Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

El desarrollo de origen humano pluripotentes células madre (hiPSCs) protocolos de diferenciación para generar neuronas humanas in vitro ha proporcionado una nueva y poderosa herramienta para el estudio de los trastornos neurológicos. Hasta hace poco, el estudio de estos trastornos se vio gravemente obstaculizada por la falta de sistemas de modelos que utilizan las neuronas humanas. Aunque los roedores pueden ser utilizados para estudiar los trastornos neurológicos, los resultados de estos estudios no se pueden traducir fácilmente a los seres humanos ^1. Dadas estas limitaciones, neuronas derivadas de hiPSC son un modelo alternativa prometedora que puede ser utilizado para elucidar los mecanismos moleculares subyacentes y trastornos neurológicos para la detección de drogas in vitro.

En la última década, varios protocolos para convertir hiPSCs en neuronas han sido desarrollados ^2-8. Sin embargo, estos protocolos son todavía limitados en muchos sentidos. En primer lugar, los protocolos son a menudo mucho tiempo: la generación de neuronas con la maduración adecuada (es decir, synapformación se) y la actividad funcional requiere meses de procedimientos de cultivo, lo que hace estudios a gran escala difíciles ^9. Además, la eficiencia de conversión de hiPSC a la neurona es baja. Protocolos a menudo producen una población heterogénea de las neuronas, y por lo tanto no permiten estudios de subconjuntos específicos de células neuronales. Por otra parte, los protocolos no son reproducibles, obteniéndose resultados diferentes para diferentes líneas de IPSC ^10,11. Por último, la etapa de maduración y propiedades funcionales de las neuronas resultantes también son variables ^10.

Para hacer frente a estos problemas, Zhang et al. (2013) ¹² desarrollado un protocolo que genera rápidamente y de manera reproducible neuronas humanas de hiPSCs mediante la sobreexpresión del factor de transcripción neurogenina-2. Según lo informado por los autores, la diferenciación se produce con relativa rapidez (sólo 2 - 3 semanas después de la inducción de la expresión de neurogenina-2), el protocolo es reproducible (propiedades neuronales son independientes de los starting línea hiPSC), y la conversión-hiPSC a la neurona es muy eficiente (casi el 100%). La población de neuronas generadas con su protocolo es homogénea (que se asemeja de capa superior neuronas corticales), lo que permite la investigación de las contribuciones específicas de tipo celular a trastornos neuronales. Además, sus neuronas derivadas de hiPSC exhiben propiedades maduras (por ejemplo, la capacidad de formar sinapsis y actividad funcional sólido) después de sólo 20 d.

La caracterización de las propiedades electrofisiológicas de las neuronas derivadas de hiPSC a nivel de red es un requisito previo importante antes de la tecnología hiPSC puede ser explotado para el estudio de enfermedades humanas. Por esta razón, muchos grupos de investigación han comenzado recientemente a investigar neuronas derivadas de las células madre en el nivel de red utilizando disposición de micro-electrodo (MEA) dispositivos (sistemas multicanal, Reutlingen, Alemania) ^13-16. Los electrodos de un MEA están incrustadas en un sustrato sobre el que se pueden cultivar las células neuronales.MEAs se pueden utilizar para explorar las propiedades electrofisiológicas de las redes neuronales y el desarrollo in vitro de su actividad. En la actualidad, los AMA sólo se utilizan en combinación con protocolos de diferenciación que tardan varios meses para producir redes maduras. Por lo tanto, la combinación de los AMA con un protocolo de diferenciación rápida debe facilitar el uso de esta tecnología en estudios a gran escala de trastornos neurológicos.

A continuación, presentamos una modificación de la Zhang et al. (2013) ^{12 de} protocolo y adaptarlo para su uso en los AMA. En particular, en lugar de confiar en una transducción lentiviral aguda, que en vez creado líneas que expresan de forma estable hiPSC rtTA / Ngn2 antes de inducir la diferenciación. Hicimos esto principalmente para tener un control reproducible sobre la densidad de las células neuronales, ya que la densidad de las células neuronales es crítica para la formación de la red neuronal, y para un buen contacto entre las neuronas y los electrodos de la MEA ^17,18. Although la Zhang et al. protocolo es muy eficiente con respecto a la conversión de hiPSCs transducidas, es inherentemente variable con respecto al rendimiento final de las neuronas a partir del número de hiPSCs plateado inicialmente (véase la Figura 2E en Zhang et al.) ^12. Con una línea estable, eliminamos muchos problemas que causan la variabilidad, como la toxicidad y la eficacia lentiviral infección. A continuación, hemos optimizado los parámetros que producen de forma fiable las redes neuronales derivadas de hiPSC en los AMA, la obtención de la maduración de la red (por ejemplo, eventos sincrónicos que implican la mayoría de los canales) por la tercera semana. Este protocolo rápido y fiable debería permitir comparaciones directas entre las neuronas derivadas de diferentes líneas hiPSC (es decir, específica del paciente), así como proporcionar consistencia sólida para estudios farmacológicos.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices para el cuidado y uso de animales aprobados del Comité de Cuidado de Animales, Radboud University Medical Centre, los Países Bajos, (RU-DEC-2011-021, número de protocolo: 77073).

