadas de forma estable con el CMP-N-acetilneuraminato humano: gen de la ß-galactósido α-2,6-sialiltransferasa para una mayor expresión de ácido siálico (SA) oligosacáridos α2-6Gal terminados en.

1. Células alícuotas suficientes MDCK o células MDCK-SIAT ⁸ en placas de 96 pocillos (200 l / pocillo). Se incuban las células a 37 ° C con 5% de _CO2 durante 2 o 3 días para llegar a la confluencia. Propagar las células en DMEM suplementado con suero inactivado por calor al 10% de ternera fetal (FCS) y antibióticos (100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina). Se incuban las células SIAT a 37 ° C con 5% de CO ₂ y 1 mg / ml de sulfato de G418.
   NOTA: El factor de dilución depende de la experiencia y la línea celular utilizada. La monocapa de células debe ser confluente (es decir, no de la pared celular o en un esquema visible para las células MDCK y una disposición apretada-para las células MDCK-SIAT1) en el momento de la inoculación del virus. Ejemplos de diluciones basan enla subcultura de matraces confluentes de células MDCK o MDCK-SIAT1 se dan en la Tabla 1.
2. Lavar las células 3 veces con 200 l de medio de crecimiento del virus (VGM) por pocillo. Esterilizar el lavador de placas de paredes múltiples con 70% de EtOH durante 30 minutos, y luego enjuague en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) o VGM antes del lavado.
3. Aspirar el VGM y añadir inmediatamente 50 l de VGM a cada pocillo.
4. Añadir 900 l de VGM a cada uno de 6 tubos estériles (o menos, dependiendo del número de los virus de prueba y los duplicados). Pipetear 100 l de virus en el primer tubo, mezclar bien y diluir en serie, cambiando la punta entre cada dilución. Repita este procedimiento para cada virus a titular.
   NOTA: Esto le dará a diluciones de virus de 10 ^-1 a 10 ^-6.
5. Añadir 50 l de cada dilución de virus, a partir de la dilución más alta (1 x 10 ^-5 en la Figura 1), a los pocillos duplicados (columnas 9 y 10 en la figura 1) de un 9placa de 6 pocillos.
6. Coloque la placa a 37 ° C durante 2-3 horas para permitir que el virus infecte a las células.
   NOTA: una incubación de 2 a 3 horas es necesario para asegurar que los virus en el inóculo tienen tiempo suficiente para llegar a la monocapa.
7. Preparar la superposición (10 ml / placa)
   NOTA: La superposición consiste en 5 ml de DMEM 2x, tripsina (2 mg / ml de concentración final), 20 l de 1 mg / ml, social y 5 ml de borra de algodón de celulosa (véase la Lista de Materiales).
8. Retire el inóculo.
9. Añadir la superposición (200 l a cada pocillo). Incubar toda la noche a 37 ° C, sin ser molestado.
   NOTA: La gemación de virus se lleva a cabo después de aproximadamente 4 horas, lo que es importante que la placa no se altera después de este tiempo.
10. Aspirar la superposición de los pozos.
11. Añadir enfriado en hielo 4% de paraformaldehído en PBS A (200 l / pocillo). Colocarlos en 4 ° C durante 30 min o a temperatura ambiente durante 20 min.
    NOTA: PBS-A es el pH natural de solución salina tamponada con fosfato con 10 gof NaCl, 0,25 g de KCl, 1,437 g de Na ₂ HPO _4, 0,25 g de KH ₂ PO _4, y 1 litro de agua destilada (véase la Lista de Materiales).
    NOTA: El paraformaldehído es nocivo si se inhala y puede causar quemaduras si se ingiere. También hay evidencia limitada de un efecto carcinógeno, y puede causar sensibilización tras el contacto con la piel.
12. Aspirar el paraformaldehído y se lavan las placas dos veces con PBS A (200 l / pocillo).
13. Almacenar las placas en PBS A a 4 ° C para su uso futuro, o continuar con los pasos siguientes.
14. Añadir tampón de permeabilización (100 l / pocillo). Dejarlo a temperatura ambiente durante 30 min.
15. Lavar la placa dos veces con PBS A (200 l / pocillo).
16. Añadir 50 l de la primera anticuerpo, MAb de ratón contra la gripe de tipo A (1: 1000 en tampón ELISA), por pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora (o 4 ° C durante la noche), con agitación.
17. Lavar 3 veces en 100 l de tampón de lavado (0,05% de Tween 80 en PBS A, v / v) per bien. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min entre lavados. Como alternativa, se lava 3 veces sin incubación usando 300 l por pocillo.
18. Añadir 50 l de la segunda anticuerpo, anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (H + L) conjugado con HRP (1: 1000 en tampón ELISA), por pocillo. Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora, con agitación.
19. Lavar 3 veces como se describe en el paso 1.17.
20. Añadir el sustrato (50 l / pocillo). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min o hasta que el desarrollo de un color azul es claramente visible.
21. Para detener la reacción, se lava la placa dos veces con 200 l de agua destilada por pocillo, incubando a temperatura ambiente durante 2 -3 min entre los lavados.
22. El aire seco de la placa y la almacena en un lugar oscuro (por ejemplo, envolver en papel de aluminio).

