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Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

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DOI:

10.3791/54903

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26 de diciembre de 2016

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1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology, Oregon Health and Science University

En este artículo

Resumen

Se desarrolló un procedimiento quirúrgico para administrar células tumorales mamarias al hígado murino mediante inyección en la vena porta. Este modelo permite la investigación de las etapas tardías de la metástasis hepática en un huésped totalmente competente para el sistema inmunitario, incluida la extravasación de células tumorales, la siembra, la supervivencia y el crecimiento metastásico en el hígado.

Resumen

El cáncer de mama es la principal causa de muerte por cáncer en mujeres en todo el mundo. metástasis en el hígado está implicado en más del 30% de los casos con metástasis de cáncer de mama, y ​​los resultados en los resultados pobres con tasas de supervivencia media de sólo 4,8 - 15 meses. modelos de roedores actuales de la metástasis del cáncer de mama, incluyendo xenoinjerto de células del tumor primario y modelos de tumores espontáneos, raramente metástasis en el hígado. modelos de inyección intracardiaca intraesplénicos y dan lugar a metástasis en el hígado, sin embargo, estos modelos pueden ser confundidos por metástasis secundaria concomitante in situ, o por la inmunidad comprometida debido a la extirpación del bazo para evitar el crecimiento de tumores en el sitio de la inyección. Para hacer frente a la necesidad de mejorar los modelos de metástasis de hígado, un método de inyección de la vena porta murino que proporciona las células tumorales en primer lugar y directamente a se desarrolló el hígado. Este modelo ofrece las células tumorales en el hígado sin complicaciones de la metástasis concurrentes en otros órganos o la extirpación del bazo. el optprotocolo de la vena porta imized emplea pequeños volúmenes de inyección de de 5 - 10 l, ≥ 32 agujas de calibre, y la gasa hemostática en el lugar de la inyección para controlar la pérdida de sangre. El enfoque de inyección en la vena portal en ratones Balb / c hembra usando tres líneas tumorales mamarias singénicos de variar se puso a prueba el potencial metastásico; células de alto metastásico 4T1, células metastásicas D2A1 moderada, y las células D2.OR bajo metastásico. Las concentraciones de ≤ resultados 10.000 células / inyección en una latencia de aproximadamente 20 - 40 días para el desarrollo de las metástasis hepáticas con los más altos metastásico 4T1 y D2A1 líneas, y> 55 días para la línea D2.OR menos agresivo. Este modelo representa una herramienta importante para estudiar la metástasis del cáncer de mama en el hígado, y puede ser aplicable a otros tipos de cáncer que con frecuencia metástasis en el hígado incluyendo colorrectal y adenocarcinomas de páncreas.

Introducción

La metástasis del cáncer de pecho en el hígado

El hígado es un sitio frecuente de metástasis del cáncer de mama, junto con el hueso y pulmón 1-3. Metástasis hepáticas en pacientes con cáncer de mama es un factor pronóstico independiente para los resultados muy pobres a 4,5, ya que la supervivencia media de los pacientes con cáncer de mama con metástasis hepática rangos de 4.8 a 15 meses 6-9. Por el contrario, los pacientes con cáncer de mama con metástasis pulmonar o los huesos, tienen tasas de supervivencia media de 27,4 meses 9 a 8,9 y 16,3 a 56 meses 8,10-12, respectivamente. La metástasis es un proceso de múltiples pasos, se refiere como la cascada metastásica, que comienza con la difusión de células tumorales en el tumor primario y termina con mortalidad de los pacientes debido a la siembra y el crecimiento de células tumorales circulantes en un órgano distante 13-15. modelos de roedores de la metástasis han revelado que la cascada metastásica es notablemente ineficiente, con sólo el 0,02 - 10%de las células tumorales circulantes que establecen la metástasis abierta 16,17. Un importante cuello de botella de la ineficiencia metastásico es dictado por los microambientes de tejidos únicos en sitios secundarios, llamados nichos metastásicos 18, poniendo de relieve la importancia de comprender la metástasis de sitio específico. El nicho metastásico es único para el sitio de recurrencia, y es, en parte, caracterizado por la deposición de proteínas de matriz extracelular distintas 19,20, infiltración de diferentes poblaciones de células inmunes 21-23, y la homeostasis del tejido alterado, incluyendo la producción desregulada de numerosas citoquinas, quimiocinas y factores de crecimiento 15,18,24,25. Por lo tanto, una comprensión del nicho metastásico específica de tejido precede a una comprensión de cómo orientar la enfermedad metastásica. Sin embargo, los modelos robustos de metástasis hepáticas son insuficientes. Además, la mejora de los modelos de metástasis hepáticas serán esenciales para la identificación de nuevas dianas y tratamientos eficaces para los pacientes con cáncer de mama wimetástasis hepáticas ª.

Los modelos para estudiar el cáncer de mama metástasis en el hígado establecido

Actualmente los modelos disponibles para el estudio de la metástasis del cáncer de mama al hígado incluyen xenoinjertos de células cancerosas humanas en ratones inmunodeprimidos. Estos modelos suelen utilizar líneas celulares de cáncer de mama humano bien estudiados como MCF-7 y MDA-MB-231 y desnuda, Rag1 - / -, o SCID inmunocomprometidos anfitriones murinos 26-29. Modelos de xenoinjerto proporcionan la ventaja de que implica líneas celulares de cáncer derivadas de ser humano, sin embargo, dado el reciente reconocimiento por las células inmunes en la metástasis 30-32 y en la resistencia terapéutica 33-35, el estudio de la metástasis en un huésped competente totalmente inmune es de suma importancia. Modelos para estudiar la metástasis del cáncer de mama en el hígado en huéspedes inmunocompetentes incluyen la inyección de las células singénicas ortotópico tumor (por ejemplo, 4T1 y líneas celulares D2A1) en la almohadilla de grasa mamaria, con o sin quirúrgicola resección del tumor primario, y la posterior evaluación de las metástasis 36-38. Es de destacar que la tasa de metástasis hepáticas de modelos de trasplante ortotópico es muy baja o inexistente en comparación con otros sitios de metástasis de pulmón como 39,40, o se produce después de que se estableció la metástasis de pulmón, lo que complica el estudio de la metástasis hepática específica 37,39 .