1. La glía aislamiento de células y Cultura

NOTA: El protocolo que aquí se presenta se basa en el trabajo de McCarthy y de Vellis ^19, y un protocolo detallado muy similar para los astrocitos de ratón está disponible ^20. Para generar cultivos primarios de astrocitos corticales embrionarias a partir de cerebros de ratas (E18), una rata embarazada necesita para ser sacrificado, los embriones deben ser cosechadas desde el útero, y necesitan ser aislado de los embriones de los cerebros. Para llenar un frasco T75, las cortezas de 2 cerebros embrionarios deben combinarse. Como alternativa, los astrocitos purificados y congelados disponibles comercialmente se pueden adquirir.

1. Preparar el matraz de cultivo T75
   1. Diluir poli-D-lisina (PDL) en, Agua ultrapura estéril a una concentración final de 10 mg / ml. Añadir 5 ml de la PDL diluida al matraz de cultivo T75. Poner a girar suavemente para humedecer toda la superficie de crecimiento. Colocar el matraz en un incubador humidificado 37 ° C durante 3 h.
   2. Aspirar el PDL del matraz. Enjuague las 3x matraz con 5 ml de agua estéril para eliminar PDL no unido. Aspirar el agua por completo. Mantener el matraz a secar en una campana de flujo laminar o se utiliza inmediatamente.
2. La disección de las cortezas
   1. Preparar 50 ml de medio de disección: medio L-15 de Lebovitz con 2% (v / v) B-27 suplemento. Mantener en hielo.
   2. Anestesiar la rata profundamente con isoflurano en una cámara de inducción (caja de plexiglás pequeñas) hasta que cesa la respiración (~ 5 - 8 min). Eliminar rata desde la cámara de inducción e inmediatamente sacrificados por dislocación cervical.
   3. Pulverizar el abdomen de la rata con EtOH al 70% y limpie el exceso. Exponer y extraer el útero de la presa a través de la sección de entre cesáreasobre el uso de un par de tijeras ^21.
   4. Cortar los embriones individuales de sus sacos amnióticos con tijeras, transferir a una placa de Petri estéril lleno de medio de disección en frío, y mantener en hielo.
   5. Transferencia de embriones de nuevo a una nueva placa de 6 cm, de Petri estéril lleno de medio de disección en frío. Extraer los cerebros de los embriones bajo un microscopio estereoscópico. Para exponer el cerebro, suavemente retire la piel y el cráneo con unas pinzas. cuchara suavemente todo el cerebro y la transferencia a un plato de Petri de 35 mm con medio de disección fría y fresca.
      NOTA: cerebros completos disecados de embriones se pueden almacenar en un medio de disección en hielo durante muchas horas sin perder la viabilidad celular.
   6. Separar los dos hemisferios del cerebro de cada cortando a través de la línea media con tijeras de primavera de punta fina o un bisturí. pelar con cuidado las meninges con unas pinzas finas con punta recta.
      NOTA: Es muy importante eliminar completamente las meninges. Thes la contaminación de fibroblastos previene de la cultura de los astrocitos. Los fibroblastos son células de división rápida y finalmente desplazar a las otras células.
   7. Retire el cerebro medio / cuerpo estriado y el bulbo olfatorio con tijeras de primavera o un bisturí. También asegúrese de retirar el hipocampo (estructura en forma de C, que es perimedian y caudal con respecto a la corteza) con tijeras de primavera o un bisturí. Recoge los hemisferios corticales en un tubo de centrífuga de 15 ml lleno de medio de disección 5 ml. Mantener en hielo.
3. La disociación de las cortezas
   1. Preparar 2 ml Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} libre ^de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con 0,25% de tripsina (medio de disociación). Preparar 50 ml de alta glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) con 15% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (medio de cultivo) y esterilizar filtro.
   2. Deje el tejido depositan en el fondo del tubo de centrífuga. Con cuidado, comopirata tanto del medio de disección como sea posible desde arriba del tejido. Lavar el tejido con 5 ml ^de Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} libre ^de HBSS (sin tripsina) y permitir que el tejido se asiente en la parte inferior del tubo.
   3. aspirar con cuidado la HBSS. Añadir 2 ml de medio de disociación y con un tirón el tubo suavemente para mezclar la enzima alrededor del tejido. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 5-10 minutos. Flick el tubo un par de veces durante la incubación para agitar el tejido.
   4. Inmediatamente triturar el tejido usando una punta de pipeta de 1.000 l. Ajuste el volumen de pipeta a aproximadamente 800 mL. Aspirar las piezas y salirse con fuerza en el lado del tubo, directamente por encima de la línea de fluido. Sin embargo, tratar de minimizar la formación de espuma o burbujas. Repetir hasta que el tejido está suficientemente disociado, aproximadamente 15 - 20 veces. Añadir 8 ml de medio de cultivo para inactivar la tripsina. mezclar suavemente invirtiendo el tubo varias veces.
   5. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras colocado en la parte superior de un 50 mtubo de centrífuga L. Enjuague el tubo de 15 ml con medio de cultivo y filtrar el medio a través del filtro de células para recoger el medio en el tubo de 50 ml con la suspensión celular. Enjuague el filtro de células de un par de veces con medio de cultivo. Después de aclarar, el volumen final debe ser de unos 20 a 25 ml.
   6. Sedimentar las células a 200 xg durante 10 min. Con cuidado aspirar tanto medio como sea posible, sin tocar el sedimento celular. Resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo utilizando una pipeta l 1000. Añadir 11 ml de medio de cultivo precalentado y mezclar suavemente (para evitar burbujas) usando una pipeta de 10 ml.
   7. Lavar el matraz T75 con recubrimiento de PDL vez con 5 ml de medio de cultivo. Aspirar el medio y transferir la suspensión de células al matraz. Todas las células están en la suspensión se siembran, y nos encontramos por lo general innecesario contarlos, ya que los astrocitos no pueden diferenciarse de otras células en la suspensión. Colocar el matraz en una incubadora humidificada C 37 ° con una atmósfera de 5% de CO ₂ fo dos días.
4. La expansión y mantenimiento de los astrocitos
   1. Reemplazar el medio entero por primera vez 2 d después de la siembra inicial. Reemplazar todo el medio después cada 3 d. Siempre precalentar el medio fresco a 37 ° C antes de añadir a las células.
      NOTA: Los astrocitos requieren 7 - 10 de d hasta alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia (los astrocitos aparecen como una monocapa teselado densamente poblado, con la microglia y oligodendrocitos que está encima y entremezclados).
   2. Cuando los astrocitos alcanzan aproximadamente el 90% de confluencia, agitar el matraz para eliminar las células gliales contaminantes:
      1. Retirar el frasco de la incubadora y apretar el tapón (fenólico) o cubra el puerto (filtrado). Para eliminar la microglía, agitar el matraz sobre una plataforma orbital a 180 rpm durante 1 h. Aspirar el medio. Enjuagar una vez con 5 ml de pre-calentado medio de cultivo, aspirado y reemplazar con 12 ml de medio de cultivo.
      2. Para eliminarlos oligodendrocitos, devuelven el frasco a la plataforma orbital y agitar a 250 rpm, 37 ° C durante un mínimo de 7 horas, pero preferiblemente O / N.
      3. Aspirar el medio. Enjuagar una vez con 5 ml de pre-calentado medio de cultivo, aspirado y reemplazar con 12 ml de medio de cultivo. Devolver el frasco a la incubadora.
      4. Cuando 100% de confluencia, divide los astrocitos utilizando procedimientos estándar en una proporción de 1: 3 a 1: 2 con ácido etilendiaminotetraacético tripsina 0,05% (EDTA). Un matraz T75 en el 100% de confluencia normalmente se producen alrededor de 4,0 x 10 ⁶ células en total. Bajo este esquema, los cultivos por lo general se puede dividir una vez por semana.
         NOTA: Cuando los astrocitos alcanzan la confluencia, se pueden recogen y se utilizan para la diferenciación hiPSC como se describe a continuación en el paso de protocolo 3.4. Los astrocitos se pueden dividir al menos una vez sin una pérdida apreciable de viabilidad. Ellos se pueden mantener durante un máximo de 2 meses en cultivo. Por experiencia, primaria embrionarias día 18 de astrocitos de rata progressively convertido en terminales diferenciadas y / o perder viabilidad después de la división repetida. Aunque es posible congelar los astrocitos para uso futuro, preferimos para aislar los astrocitos a partir de cerebros de embriones frescos cuando sea necesario.