2. Cuantificación de titulación

1. Colocar una placa en la zona de exploración de un escáner de superficie plana, como se muestra en la Figura 2a. Utilice el límite de posición en forma de L deasegurar una ubicación óptima y repetible de imágenes.
   NOTA: Es posible imagen de dos placas de pocillos en una exploración.
2. Escanear una imagen.
   NOTA: Los ajustes se muestran en la Tabla 2.
3. Ejecutar el software "Wellplate Reader" para calcular la concentración de virus requerida (Figura 3).
   1. Haga clic en el botón "Cargar imagen" para cargar una imagen. Deslice la barra roja en el histograma de la pestaña "Umbral Global" para ajustar el umbral de muestreo. Haga clic en el botón "Actualizar" para examinar el efecto en la imagen.
   2. Marque la casilla "Calcular Neutralización / Titulación". Haga clic en el botón de "muestreo" para cuantificar el ICP. Haga clic en el botón "Guardar" para guardar los resultados del muestreo cuando se le solicite.
      NOTA: Después de que el proceso de muestreo, una nueva ventana llamada "Neutralización y volumetría de cálculo" aparece automáticamente si la casilla "Calcular Neutralización / Titulación" está marcada.
   3. La carga o la entrada de la definición del mapa de placa de pocillos. Indicar el umbral (por ejemplo, 30%) en "Titulación: población de virus óptima (%)". Seleccione la pestaña "Proceso de Titulación" para calcular los resultados de la titulación. Compruebe los resultados de la titulación. Haga clic en el botón "Guardar y Cerrar" para guardar los resultados de la titulación.
      NOTA: Consulte la S1 para la instrucción más detallada sobre el software. Una copia del software a medida, disponible bajo petición.
      NOTA: Por lo general, la dilución de virus para mejor el rendimiento del ensayo de reducción de placa alrededor de un 50% (20-85%) ICP del total de células dentro de cada pocillo ^11.

La neutralización 3. Virus

NOTA: Calcular el número de placas necesarias para el ensayo de neutralización. Cada placa puede acomodar un virus y un número de antisueros.

NOTA: En función del número de antisueros y el número de duplicados, una placa se puede configurar con la famie siguiente flexibilidades: (1) La dilución de suero se pueden disponer a lo largo de la fila o la columna (Figura 4). Cada suero debe ocupar una fila o columna separada. (2) El incremento de la dilución del suero es flexible, pero debe comenzar con la concentración más alta de suero en la esquina superior izquierda de una placa. (3) El número de duplicados equilibra el número de antisueros. Más duplicados pueden ayudar a suavizar las variaciones experimentales. (4) El número de la VC y el número del control celular (CC) duplicados son flexibles, pero también deben estar en filas o columnas separadas. Se espera que el número de duplicados VC es significativamente mayor que la de los antisueros.

1. Preparar la monocapa de células, como en los pasos 1.1-1.3, 2 o 3 días de antelación.
2. Añadir 50 l de VGM a cada pocillo de la placa.
3. Utilice las columnas 11 y 12 para VC y CC, respectivamente. Añadir 50 l de alícuotas de 01:20 enzima destructora del receptor (RDE) de suero tratado con a la primera fila (A) de Columns 1-10.
   NOTA: Para cada combinación de virus y el suero, el ensayo se realizó por duplicado, por lo que una placa puede, por ejemplo, contener probado un virus contra cinco antisueros.
4. Realizar 2 veces diluciones seriadas mediante la transferencia de 50 l de la fila A a la fila H (columnas 1-10 en la figura 4) y descartando 50 l de la fila H.
5. Añadir 50 l de diluyente a cada pocillo de la columna de la CC (columna 12 en la Figura 4).
6. Añadir 50 l de virus a cada pocillo de la placa, a excepción de la columna de la CC (columnas 1-11, filas AH en la Figura 4).
7. Incubar a 37 ° C durante 2-3 horas. Retire el inóculo. Añadir la superposición (200 l) a cada pocillo. Incubar durante la noche a 37 ° C, sin ser molestado. Fijar y teñir las placas en cuanto a la titulación del virus (pasos 1.11 a 1.22).