explantes tumorales de modelos de cáncer de mama espontáneos de ingeniería genética pueden ser re-inyecta en las almohadillas de grasa mamaria de hosts ingenuas como las células tumorales singénicas. Por ejemplo, se informó recientemente de que los tumores espontáneos de K14 Cre ECAD f / f P53 f / f ratones, qué modelo de carcinoma de mama invasivo lobular, desarrollan tumores cuando se inyectan de forma ortotópica en huéspedes de tipo salvaje. Después de la resección quirúrgica de estos tumores una vez que alcanzan 15 mm 2, 18% de los ratones progresó a la metástasis de hígado 40,41. Un tercer enfoque para modelo utiliza metástasis hepáticametástasis espontánea en ratones modificados genéticamente. Hasta la fecha, los informes de los modelos murinos espontáneas de la metástasis del cáncer de mama que fácilmente se diseminan al hígado son poco comunes. Las excepciones incluyen el H19-IGF-2, p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre, y el f / f P53 K14 Cre ECAD f / f modelos de ratones genéticamente manipulados, en los que se desarrolla la metástasis de hígado en un bajo porcentaje de los ratones 38,41- 43. Por lo tanto, mientras que los modelos de ratón genéticamente modificados facilitar el estudio de todas las etapas de la cascada metastásica, proporcionando modelos potentes y clínicamente relevantes, se ven limitados debido a las bajas tasas de metástasis de hígado 38.

Varios modelos de metástasis omiten los pasos iniciales de la cascada metastásica incluida la difusión de células tumorales desde el tumor primario y intravasación. Estos modelos permiten la investigación sobre los pasos posteriores de la cascada metastásica, desde la extravasación de establecimiento de los tumores en los sitios secundarios. el intracardiac modelo de inyección proporciona células tumorales en el ventrículo izquierdo, que distribuye las células tumorales en el sistema circulatorio a través de la aorta. inyección intracardiaca requiere guiada por ultrasonido de formación de imágenes del sitio de inyección o otras modalidades de imágenes tales como la bioluminiscencia de la luciferasa etiquetados células para confirmar la inyección con éxito. Inyección de células tumorales a través del ventrículo izquierdo puede resultar en hueso, cerebro, pulmón, y / o metástasis del hígado, entre otros órganos 44-48. A causa de las metástasis multiorgánicas, estos ratones a menudo tienen que ser sacrificados antes del desarrollo de metástasis hepática abierta, negando la posibilidad de investigar a fondo el crecimiento metastásico en el hígado. Un enfoque alternativo que minimiza significativamente el desarrollo de metástasis multi-sitio es el modelo de inyección intraesplénica. Inyección intraesplénica ofrece las células tumorales a través de la vena esplénica que se une con la vena mesentérica superior para convertirse en la vena portal 49,50. Los animales pueden ser monitorizados para outgrowth de las lesiones metastásicas en el hígado debido a la formación de metástasis en otros sitios es rara, y como resultado, la salud general del animal se mantiene 49,50. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el modelo intraesplénica requiere esplenectomía para evitar tumores esplénicos 49,50, un procedimiento que afecta la función inmune. Por ejemplo, la lesión por isquemia reperfusión miocárdica se caracteriza por la infiltración de monocitos subconjuntos Ly6C + que se originan a partir del bazo y son responsables de la fagocitosis y la actividad proteolítica durante la cicatrización de la herida después de la isquemia 51,52. Con la esplenectomía, hay una reducción observada en las poblaciones de monocitos que ayudan en la cicatrización de heridas 52. Además, esplenectomía se ha demostrado que reduce el crecimiento del tumor primario y metástasis de pulmón en un modelo de cáncer no microcítico de pulmón de células, específicamente a través de una reducción en el número de circulante y intra-tumor CCR2 + CD11b + Ly6C + mielo monocíticascélulas id 53. Además, esplenectomía después de la inyección intraesplénica de células de cáncer de colon como resultado niveles reducidos de células asesinas naturales anti-tumorales en los ganglios linfáticos mesentéricos y metástasis hepática elevada 54. En suma, estos resultados sugieren que la esplenectomía compromete la función del sistema inmunológico con consecuencias posteriores para el destino celular metastásico.