2. Generación de rtTA / Ngn2 -positivo hiPSCs

NOTA: Los hiPSCs utilizados para nuestros experimentos fueron generados internamente por la transducción lentiviral de fibroblastos humanos con la reprogramación factores de cMYC, Sox2, Oct4 y KLF4.

NOTA: Para la generación de rtTA / Ngn2 hiPSCs -positivos, los vectores lentivirales se utilizan para integrar de forma estable los transgenes en el genoma de las hiPSCs. El protocolo para la producción de la lentivirus ha sido publicado previamente ^22. Los detalles de los vectores de empaquetamiento lentivirales que se utilizan para producir las partículas de lentivirus rtTA y Ngn2 se proporcionan en el rtTA es pLVX-EF1α- (Tet-On-Avanzado) -IRES-G418 (R); es decir, este vector codifica una resistencia Tet-On transactivador avanzada bajo el control de un promotor constitutivo y confiere EF1α al antibiótico G418. El vector de transferencia usado para el lentivirus Ngn2 es pLVX- (TRE-thight) - (MOUSE) Ngn2-PGK-puromicina (R); es decir, este vector codifica el gen de la neurogenina-2 murino bajo el control de un promotor controlado-Tet y el gen de resistencia a puromicina bajo el control de un promotor PGK constitutiva. Por lo tanto, mediante el uso de estos dos vectores de transferencia, una línea hiPSC se puede crear para que la expresión de la neurogenina-2 murino puede ser inducida por la suplementación del medio con doxiciclina. Para la transducción de las hiPSCs, se utiliza el sobrenadante con las partículas de lentivirus (referido como "suspensión lentivirus 'en el resto del texto), es decir, el ingeniohout concentrar las partículas usando ultracentrifugación.