4. Neutralización Cuantificación

1. Colocar una placa en la zona de exploración de un escáner de superficie plana, como se muestra en la Figure 2a. Utilice el límite de posición en forma de L para asegurar una ubicación óptima de imagen y repetible.
   NOTA: Es posible imagen de dos placas de pocillos en una exploración.
2. Analiza la placa, como se describe en el paso 2.2.
3. Ejecutar el software "Wellplate Reader" para calcular los títulos virales requeridos (figura 3, paso 2.3).
   1. Haga clic en el botón "Cargar imagen" para cargar una imagen. Deslice la barra roja en "Umbral Global" para ajustar el umbral de muestreo. Haga clic en el botón "Actualizar" para examinar el efecto.
   2. Marque la casilla "Calcular Neutralización / Titulación". Haga clic en el botón de "muestreo" para cuantificar el ICP. Haga clic en el botón "Guardar" para guardar los resultados del muestreo cuando se le solicite.
      NOTA: Después de que el proceso de muestreo, una nueva ventana llamada "Neutralización y volumetría de cálculo" aparece automáticamente si la casilla "Calcular Neutralización / Titulación" está marcada.
   3. De carga o la entrada al pozo-pmapa tarde. Indicar el umbral (por ejemplo, 50%) en "Neutralización: Deducción Infección (%)".
   4. Seleccione "proceso de neutralización" para el cálculo de los títulos. Compruebe los títulos y haga clic en el botón "Guardar y Cerrar" para guardar los resultados de neutralización.
      NOTA: La neutralización se expresa como el recíproco de la dilución más alta del suero con la predefinido reducción ICP (tal como 50% o 80%) en contra de la VC (la media de la columna 11 en la Figura 4). Una reducción ICP 50% se utilizó en los resultados representativos.

Siguiendo los procedimientos anteriores, se presentan algunos resultados de los últimos experimentos de caracterización antigénica. La configuración de valoración se diseñó para examinar ocho virus de entrada, con duplicados dobles para cada dilución. Las diluciones virales fueron probados entre 1,0 x 10 -1 y 1,0 x 1,0 -6 para cubrir las variaciones entre los virus. Los virus de ensayo fueron del subtipo H3N2, incluyendo A / Camerún / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Moscow / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 / A / Moscow / 101 / 2015, A / Moscow / 100/2015, A / Moscow / 133/2015, y A / Bratislava / 437/2015. Los resultados de la valoración se ilustran en la Figura 5. La figura 5d demuestra la disminución de la ICP con el aumento de la dilución de virus. Las curvas se normalizaron contra los ICP de los mismos virus que produjeron infecciones en todas las células dentro de un pozo 12 (que se define como la saturación de ICP). Si el ICP no alcanzó la saturación con la hiGhest concentración de virus, se utilizó la media de ICP correspondientes duplicados en lugar (A / Moscow / 103/2015 en la Figura 5d). Las diluciones de virus que producen 30% de la saturación de ICP fueron elegidos como la dilución de virus de entrada para la neutralización (Tabla 3).

La neutralización del virus destinado a tener una entrada contra cinco antisueros, con duplicados dobles en cada placa. El virus H3N2 de referencia mostrado es A / Estocolmo / 63 / año 2015. Los cinco antisueros son A / HK 4801/14 F12 huevo / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sudáfrica r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9715923/13 SIAT NIBF F18 / 15, y A / 525/14 SIAT holandés F23 / 15. Los resultados de neutralización se ilustran en la Figura 6. La figura 6d muestra el progreso de la infección con el aumento de la dilución de suero. La población positiva normalizada en el eje vertical representa la proporción de ICP de la respuesta correspondiente antisueros frente a la media ICPdel virus de referencia 12. El ICP fondo de los controles de células no infectadas se restó durante la normalización. Los títulos de neutralización se determinaron como los recíprocos de las diluciones de antisuero correspondientes a la reducción de ICP% 50 (Tabla 4). La interpolación lineal se utilizó para estimar los títulos que caen entre dos diluciones de suero adyacentes.

Figura 1: Ejemplo de una configuración de placa de pocillos en un experimento de titulación del virus. virus de prueba se asignan a las filas separadas (A a H). Columnas están diseñados para diferentes diluciones virales (1 a 12). Dos columnas se utilizaron como duplicados para cada dilución viral. Barra de escala = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama de escritorio del software de cuantificación "Wellplate Reader". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Resultados de un experimento de valoración. (A) La configuración de placa de pocillos, (b) escanea bien la placa radiográfica, (c) la ilustraciónde la, se cuantificó, población celular infectado con virus de color codificada, y (d) normalizados poblaciones de células infectadas por virus contra diluciones de virus. 30% ICP se utilizó como umbral. Las barras de error en (d) son desviaciones estándar (DE) de las duplicaciones de la muestra (± 1 SD). Las barras de escala en (b) y (c) = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Resultados de un experimento de neutralización. (A) La configuración de placa de pocillos, (b) bien la placa radiográfica, (c) la ilustración de la, población de células infectados con virus se cuantificó, y (d) la población de células infectadas por virus normalizada frente a la dilución de suero escaneada. La vi de entradarus (VC) es A / Estocolmo / 63 / año 2015. 50% ICP se utilizó para calcular los títulos. Las barras de error en (d) son desviaciones estándar (DE) de las duplicaciones de la muestra (± 1 SD). Las barras de escala en (b) y (c) = 10 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Tabla 1: diluciones típicas en una subcultura de matraces confluentes de células MDCK o MDCK-SIAT1.

Tabla 2: Configuración típica de un escáner de superficie plana.

Tabla 3: diluciones virales calculados a partir de una población de 30% ICP.

Tabla 4: Los títulos a 50% de ICP A / Estocolmo / 63/2015 frente a antisueros.

Los autores no tienen nada que revelar.