La inyección de la vena porta hepática Modelo de Metástasis

Para investigar la metástasis del cáncer de mama en el hígado en un huésped competente totalmente inmune, en condiciones en que los ratones no se vean comprometidos debido a la metástasis multiorgánicas, se desarrolló un modelo de inyección de la vena porta. Modelos de inyección intraportal se han utilizado previamente para estudiar metástasis hepáticas de cáncer colorrectal y melanoma 55,56 16 líneas celulares; aquí se describe la aplicación de la inyección intraportal de modelo de metástasis de células de tumor de mama singénico. Este modelo puede ser utilizado para estudiarlas últimas etapas de la cascada metastásica del cáncer de mama, incluyendo la extravasación de células y la siembra, las decisiones del destino de las células tumorales con respecto a la muerte / proliferación / latencia, y el crecimiento en las lesiones abiertas. En este modelo, las líneas celulares de tumor mamario singénicos se inyectan a través de la vena porta de ratones hembra Balb / c inmunocompetentes, un método que ofrece las células tumorales en primer lugar y directamente al hígado sin la extirpación del bazo. Para desarrollar este modelo, el uso de cuatro líneas de células tumorales mamarias que varían en su capacidad metastásica de bajo a alto fueron empleados: D2.OR, D2A1, y 4T1, y han empleado D2A1 etiquetados con la proteína fluorescente verde (GFP-D2A1) a investigar los puntos de tiempo poco después de la inyección de células tumorales. 4T1 es una línea celular altamente metastásica derivada del 410,4 tumor que surgió de manera espontánea en un ratón 36,37 MMTV + Balb / c hembra y metástasis en pulmón, hígado, cerebro y hueso de la almohadilla de grasa mamaria tumores primarios 39,57,58. las células tumorales D2A1 werE también deriva originalmente de un tumor mamario espontáneo que surge en un huésped Balb / c después del trasplante de células de nódulos alveolares hiperplásicas D2, y se confirmó que metastásica del tumor primario en el pulmón 59,60. Células tumorales D2.OR son una línea hermana no metastásico a la línea D2A1 y, a pesar de que escapan del tumor primario y llegan a los sitios secundarios, que rara vez se establecen metástasis distantes 60,61.

Además, es importante evitar el uso de fármacos de control del dolor comúnmente empleados incluidos los medicamentos no esteroides antiinflamatorios (AINE) durante o después del procedimiento quirúrgico. AINE tienen actividad anti-tumor en ciertos cánceres de mama 62-65, y algunas clases de AINE aumentan el riesgo de hepatotoxicidad 66,67, potencialmente comprometer el estudio de la metástasis de hígado y el nicho metastásico del hígado. Además, los estudios sugieren que los AINE influyen directamente en el microambiente del tejido, reduciendo ext pro-metastásicoproteínas de la matriz racellular tenascina-C 68 y colágeno fibrilar 62,65. Alternativamente, el uso de un derivado de opioides, la buprenorfina, fue utilizado debido a su eficacia en el tratamiento del dolor roedor 69 y debido a la falta de evidencia de que los opiáceos tienen una actividad anti-tumor 70. Este modelo de inyección de la vena porta se ha optimizado para volúmenes de inyección menores de 5 - 10 l para evitar daños innecesarios al hígado. El modelo también se optimizó para incluir agujas con un diámetro más pequeño (≥ 32 gauge) y el uso de una gasa hemostática inmediatamente después de la inyección para minimizar la pérdida de sangre durante el procedimiento. En contraste con estos parámetros de inyección optimizadas, el número de células se deben determinar en una base individual, basado en el potencial tumorigénico de la línea celular. Sin embargo, a partir de ≤ 10.000 células / inyección para estudios a largo plazo se recomienda. Para los puntos finales más cortas (por ejemplo, 24 horas después de la inyección) considerablemente más células tumorales (por ejemplo,1 × 10 5 - 1 x 10 6) se puede utilizar si se justifica. En resumen, el modelo de inyección de la vena porta se detalla aquí representa una herramienta útil para el estudio de la metástasis del cáncer de mama en el hígado y evita un número de las limitaciones de otros modelos de metástasis de hígado. Este modelo facilita el estudio de la extravasación de células tumorales, la siembra, las decisiones del destino tempranas de la supervivencia, la proliferación y la latencia, y el crecimiento metastásico en hospedadores murinos competentes inmunes.

Protocolo

Todos los animales procedimientos descritos en este artículo fueron revisados ​​y aprobados por la Oregon Health & Science University Institucional Cuidado de Animales y el empleo.

1. Preparación del área quirúrgica y de los instrumentos

  1. Preparar las tijeras, fórceps, y hemostato en autoclave a 124 ° C durante 30 min, 1 - 2 días antes de las cirugías planificadas. Garantizar el acceso a las camas en autoclave o estériles, jaulas y alimentos para la recuperación post-quirúrgica.
  2. Preparar un área quirúrgica aséptica, preferiblemente en una campana de flujo laminar.
    1. Limpie todas las superficies de la zona quirúrgica con un 10% de lejía, incluyendo el cojín eléctrico, fuente de luz, tubos de anestesia y el cono de la nariz, y cualquier otra parte de la sala de operaciones que estarán en las proximidades de la intervención quirúrgica mientras se lleva a cabo .
    2. En el área de la cirugía aséptica, coloque la almohadilla térmica limpiarse con paño estéril, fuente de luz, tubos de anestesia y la ojiva, jeringas de insulina, Jeringas de 1 ml, bupivacaína, lágrimas artificiales, solución salina estéril, 2 x 2 "esponjas de gasa estéril, 4 x 4" de gasa estéril, corte de gasa hemostática en 0,5 - trozos de 1 cm2, tijeras, pinzas, pinzas hemostáticas, 4-0 suturas de vicryl con la aguja cónica, y 50 ml 2% de gluconato de clorhexidina en un recipiente esterilizado en autoclave.
    3. Asegúrese de que hay espacio en este espacio para las células tumorales preparados almacenados en hielo.
    4. En el banco junto a la zona quirúrgica, preparar el área de recuperación con una segunda resistencia de calentamiento y jaulas limpias con ropa estéril.
      NOTA: Esta zona también se puede artículos de la casa tales como un esterilizador de cuentas.