1. La placa de las hiPSCs (día 1)
   NOTA: Los volúmenes que se mencionan en este protocolo suponen que los hiPSCs se cultivan en una placa de 6 pocillos y que se recogen las células de un pocillo. Además, se supone que las células se colocan posteriormente en 12 pocillos de una placa de 12 pocillos.
   1. Preparar 10 ml de DMEM frío / F12 con 1% (v / v) Basement membrana Matrix (BMM) para obtener diluido BMM. Añadir 800 l diluidas BMM por pocillo de una placa de 12 pocillos. Incubar durante al menos 1 h en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2. Antes de su uso, se incuba la placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
   2. Caliente 15 ml Medio Esencial 8 (E8) con 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina, 9 ml de DMEM / F12 y solución de 1 ml de células desprendimiento (CDS) a temperatura ambiente. Complementar el medio E8 con proteína asociada a Rho quinasa inhibidor (ROCK).
   3. Aspirar el medio gastado de los hiPSCs unad agregar 1 ml de CDS a las hiPSCs. Incubar 3-5 min en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2. Compruebe bajo el microscopio si las células se separe de los otros.
   4. Añadir 2 ml de DMEM / F12 en el pozo, suspender suavemente las células con una pipeta l 1000 y transferir las células a un tubo de 15 ml. Añadir 7 ml de DMEM / F12 a la suspensión celular. Girar las células a 200 xg durante 5 min.
   5. Aspirar el sobrenadante y añadir 2 ml del medio preparado E8. Obtener una suspensión de células en las que se disocian los hiPSCs (no forman grupos de células) poniendo la punta de una pipeta de 1000 l contra el lado del tubo de 15 ml y resuspendiendo las células suavemente. Compruebe bajo el microscopio si se disocian las células.
   6. Determinar el número de células (células / ml) usando una cámara de hemocitómetro.
      NOTA: Una placa de 6 pocillos así a 80 - 90% de confluencia se suelen producir 3,0 - 4,0 x 10 ⁶ células en total.
   7. AspirarBMM diluido a partir de los pocillos de la placa de 12 pocillos. Diluir las células para obtener una suspensión de células de 3,0 x 10 ⁴ células / ml. Placa 1 ml de la suspensión celular por pocillo de la placa de 12 pocillos. Coloque la placa 12 bien O / N en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2.
2. Transducir las células iPS con rtTA y Ngn2 lentivirus (día 2)
   1. medio de calentamiento 12 ml E8 con 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a temperatura ambiente. Suplemento el medio E8 con inhibidor de rock y polibreno a una concentración final de 8 mg / ml al medio de E8.
   2. Descongelar las alícuotas de la suspensión con lentivirus. Añadir polibreno a una concentración final de 8 mg / ml a la suspensión lentivirus. Aspirar el medio gastado y se añade 1 ml del medio de E8 preparada a cada pocillo.
   3. Realizar la transducción con diferentes cantidades de la rtTA - y suspensiones Ngn2 -lentivirus. Por ejemplo, transduCE El hiPSCs mediante la adición de 100 l de tanto el -lentivirus rtTA y la suspensión -lentivirus Ngn2 a un pocillo de la placa de 12 pocillos. Para los otros pozos, utilizar 200 l, 300 l, 400 ly 500 l de suspensión lentivirus en lugar de 100 mL. Los hiPSCs de dos pocillos de la placa de 12 pocillos no deben ser transducidas; servirán como controles durante la selección.
      Nota: El transducciones se realizan preferiblemente por duplicado, por lo que la eficacia de transducción se puede estimar con mayor precisión después del inicio de la selección (véase el paso protocolo 2.2.4). La cantidad de suspensión de lentivirus que se requiere para transducir eficientemente la mayoría de los hiPSCs depende del título de la suspensión lentivirus y la línea hiPSC que se utiliza. En este estudio, utilizamos generalmente 100 - 500 l de suspensión de lentivirus para la transducción de las hiPSCs.
   4. Coloque la placa de 12 pocillos en un humidificado incubadora a 37 ° con una atmósfera de 5% CO2 de 6 h. Antes del final del periodo de incubación 6 h, cálido medio 12 ml E8 con 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina y 12 tamponada con fosfato salino de Dulbecco ml (DPBS) a RT. Complementar el medio E8 con inhibidor de roca.
   5. Aspirar el medio E8 gastado. Lavar cada pocillo con 1 ml de DPBS. Añadir 1 ml del medio E8 preparada a cada pocillo. Coloque la placa 12 bien O / N en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2.
3. Refrescar el medio E8 (día 3)
   1. medio de calentamiento 12 ml E8 con 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a RT. Aspirar el medio gastado de los pocillos de la placa de 12 pocillos y añadir 1 ml del medio de E8 preparada a cada pocillo. Coloque la placa 12 bien O / N en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2.
4. Cómo hacer la selección con puromicina y G418 (Día 4 - 8)
   NOTA: En función de la tasa de división celular de la caderalínea de SC y la eficiencia de la transducción lentiviral, las células pueden llegar a 70 a 80% de confluencia durante el período de selección, momento en el cual los cultivos se deben dividir. Debido a que el momento de la escisión no se puede predecir de antemano, no se menciona en el protocolo. Sin embargo, en lugar de refrescar el medio E8 complementado con las concentraciones mencionadas de puromicina y G418, se puede dividir la cultura como una cultura hiPSC hiPSC normal (incluyendo placas las células en placas recubiertas de vitronectina). La única excepción es que el medio E8 debe ser complementado con las concentraciones mencionadas de los antibióticos para continuar la selección.
   1. medio de calentamiento 12 ml E8 con 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a temperatura ambiente. Añadir puromicina y G418 para la selección; se añaden diferentes cantidades de los antibióticos durante el período de selección (Tabla 1).
   2. Estimar la eficiencia de la transducción mediante la estimación del porcentaje de G418 y puromicinaLas células resistentes. Para estimar el porcentaje de células resistentes, estimar el porcentaje de células muertas (células no resistentes) para las diferentes condiciones (los cultivos transducidos con las diferentes cantidades de suspensión lentivirus) y para las células nontransduced (las células que sirven como un control de selección). Calcular el porcentaje de células resistentes como [100% - (porcentaje de células muertas)].
      NOTA: Si las transducciones con las diferentes cantidades de suspensión de lentivirus se realizaron por duplicado, la eficacia de transducción se puede estimar con mayor precisión. La condición con las células no transducidas sirve como un control de selección; los porcentajes de células muertas para los cultivos transducidos con las diferentes cantidades de suspensión lentivirus debería ser menor. El porcentaje estimado de células resistentes se utiliza para elegir los hiPSCs que probablemente positivo para ambos transgenes. En general, elegimos los hiPSCs de la condición de transducción fueron> 90% de la células sobreviven el período de selección 5 d.
   3. Aspirar el medio gastado de los hiPSCs y añadir 1 ml del medio de E8 preparado a los pocillos. Coloque la placa 12 bien O / N en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2.