2. La inyección de la vena porta

  1. Una hora antes de las inyecciones previstas, el tratamiento de ratones Balb / c hembra de entre 8 - 15 semanas con 100 l de 0,015 mg / ml buprenorfina, por vía subcutánea, para el manejo del dolor.
    NOTA: Este protocolo de inyección se puede aplicar a cualquier cepa de ratón hembra o macho a cualquier edad, utilizando el apropiadolíneas celulares de cambios en la cepa.
  2. Preparar las células tumorales para inyección en base a los protocolos para la línea celular o explante tumor de elección. Pruebe todas las líneas de células tumorales antes de la administración de la presencia de patógenos murinos para reducir el riesgo de introducir tales agentes patógenos en la colonia animal.
    1. Para las líneas de células tumorales Balb / c singénicos incluyendo D2A1, D2.OR, y las células tumorales 4T1, células de descongelación en una placa de cultivo de tejidos de 10 cm 3 días antes de la inyección de tal manera que las siguientes células son día a ~ 90-100% de confluencia.
    2. 1 día células de lavado deshielo celular después de tumor una vez con solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y las células tumorales trypsinize confluente utilizando 2 ml de tripsina al 0,05% a 37 ° C durante 5 min. Añadir 8 ml de medio completo (DMEM de alta glucosa, suero bovino fetal al 10%, 2 mM L-glutamina y 1x de penicilina / estreptomicina) y el paso de 01:10 en un plato fresco 10 cm con 10 ml de medio completo.
    3. En el día de las inyecciones, lavar las células una vez con PBS 1x y trypsinize como se describe anteriormente.
    4. Resuspender las células tratadas con tripsina en 8 ml de medio completo, centrifugado durante 5 min a 1.500 xg, retire los medios de comunicación y se vuelve a suspender en 5 ml de PBS 1x.
    5. Recuento de células en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano para la evaluación de la viabilidad. Resuspender las células para la inyección en 1x PBS a una concentración predeterminada y el volumen.
      NOTA: 5 - 10 l se recomienda como volúmenes de inyección más pequeñas evitan daños innecesarios al hígado.
    6. Mantener las células en hielo durante la duración de las inyecciones. Después de la terminación de las inyecciones, devolver una muestra de células al laboratorio y colocar en cultivo en medio completo durante 1 día para asegurar la viabilidad.
  3. Coloque el ratón bajo anestesia con 2 a 2,5% de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano) entregada en oxígeno. Mantener la temperatura corporal mediante el teclado de calefacción. Garantizar la anestesia completa mediante la evaluación de una reacción a una pizca dedo del pie, y luego mantener anesthesia con un 2 - 2,5% isoflurano.
    NOTA: Es importante controlar los animales tasa de respiración y ajustar la velocidad de flujo de isoflurano en consecuencia durante todo el procedimiento.
  4. Coloque una pequeña cantidad de lágrimas artificiales o ungüentos veterinario sobre cada ojo para evitar un exceso de sequedad de los ojos durante el procedimiento quirúrgico.
  5. Coloque el ratón en una posición supina, en su parte posterior con el abdomen descubierto.
  6. Quitar el pelo en el lado izquierdo de la ventral de roedores de la segunda costilla espacio hasta el pezón inguinal glándula mamaria 4 TH limpiando la zona con depilatorio químico. Deje que la crema depilatoria para sentarse durante 1 - 2 minutos y después se elimina por completo con una gasa y H 2 O. Este paso puede realizarse 1 - 2 días por adelantado para ahorrar tiempo si se han previsto numerosas cirugías.
  7. Tome una 2 x 2 "esponja de gasa estéril (empapado en 2% de clorhexidina) y limpiar el ratón en el sitio de eliminación del vello. Esterilizar el área entera circundante, incluyendo la cola, para reducir al mínimo cont bacterianaaminación de instrumentos.
  8. Limpie el sitio de la depilación y el área circundante hacia abajo con una toallita de alcohol.
  9. Repetir 2% de clorhexidina y alcohol pasos una vez más y terminar con un final de clorhexidina limpiar para un total de tres clorhexidina al 2% y dos lavados de alcohol toallita. Foro de la clorhexidina última toallita de tal manera que el producto químico no está goteando alrededor del sitio quirúrgico para evitar que la clorhexidina en los órganos internos. NOTA: La aplicación de grandes cantidades de clorhexidina y alcohol a la piel y la piel circundante puede dar lugar a una caída significativa en la temperatura corporal. No limpie con exceso de volumen durante las etapas de 2,7-2,9. Mantener la temperatura corporal con una almohadilla térmica.
  10. El uso de guantes estériles y un bisturí esterilizado con hoja estéril, hacer una sola incisión de 1 pulgada en la piel entre los planos medios y sagital en el lado izquierdo del ratón, comenzando justo debajo de las costillas y termina justo por encima del plano de la cuarta inguinal pezón glándula mamaria.
  11. El uso de tijeras y pinzas esterilizadas tratados en autoclave o perla, hacer una incisión similares de 1 pulgada en el peritoneo. Evitar el corte en la almohadilla de grasa mamaria y asegurarse de no cortar los intestinos, el hígado, o el diafragma.
  12. Coloque una "almohadilla de gasa 4 x 4 empapada en solución salina estéril en el lado izquierdo del ratón, donde se hizo la incisión, de manera que los órganos internos se pueden colocar en la gasa y no entran en contacto con la piel circundante o área quirúrgica.
  13. Preparar las células tumorales mediante la pipeta hacia arriba y abajo varias veces como células tumorales se asentarán durante la preparación del ratón. Preparar una jeringa con aguja 25 l extraíble y una aguja de calibre 32 con células tumorales. Empuje de la jeringa hasta que las células tumorales se encuentran en la punta de la aguja y el émbolo está en el volumen apropiado para inyección; evitar la inyección de burbujas de aire.
  14. Limpiar el exterior de la aguja con una gasa con alcohol estéril para eliminar cualquier célula tumoral externos. Tenga cuidado para evitar pinchazos accidentales.
  15. Mantenga la mediana side de la incisión, incluyendo la piel y la membrana peritoneal, a un lado con las pinzas y utilizar un hisopo de algodón estéril para sacar con cuidado los intestinos grueso y delgado a cabo, colocándolos sobre la gasa estéril empapada en solución salina estéril. Tire de intestinos grueso y delgado hasta que se visualiza la vena porta.
  16. Cubrir los órganos internos de la gasa empapada solución salina para mantener la humedad interna y la esterilidad.
  17. Tener un asistente, también el uso de guantes estériles, mantenga los intestinos envueltos en la gasa empapada solución salina con suavidad fuera del camino con un hisopo con punta de algodón estéril para revelar totalmente la vena porta. Además, puede ser necesario el uso de la pinza hemostática o fórceps autoclave para mantener el tejido a un lado en el lado medio de la incisión.
  18. Insertar la aguja cargada con células tumorales ~ 3-5 mm en la vena portal ~ 10 mm por debajo del hígado en un ángulo <5 ° a la vena, con bisel hacia arriba. Inyecte lentamente todo el volumen que contiene las células tumorales. Deje que la sangre fluya más allá de la aguja head durante varios segundos para evitar el reflujo de las células tumorales de la vena. Reducir al mínimo el movimiento de la aguja en la vena durante la inyección. Una vez más, tenga cuidado para evitar pinchazos accidentales.
    NOTA: La visualización de la vena porta se realiza sin aumento, sin embargo, un microscopio estéreo se puede usar si se prefiere.
  19. Retire la aguja mientras se coloca al mismo tiempo un aplicador con punta de algodón estéril en la vena con la presión. De su auxiliar sin soltar los intestinos a un lado colocar una pieza de 0,5 - 1 cm por 2 gasa hemostática sobre el lugar de la inyección en la vena.
    NOTA: polvo hemostático también se intentó para este paso en el protocolo, pero no fue eficaz en detener la pérdida de sangre venosa después de la inyección.
  20. Mantenga la gasa hemostática en el sitio de la inyección con la presión de un aplicador con punta de algodón estéril durante 5 min.
  21. Evaluar cierre de la vena levantando con cuidado la gasa hemostática, si los palos de gasa para el tejido circundante, una pequeña cantidad de sterile salina puede ser utilizado para absorber y levante la gasa.
  22. Si la pérdida de sangre se produce en este tiempo, colocar una pieza adicional de gasa hemostático en el sitio con una presión de 5 min más. Cuando el flujo de sangre ha cesado por completo, retire la gasa del ratón.
    NOTA: La pérdida de sangre durante el procedimiento quirúrgico debe evaluarse cuidadosamente y si se alcanza o se supera el volumen total permitido la pérdida de sangre (basado en los procedimientos operativos estándar de regulación para juntas de revisión institucional del investigador) el ratón debe ser sacrificado, mientras que bajo anestesia mediante perfusión cardiaca.
  23. Una vez que el sitio de la inyección se considera intacto, sin abandonar el lugar de inyección de sangre, colocar los órganos internos suavemente de nuevo en la cavidad abdominal.
  24. Suturar la membrana peritoneal y luego la piel con sutura de vicryl 4-0 y aguja estériles cono a través de un patrón de sutura continua o interrumpida simple. Típicamente, el cierre de la incisión requiere 10-15 suturas.
  25. Se inyectan 100 l de Bupivacaine (5 mg / ml) a lo largo del sitio de la incisión para el manejo del dolor local usando una jeringa de insulina. Inyectar 0,5 ml de solución salina estéril por vía subcutánea con una jeringa de 1 ml con aguja de calibre 26 para la hidratación. Cirugías toman 15 - 25 minutos en completarse.
  26. Para mantener las condiciones estériles durante toda la cirugía, asegúrese de que todas las herramientas y materiales que entren en contacto con el ratón, incluyendo las manos enguantadas, se limpian adecuadamente antes del contacto. Siempre que sea posible utilizar los materiales y guantes estériles, o mínimamente utilizan una solución de etanol al 70% o una solución de lejía al 10% para limpiar.
  27. Si se han previsto varias cirugías para una sola sesión rehacer el área de la cirugía inicial con caída fresca estériles, jeringas de insulina, jeringas de 1 ml, solución salina estéril, "esponjas de gasa estéril, 4 x 4" 2 x 2 gasas estériles, gasa hemostática cortado en 0,5 - 1 cm 2 piezas, 4-0 suturas de vicryl con aguja cónica, y 2% de clorhexidina. Bolas de esterilizar las tijeras, pinzas, pinza hemostática y en entre cirugías y permitirenfriar adecuadamente antes de volver a usarla.