	La concentración final de G418	La concentración final de puromicina
Día 4	250 mg / ml	2 mg / ml
día 5	250 mg / ml	2 mg / ml
día 6	250 mg / ml	1 mg / ml
Día 7	250 mg / ml	1 mg / ml
día 8	250 mg / ml	1 mg / ml

Tabla 1: Concentraciones de Antibióticos durante el período de selección.

5. Detener la selección e iniciar el cultivo regular (día 9 y posterior)
   1. Después de la 5 d período de selección, la cultura de los hiPSCs -positivos rtTA / Ngn2 como hiPSCs normales, con la excepción de que el medio E8 de las células se complementa con G418 a una concentración final de 50 mg / ml y con puromicina a una concentración final de 0,5 g / ml.
      NOTA: Las células pueden ahora ser congeladas (de acuerdo con protocolos estándar para la criopreservación de células) para servir como una copia de seguridad. Este es un paso importante para la reproducibilidad del protocolo de diferenciación, ya que permite el uso del mismo lote de rtTA / Ngn2 hiPSCs -positivos para muchos experimentos futuros de diferenciación.

3. Diferenciación de rtTA / Ngn2 hiPSCs -positivos a las neuronas de 6 pocillosAAM y cubreobjetos de vidrio

NOTA: En este protocolo, se proporcionan los detalles para diferenciar rtTA / Ngn2 hiPSCs -positivos en dos sustratos diferentes, es decir, AMMA 6 pocillos (dispositivos compuestos por 6 pozos independientes con 9 de grabación y 1 de referencia microelectrodos integrados por pocillo) y cubreobjetos de vidrio en los pocillos de una placa de 24 pocillos. Los protocolos, sin embargo, pueden ser fácilmente adaptados para sustratos más grandes (por ejemplo, para los pocillos de placas de 12 ó 6 pocillos), incrementando los valores mencionados de acuerdo con el área de superficie.

1. Preparar los AMA o cubreobjetos de vidrio (día 0 y el día 1)
   1. El día antes del comienzo de la diferenciación, esterilizar los AMA de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
   2. Diluir la proteína de adhesión de poli-L-ornitina (OLP) en agua ultrapura estéril a una concentración final 50 mg / ml. Cubra el área del electrodo activo de los AMA 6 pocillos mediante la colocación de un 100 lla caída de la OLP diluido en cada pocillo. Coloque el cubreobjetos en los pocillos de la placa de 24 pocillos usando pinzas estériles. Añadir 800 l de la OLP diluido en cada pocillo. Prevenir los cubreobjetos flote empujando hacia abajo con la punta de pipeta 1.000 l.
   3. Incubar los AMA de 6 pocillos y 24 pocillos placa de O / N en un humidificado incubadora a 37ºC con una atmósfera de CO2 al _5%. Al día siguiente, aspirar la OLP diluida. Lavar las superficies de vidrio de las MEAs 6 pocillos y los cubreobjetos dos veces con agua ultrapura estéril.
   4. Diluir laminina en DMEM / F12 frío a una concentración final de 20 mg / ml (para los MEAs 6 pocillos) y 10 mg / ml (para los cubreobjetos de vidrio). Inmediatamente recubrir el área del electrodo activo de los MEAs 6 pocillos colocando una gota 100 l en cada pocillo. Del mismo modo, añadir 400 l de la laminina diluido en cada pocillo de la placa de 24 pocillos para recubrir los cubreobjetos. Prevenir los cubreobjetos flote empujando hacia abajo con la punta de pipeta de 1.000 l.
   5. Incubar las MEAs 6 pocillos y placa de 24 pocillos en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO ₂ durante al menos 2 h.
2. La placa de las hiPSCs (día 1)
   NOTA: Los volúmenes que se mencionan en los pasos 3.2.1 - 3.2.4 asumen que los hiPSCs -positivos rtTA / Ngn2 se cultivan en una placa de 6 pocillos y que se recogen las células de un pozo. Los volúmenes que se requieren para el recubrimiento de las células en los MEA 6 pocillos y / o los cubreobjetos depende del número de los AMA 6 pocillos y / o el número de cubreobjetos que se utilizan en el experimento; los números especificados en los pasos 3.2.6 - 3.2.8 Permite escalar a diferentes tamaños de experimentación.
   1. Cálidos DMEM / F12, CDS y medio E8 con 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a R / T. Añadir doxiciclina a una concentración final de 4 mg / ml y el inhibidor de la roca para el medio E8.
   2. Aspirar el medio gastado de los hiPSCs -positivos rtTA / Ngn2 y añadir al menos 1 mL CDS a los hiPSCs. Incubar 3-5 min en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2. Compruebe bajo el microscopio si las células se separe de los otros.
   3. Añadir 2 ml de DMEM / F12 en el pozo, suspender suavemente las células con una pipeta l 1000 y transferir las células a un tubo de 15 ml. Añadir 7 ml de DMEM / F12 a la suspensión celular. Girar las células a 200 xg durante 5 min.
   4. Aspirar el sobrenadante y añadir 2 ml del medio preparado E8. Disociar el hiPSCs poniendo la punta de una pipeta de 1000 l contra el lado del tubo de 15 ml y resuspendiendo las células suavemente. Compruebe bajo el microscopio si se disocian las células.
   5. Determinar el número de células (células / ml) usando una cámara de hemocitómetro.
      NOTA: Una placa de 6 pocillos así a 80 - 90% de confluencia se suelen producir 3,0 - 4,0 x 10 ⁶ células en total.
   6. Aspirar el laminina diluida. Para los MEAs 6 pocillos, diluir las células para obtener una cell suspensión de 7,5 x 10 ⁵ células / ml. Placa de las células mediante la adición de una gota de 100 l de la suspensión de células en el área del electrodo activo en cada pocillo de las MEAs 6 pocillos. Para los cubreobjetos, diluir las células para obtener una suspensión de células de 4,0 x 10 ⁴ células / ml. Placa de las células mediante la adición de 500 l de la suspensión celular a los pocillos de la placa de 24 pocillos.
      NOTA: La densidad final de células en los MEA es más alta que en los cubreobjetos (Figura 1A y B). Se encontró que era necesaria esta densidad celular elevada para el adecuado registro de la actividad de la red. En el protocolo, los números son siempre que resultó ser óptima para los ensayos.
   7. Coloque los AMA de 6 pocillos y placa de 24 pocillos en un humidificado incubadora a 37ºC con una atmósfera de CO2 al _5% durante 2 h (AMMA) o S / N (placa de 24 pocillos).
   8. Después de 2 h, añadir cuidadosamente 500 l del medio de E8 preparada a cada pocillo de las MEAs 6 pocillos. Coloque el 6-nosll MEAs O / N en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2.
3. Cambiar el medio (día 2)
   1. El día siguiente, preparar DMEM / F12 con 1% (v / v) de N-2 suplemento, 1% (v / v) de aminoácidos no esenciales y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Añadir humana recombinante neurotrofina-3 (NT-3) a una concentración final de 10 ng / ml, el factor derivado del cerebro humano recombinante neurotrófico (BDNF) a una concentración final de 10 ng / ml, y la doxiciclina a una concentración final de 4 mg / mL. Calentar el medio a 37 ° C.
   2. Añadir la laminina a una concentración final de 0,2 mg / ml al medio. Filtrar el medio resultante. Aspirar el medio gastado procedente de los pozos de los AMA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos y sustituirlo por el medio preparado. Incubar los AMA de 6 pocillos y 24 pocillos placa de O / N en un humidificado incubadora a 37ºC con una atmósfera de CO2 al _5%.
4. Añadir astrocitos de rata (día 3)
   NOTA: Los volúmenes que se mencionan en este protocolo suponen que los astrocitos de rata se cultivan en frascos de cultivo T75. Es fundamental que los astrocitos de rata que se agregan a los cultivos son de buena calidad. Se utilizan dos criterios para comprobar si los astrocitos de rata son de buena calidad. En primer lugar, la cultura de astrocitos de rata debe ser capaz de crecer confluente dentro de los diez días después del aislamiento de los cerebros de embriones de rata. En segundo lugar, después de la división de la cultura de astrocitos de rata, los astrocitos de rata deben ser capaces de formar una confluentes, monocapa tessellated (Figura 1C). Si el cultivo de astrocitos de rata no cumple estos dos criterios, se aconseja no utilizar este cultivo para la diferenciación de los experimentos.
   1. Caliente 0,05% de tripsina-EDTA a RT. Calentar la DPBS y DMEM / F12 con 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina a 37 ° C.
   2. Aspirar el medio gastado del cultivo de astrocitos de rata. Lavar la cultura mediante la adición de 5 ml de DPBS y haga buches con éste suavemente.
   3. Aspircomieron la DPBS y añadir 5 ml 0,05% de tripsina-EDTA. Buches con la tripsina-EDTA alrededor suavemente. Incubar en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de _CO2 durante 5 a 10 min.
   4. Compruebe bajo el microscopio si se separan las células. Separar las últimas células golpeando el matraz de un par de veces.
   5. Añadir 5 ml de DMEM / F12 al matraz. Se tritura las células suavemente en el interior del matraz con una pipeta de 10 ml. Recoger la suspensión de células en un tubo de 15 ml. Girar el tubo a 200 xg durante 8 minutos.
   6. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de DMEM / F12. Determinar el número de células (células / ml) usando una cámara de hemocitómetro.
   7. Añadir 7,5 x 10 ⁴ astrocitos por pocillo de los AMMA de 6 pocillos. Añadir 2,0 x 10 ⁴ astrocitos por pocillo de la placa de 24 pocillos. Incubar los AMUMA y la placa de 24 pocillos O / N en un humidificado incubadora a 37ºC con una atmósfera de CO2 al _5%.
5. Cambiar el medio (día 4)
   NOTA: Citosina β-D-arabinofuranósido se añade al medio para inhibir la proliferación de astrocitos y matar los hiPSCs restantes que no están diferenciarse en neuronas.
   1. Se filtra el medio y cálido a 37 ° C. Aspirar el medio gastado procedente de los pozos de los AMA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos y sustituirlo por el medio preparado. Mantener los MEAs 6 pocillos y la placa de 24 pocillos en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2.
6. Refrescar el medio (Día 6 - 28)
   NOTA: A partir del día 6, refrescar la mitaddel medio cada dos días. De día 10 en adelante, el medio se complementa con FBS para soportar la viabilidad de los astrocitos.
   1. Preparar medio neurobasal con 2% (v / v) B-27 suplemento, 1% (v / v) L-alanil-L-glutamina y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina. Añadir NT-3 a una concentración final de 10 ng / ml, BDNF a una concentración final de 10 ng / ml, y la doxiciclina a una concentración final de 4 mg / ml. De día 10 en adelante, también complementar el medio con 2,5% (v / v) de FBS. Se filtra el medio resultante y se calienta a 37 ° C.
   2. Retire la mitad del medio gastado procedente de los pozos de los AMA de 6 pocillos y la placa de 24 pocillos con una pipeta 1.000 l y sustituirlo por el medio preparado. Mantener los MEAs 6 pocillos y la placa de 24 pocillos en un humidificado 37 ° C incubadora con una atmósfera de 5% de CO _2.