3. Recuperación, Seguimiento del roedor salud y el análisis de punto final

  1. Después de la intervención quirúrgica es completa, mantener los ratones en una almohadilla térmica para la recuperación en jaulas limpias, sin ropa de cama durante un mínimo de 20 min. Los ratones suelen tardar 2 - 4 minutos para despertar de la anestesia.
  2. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la cohabitación con otros animales hasta que se haya recuperado completamente de la anestesia. No deje un animal sin vigilancia mientras se está recuperando la conciencia y el monitor hasta que el animal se ha recuperado la capacidad de mantenerse en decúbito esternal.
  3. Dar a los ratones 0,05 - 0,1 mg / kg de buprenorfina para el tratamiento del dolor cada 6-12 horas después de la cirugía, para un máximo de 72 horas.
  4. Compruebe suturas diariamente para asegurar que se mantienen intactos durante la cicatrización. En el caso de que las suturas se deshacen, colocar el ratón bajo anestesia, retirar las suturas y reemplazarlos. En el caso de infección o Inflammación consulte al personal veterinario.
    NOTA: La infección o inflamación no se ha encontrado con este protocolo.
  5. Para los estudios de metástasis, lleve a cabo los controles de salud diarias hasta que se observaron signos externos de enfermedad metastásica, incluyendo, pero no limitado a:> 10% del peso pérdida / ganancia, desaliño, pérdida de atención al entorno, abdominales edema / ascitis, los ojos y las orejas pálidas, o una posición encorvada.
    NOTA: los controles de salud diarias son particularmente importantes en el desarrollo del modelo para su uso con una nueva línea celular o la concentración celular hasta que la línea de tiempo de la metástasis se entiende bien.
  6. En el estudio de punto final, la eutanasia a los ratones por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical.
    NOTA: Los métodos alternativos de la eutanasia aprobadas por el comité de supervisión de los investigadores puede ser utilizado, incluyendo la perfusión con PBS 1x, mientras que bajo anestesia. La perfusión del hígado se lleva a cabo por canulación de la vena porta, cortando la vena cava inferior, y empujando TH PBS 1Xáspera la vasculatura del hígado a una velocidad de 4 ml / min durante 1 - 2 min para eliminar la sangre y los leucocitos circulantes.
    NOTA: Dependiendo del punto final para el estudio, la línea celular, y la concentración utilizada, la metástasis hepática abierta puede o puede no ser evidente en la necropsia. micrometastásicas lesiones pueden ser revelados con el análisis histológico del hígado. Los puntos finales variarán en función del diseño del estudio.
  7. Extracto de hígado con tijeras y pinzas quitando primero la vesícula biliar, a continuación, cortar a través de la vena cava inferior superior al hígado. Corte a través de la vena cava, la vena portal y la arteria hepática inferior al hígado.
  8. Retire todo el hígado suavemente y lavar 5 veces en PBS 1x.
  9. Separar el hígado en lóbulos izquierdo, derecho, la mediana y caudado.
  10. hígado solución de formalina en 10% de formalina tamponada neutra durante 48 horas con agitación a temperatura ambiente. Proceso de tejidos a través de una serie de alcoholes en el aumento de la concentración y el xileno; parafina incrustar el tejido fijo 71 .
    NOTA: Como alternativa, el hígado puede ser congeladas instantáneamente mediante la colocación de tejido en un criomolde con la temperatura de corte óptima fórmula (OCT) y la congelación de gránulos de hielo seco sumergidos en etanol al 95%.
    1. El uso de un microtomo, se corta en el bloque de tejido incluido en parafina de tal manera que un tamaño de partidos cabeza de tejido se revela.
    2. Cortar cinco secciones en serie de 4 micrones, esto constituye el primer nivel de análisis.
    3. Corte a través de 250 micras de tejido, lanzar estas secciones en los residuos.
    4. A 250 micras cortar un segundo nivel de cinco secciones en serie de 4 micras.
    5. Repetir si es necesario a la sección a través de todo el hígado. Hematoxilina y eosina la primera sección de cada nivel para evaluar la metástasis 72.
      NOTA: Para el tejido congelaron rápidamente utilizar un criostato para cortar secciones.
      NOTA: La detección de la enfermedad micrometastásica requerirá la tinción específica de células tumorales.
  11. Eliminar los ratones de estudio si hay crecimiento de tumores en la incisión sentarsee, ya que esto indica la fuga de las células tumorales en la cavidad peritoneal después de la inyección.
    NOTA: Este problema no se ha observado.

Resultados

El modelo de inyección de la vena porta, en el que se entregan las células tumorales directamente al hígado a través de un procedimiento quirúrgico, permite la inyección de células tumorales en la vena portal. En condiciones antisépticas, en un ratón anestesiado, incisión quirúrgica a ~ 1 pulgadas se hace en el lado izquierdo del ratón entre la mediana y sagital aviones, comenzando justo por encima del plano de la cuarta tetina glándula mamaria inguinal y termina justo debajo de las costillas . Los intestinos grandes y pequeños se tira suavemente a través de la incisión para proporcionar una visualización de la vena portal (Figura 1A). identificación anatómica precisa de la vena portal y la inyección intra-portal exitosa puede ser confirmada por la práctica de la protocolo de inyección con tinta china o un colorante similar. Inyección correcta a través de la vena portal resultará en la tinta de ser entregado inmediatamente y específicamente en el hígado, y no dará lugar a la tinta china propagación al pulmón (Figure 1B). Además, el uso de células de tumor mamario de ratón D2A1 etiquetados con GFP, la dispersión de las células tumorales por todo el hígado es evidente a noventa minutos después de la inyección, lo que confirma la entrega inyección en la vena portal para el hígado (Figura 1C). A mayor aumento se hace evidente que a los 90 min después de la inyección, se encuentran células tumorales dentro de sinusoides, así como en el parénquima del hígado en las proximidades de tríadas portales, donde la sangre de la vena porta entra en el hígado (Figura 1C). Estos datos sugieren que la extravasación de células tumorales activo se produce en la inyección de células post-tumor 90 min. En conjunto, estos datos confirman que el modelo de inyección de la vena porta proporciona el volumen de inyección directamente al hígado, con células de tinta o tumorales dispersas por todo el hígado y no hay transporte apreciable de volumen de inyección para el pulmón.