4. Establecer el perfil neurofisiológico de neuronas derivadas de hiPSC

NOTA: De dos a tres semanas después de la deproducción de la diferenciación, las neuronas derivadas de hiPSC se puede utilizar para diferentes análisis aguas abajo. En esta sección, los ejemplos de algunos análisis aguas abajo se dan que puede ser realizado para establecer el perfil neurofisiológico de las neuronas derivadas de hiPSC.

1. Caracterizar la actividad de la red neuronal utilizando los AMA
   1. Ficha 20 min de la actividad electrofisiológica de neuronas derivadas de hiPSC cultivadas en los AMA. Durante la grabación, mantener la temperatura a 37 ° C, y evitar la evaporación y cambios de pH del medio mediante el inflado de una constante de flujo, lento de gas humidificado (5% de CO _2, 20% O _2, 75% N ₂₎ en el MEA .
   2. Después de la amplificación 1200X (MEA 1060, MCS), muestrear la señal a 10 kHz utilizando la tarjeta de adquisición de datos MCS. Analizar los datos (base a punta y de detección de rotura) usando un paquete de software personalizado ^23.
2. Caracterizar la actividad electrofisiológica de una sola célula
3. La transferencia de las hojas de la cubierta que contienen los cultivos neuronales derivadas de hiPSC a una cámara de grabación sumergida en fase fija en un microscopio vertical. Ficha 20 min de acción espontánea postsináptica corrientes potenciales evocados ⁽²⁴⁾ sEPSC. Detectar el evento sináptica mediante el programa neurocientífica.

Caracterizar la morfología neuronal y la expresión sinapsina

1. Fijar y teñir las neuronas derivadas de hiPSC para MAP2, sinapsina medio, y PSD-95 ^{22, 24, 25.} Cuantificar el número de puntos lagrimales synapsin-1/2 y PSD-95 utilizando el software de análisis de imágenes.

Aquí se ha modificado con éxito un protocolo en el que se diferencian hiPSCs directamente en neuronas corticales por la sobre-expresión del factor de transcripción neurogenina 2-12 y lo hemos adaptado para el uso de los AMA. Este enfoque es rápido y eficiente que nos permite obtener neuronas funcionales y actividad de la red, ya durante la tercera semana después de la inducción de la diferenciación.

Durante el curso del protocolo de diferenciación, las células morfológicamente comenzaron a parecerse a las neuronas: se formaron pequeños procesos y las neuronas comenzaron conectar entre sí (Figura 1A). Hemos establecido un perfil neurofisiológico de las neuronas derivadas de una línea hiPSC-control sano, mediante la medición de su morfología neuronal y las propiedades sinápticas durante el desarrollo. neuronas derivadas de hiPSC se tiñeron para MAP2 y sinapsina-1/2 en diferentes días después del iniciode la diferenciación (Figura 2A). Las neuronas derivadas muestran la morfología neuronal maduro ya 3 semanas después de la inducción de la diferenciación. El número de sinapsina medio puntos lagrimales (una medida para el número de sinapsis) se cuantificó en base a la sinapsina-1/2 tinciones de inmunocitoquímica. El número de puntos lagrimales sinapsina media aumentó con el tiempo, lo que sugiere que el nivel de conectividad neuronal también está aumentando (Figura 2B). El número de sinapsina medio puntos lagrimales 23 días después de la inducción de la diferenciación fue similar en dos líneas independientes de IPS (Figura 2C). En 23 DIV más synapsin1 / 2 puntos lagrimales se yuxtapone a PSD-95 puntos lagrimales, que es indicativo de las sinapsis funcionales (Figura 2D).

Consistente con los resultados descritos por Zhang et al., Generamos una población de capa superior neuronas corticales excitatorios, confirmado por m cortical pan-neuronal y el subtipo específico de arkers como Brn2 y SATB2 (capa II / III). No observamos neuronas que fueron positivos para las neuronas de la capa profunda Ctip2 (capa V) o Foxp2 (la capa VI) (Figura 2 E y F)

Para caracterizar la actividad electrofisiológica de las neuronas derivadas de hiPSC, utilizamos actual de célula completa y grabaciones tensión de la abrazadera, es decir, las propiedades intrínsecas y excitatorios de entrada en estas neuronas fueron medidos durante el desarrollo. Las neuronas fueron capaces de generar potenciales de acción ya una semana después de la de la diferenciación y el porcentaje de clavar células fue aumentando con el tiempo (Figura 2G y H). Por otra parte, las neuronas reciben de entrada sináptica excitatoria ya una semana después de la inducción de la diferenciación: la frecuencia y la amplitud de la entrada sináptica excitatoria aumentaron durante el desarrollo (Figura 2I - K).

nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Para comprender mejor cómo la actividad de una sola célula se combina para formar funciones a nivel de red, es esencial para estudiar cómo las neuronas funcionan en concierto in vitro redes neuronales cultivadas en los AMA. constituye un modelo experimental valiosa para el estudio de la dinámica neuronal. Se registraron 20 min de actividad de la red electrofisiológico de neuronas derivadas de una línea hiPSC-control sano cultivadas en 6 pocillos AMMA (Figura 2 M). Pocas semanas después de la inducción de la diferenciación, las neuronas derivado de hiPSCs y controles sanos formado redes neuronales funcionalmente activos, mostrando eventos espontáneos (0,62 ± 0,05 punto / s; Figura 2 N). En esta etapa del desarrollo (es decir, 16 días después del inicio de la diferenciación) hay eventos sincrónicos que participen todos los canales . de los AMA son detectados (Figura 2O) el nivel de actividad de la red se incrementó durante el desarrollo: durante la cuarta semana después de t que la inducción de la diferenciación, las redes neuronales mostró alto nivel de actividad espontánea (2,5 ± 0,1 espiga / s; Figura 2 N) en todos los pocillos del dispositivo. Las redes también exhibieron ráfagas síncronos de red (4,1 ± 0,1 ráfaga / min, Figura 2O) con larga duración (2.100 ± 500 ms).

Figura 1: hiPSC diferenciación en neuronas. A. Tres puntos de tiempo de hiPSCs diferenciación en neuronas en cubreobjetos. B. Chapado de hiPSCs en los AMA. C. Los astrocitos en el 100% de confluencia en el matraz T75 (tenga en cuenta que las células forman una monocapa de mosaico). Barras de escala: 150 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. hiPSC derivado de neuronas de caracterización. Neuronas derivadas de hiPSC A. se tiñeron para MAP2 (verde) y sinapsina medio (rojo) en diferentes días después del inicio de la diferenciación. Barra de escala: 10 micras. B. Cuantificación de puntos lagrimales sinapsina en dos experimentos independientes. En cada uno de los experimentos se analizaron al menos 10 células. C. Cuantificación de puntos lagrimales sinapsina en DIV23 en neuronas derivadas de dos líneas de IPS independientes. Neuronas derivadas de hiPSC D. se tiñeron para PSD-95 (verde) y / 2 (rojo) 23 días 1 sinapsina después del inicio de la diferenciación. sinapsina puntos lagrimales se yuxtaponen al PSD-95 puntos lagrimales. Neuronas derivadas de E. hiPSC se tiñeron para MAP2 (verde) y Brn2 (rojo) o SATB2 (rojo) 23 d después del inicio de la diferenciación. F. El porcentaje de células positivas que MAP2fueron positivos para los marcadores indicados. G. representativos clamp grabaciones de corriente que muestran que los potenciales de acción se pueden generar tan pronto como 7 d después del inicio de la diferenciación. H. Porcentaje de células en diferentes días después de la inducción de la diferenciación que muestran uno o más potenciales de acción. I. trazas representativas de las corrientes postsinápticas excitatorias (EPSCs) recibidas por neuronas derivadas de hiPSC en diferentes días después de la diferenciación. J. frecuencia de las corrientes excitatorios postsinápticos durante el desarrollo. K. amplitud de las corrientes excitatorios postsinápticos durante el desarrollo. L. Representante traza de grabaciones EPSC sin (control) y con CNQX (CNQX). M. neuronas derivadas de una línea hiPSC se cultivaron en un MEA de 6 pocillos y se muestra la actividad de red para redes neuronales derivadas de hiPSC 16 y 23 d después de la inducción de la diferenciación. La actividad registrada desdecada uno (frecuencia de muestreo de 10 kHz) también se indica con un color diferente (5 min de los 20 minutos de la grabación se muestra). N. tasa de disparo 16 y 23 d después de la inducción de la diferenciación. O. tasa de ruptura 16 y 23 d después de la inducción de la diferenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Dados los resultados, la calidad de las neuronas hiPSC derivados resultantes puede evaluarse haciendo un perfil neurofisiológico de las células. Es decir, tres a cuatro semanas después del inicio de la diferenciación, la morfología, sinapsina medio de expresión y la electrofisiología de las neuronas pueden evaluarse. En ese punto de tiempo, se espera que las neuronas derivadas de hiPSC para mostrar una morfología de tipo neuronal, para ser MAP2, sinapsina / PSD-95 inmunocitoquímica positiva cuando se realizan, y para exposit actividad electrofisiológica espontánea (tanto en el de una sola célula y el nivel de red).

Los autores no tienen nada que revelar.