Para evaluar la robustez del modelo de inyección en la vena porta, tres SEPARcomieron líneas celulares de tumor mamario de ratón singénicas fueron probados en ratones adultos hembra Balb / c. Estas líneas tumorales mamarias fueron seleccionados en base a su comportamiento caracterizado modelos almohadilla de grasa mamaria e incluyen la línea altamente agresivo y metastásico de células 4T1, la línea D2A1 metastásico menos agresiva, y la línea D2.OR baja / no metastásico 37,61,73 , 74. 2.000 y 10.000 células por inyección se probaron sin diferencias notables en el tiempo hasta la aparición de metástasis manifiesta con estas concentraciones de células bajas. Para estos estudios se utilizaron como marcadores indirectos de la metástasis como la falta de preparación, palidez, y pérdida de peso para justificar la necropsia, en la que la presencia o ausencia de metástasis en el hígado se confirmaron por evaluación visual del hígado y otros órganos para confirmar la entrega intra-portal . Estos datos confirman informes anteriores de que las líneas de células 4T1 y D2A1 representan líneas tumorales mamarias más agresivas, como se observan tasas de supervivencia libre de metástasis más corto en comparación con los ratones inyectadoscon la línea D2.OR menos agresivo (Figura 2A). Los ratones inyectados con células de metástasis hepáticas 4T1 abierta o tumorales D2A1 desarrollado por ~ 30 - 40 días después de la inyección, y algunas metástasis desarrollado desde las 18 días después de la inyección (Figura 2A), mientras que sólo un ratón inyectado con células D2.OR tenía desarrolló metástasis hepática abierta al final del estudio, que fue de 60 - la inyección de células tumorales después de la 65 días. Las metástasis fueron confirmadas posteriormente por el corte a través del hígado en 250 micras y el análisis de los niveles de hematoxilina y eosina (H & E) manchadas secciones (Figura 2B-D).

Además de la detección de lesiones metastásicas evidentes en el hígado del ratón, el modelo de la vena porta se puede utilizar también para estudiar los eventos anteriores en la cascada metastásica incluyendo la detección de un solo células / grupos de células tras la extravasación, y formación de lesiones micro-metastásico. Se utilizó inmunofluorescencia Multiplex-tinciónpara detectar 4T1, D2A1, y células de tumor mamario de D2.OR en el hígado cuando están presentes como células individuales o lesiones micro-metastásico, como H & E no es suficiente para confirmar la presencia de pequeñas lesiones. La Figura 3A muestra un hígado de ratón Balb / c con un representante focos micrometastásica putativo de células tumorales D2A1 que son positivas para el epitelial CK18 queratina, negativo para el CD45 marcador pan-inmune, y negativa para el marcador de hepatocitos Heppar-1. Los hepatocitos también se tiñen positivo para CK18, lo que exige el uso de Heppar-1 en este panel de tinción. Una nota importante es que las células del epitelio del conducto biliar y progenitoras de hígado tiñen positivo para CK18, lo que requiere la discriminación cuidado entre las células tumorales y de los conductos biliares, particularmente al evaluar regiones periportal (Figura 3A). Una alternativa a multiplexar inmunofluorescencia para identificar células diseminadas individuales y focos de micrometástasis es utilizar líneas tumorales mamarias singénicos etiquetados con verde fluorescenteproteína (eGFP) y / o la luciferasa y realizar IHC para la etiqueta (Figura 1C). Debido a la inmunogenicidad de eGFP, luciferasa, y otras proteínas, es esencial el uso de modelos de ratón que son tolerantes a estas proteínas, tales como la novela competente ratón inmune "brillante cabeza" que expresa eGFP y luciferasa en la glándula pituitaria anterior 75. Para la identificación de las lesiones macrometastásicas de líneas singénicos sin etiquetar como la línea tumoral D2A1, la inmunofluorescencia múltiplex CK18 / Heppar-1 / CD45 es ideal (Figura 3B).

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Figura 1: la vena porta inyección aporta células tumorales directamente al hígado. A) la inyección de la vena porta; la incisión se hace entre la mediana y planos sagital izquierda, desde arriba del plano de la cuarta tetina glándula mamaria inguinal y termina justo debajo de la rib jaula. B) / C hígado Balb con la inyección de PBS (izquierda). Después de la inyección de tinta de la India a través de la vena porta, el hígado (en el medio), pero no el de pulmón (derecha) toma la tinta. C) representativos imágenes sección delgada de células de tumor mamario de ratón D2A1 etiquetados con GFP en a / c de hígado de ratón Balb en 90 min después de la inyección de las células tumorales 1 x 10 6 a través de la vena portal. Los hígados se fijaron con formalina, embebidos en parafina, se seccionaron, y se tiñeron con anticuerpo anti-GFP para la detección de células tumorales. El panel superior muestra células tumorales teñidas de color marrón oscuro (flechas) dispersos por todo el hígado, los hepatocitos asterisco indica que la tinción no específica en torno a las venas centrales; barra de escala = 300 micras. paneles inferiores muestran imágenes representativas de las células tumorales en 90 min después de la inyección sigue estrechamente asociada con la vasculatura; barra de escala = 50 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 2: Crecimiento Externo de Mama de Ratón Líneas de células tumorales en el hígado tras la inyección de la vena porta. A) Curva de Kaplan-Meier que muestra las tasas de supervivencia libre de metástasis en ratones inyectados con células 4T1 2.000-10.000, D2A1, o tumor de mama de ratón D2.OR. Los ratones fueron inyectados con células tumorales y monitorizados para detectar signos de metástasis que incluyen la falta de aseo, ojos claros, y los cambios de peso. La metástasis se confirmó en el momento de la necropsia y por H & E en secciones histológicas de los hígados. N = 2 4T1 2.000 células; 2 4T1 10.000 células. N = 2 D2A1 2.000 células; 3 D2A1 10.000 células. N = 3 D2.OR 2.000 células; 3 D2.OR 10.000 células. Representante de H & E imágenes de B) 4T1 lesiones a los 21 días después de la inyección de 10.000 células C), lesiones D2A1 a los 26 días después de la inyección de 10.000 células tumorales y D) en lesiones D2.OR59 días después de la inyección de 10.000 células; barras de escala = 75 micras. Lesiones similares se observan cuando se inyectaron 2.000 células 4T1 o D2A1 tumorales. No se detectaron lesiones con 2.000 células D2.OR. No hay evidencia de metástasis en otros órganos o en el sitio de la incisión quirúrgica fue evidente en cualquier ratón en estos estudios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: La detección de células individuales y metastásicos Las lesiones en el hígado de ratón utilizando el multiplex de inmunofluorescencia. A) inmunofluorescencia múltiplex Representante de las células tumorales en D2A1 a / c de hígado de ratón Balb a los 90 minutos después de la inyección utilizando el modelo de inyección de la vena porta. La tinción se realizó utilizando un kit multiplex. De izquierda a derecha se muestra DAPI; CD45 para marcar los leucocitos; Heppar-1 a la posición MARk hepatocitos; y CK18 para marcar las células tumorales, hepatocitos, y el epitelio del conducto biliar. Imagen fusionada muestra un supuesto grupo de CK18 + Heppar-1 - D2A1 células tumorales estrechamente asociados con una tríada portal - CD45. Arrow = células tumorales D2A1, el epitelio del conducto biliar = asterisco; barra de escala = 25 micras. B) Un D2A1 abierta lesión metastásica representativa utilizando el mismo panel de tinción como en las células tumorales son A. CK18 + mientras que los hepatocitos adyacentes son CK18 + Heppar-1 +; barra de escala = 25 micras. Las imágenes fueron capturadas en un microscopio con 20 x 0,8, 40 x 1,3, y 60 x 1,4 objetivos y cámara CCD, utilizando el software de microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

El portal de ratón modelo de inyección en la vena Balb / c permite el estudio de lesiones de cáncer de mama en el hígado en ausencia de factores de confusión metástasis de múltiples órganos y en un huésped competente totalmente inmune. El protocolo es un avance de los procedimientos quirúrgicos previamente publicados que permiten el acceso a la vena portal para la inyección de las células tumorales directamente en el hígado 16,55,56. Un avance que hemos hecho es reducir significativamente el número de células tumorales inyectadas de ≥ 1 x 10 5 células / inyección 16,55,56 abajo a ≤ 10.000 células tumorales / inyección. También hemos ampliado el modelo para el estudio de la metástasis del cáncer de mama para el hígado. Usando este protocolo, dos líneas celulares de cáncer de mama con potencial metastásico conocido desarrollan metástasis hepáticas con una latencia más corta que una línea celular de tumor mamario más quiescente. Además, en los puntos de tiempo tempranos, las células tumorales se distribuyen por todo el parénquima del hígado como grupos individuales o pequeñas de solo CELLS después de la inyección de células tumorales. El modelo está preparado para hacer frente a cuestiones de eficiencia metastásico, incluyendo la extravasación de células tumorales, la supervivencia celular, inactividad, y la proliferación - todos los fenotipos que contribuyen al desarrollo de la enfermedad metastásica-micro metastásico y abierta en el hígado.

Es importante tener en cuenta numerosos aspectos del protocolo de inyección de la vena porta, antes de iniciar los estudios. Con cuidado, decidir sobre las líneas celulares, la concentración de células, número total de células, y los puntos finales de interés basado en estudios exploratorios más pequeños es muy recomendable. Además, el uso de ordenadores competentes inmunes y las líneas celulares singénicas es de suma importancia para la comprensión de las interacciones de células huésped-tumorales. El ratón de nuevo desarrollo "resplandeciente cabeza" que expresa eGFP y luciferasa de la glándula pituitaria anterior es una herramienta importante para la eliminación de las respuestas del huésped a exógeno eGFP y luciferasa, proteínas a menudo se utilizan para etiquetar las líneas tumorales mamarias 75 . El uso del ratón "resplandeciente cabeza" y etiquetada células tumorales singénicas facilitarán una fácil identificación de las células diseminadas individuales y focos de micrometástasis por IHC sin la preocupación de las respuestas inflamatorias a eGFP o luciferasa. Del mismo modo, la elección de las estrategias de manejo del dolor cuidadosamente para asegurar un mínimo o anti-impacto a favor de tumor del régimen de tratamiento de drogas es muy recomendable. Los pasos críticos en este protocolo incluyen el mantenimiento de condiciones estériles a través de cirugías para asegurarse de que la infección no se produce, ya que esto confundirá a ningún resultado. También es importante que la aguja está correctamente colocado en la vena portal para asegurar que las células tumorales se entregan al hígado. Practicar el protocolo con colorantes tales como tinta china ayudará con este problema. El crecimiento del tumor en el lugar de la incisión de la piel es el mejor indicador de que se ha producido colocación de la aguja inadecuada. Por último, es fundamental que la pérdida de sangre de la vena porta se controla adecuadamente y cesa por completo antes de la suturing del animal. El uso de una gasa hemostática disminuye en gran medida el riesgo de la pérdida de sangre no controlada de la vena portal después de la inyección. En nuestras manos, la mortalidad relacionada de procedimiento debido a la pérdida de sangre de la vena portal después de la inyección se redujo de 30% a 2% de los ratones con el uso de una gasa hemostática.

Es importante tener en cuenta que el modelo de inyección de la vena porta no replica la cascada metastásica completo, pero está limitado al estudio de la extravasación de células tumorales, tumor de células-nicho interacciones tras la extravasación y el crecimiento tumoral. , Se necesitan con urgencia modelos que reproducen con precisión la cascada metastásica completo al hígado, tal como ocurre en los pacientes. Una limitación adicional del modelo de inyección de la vena porta es que es confundida por el impacto de la cirugía en el host, con la cicatrización de heridas conocido para impactar progresión de la enfermedad 76,77.

El modelo de inyección de la vena porta representa una mejora respecto a otra inyecciónmodelos para el estudio de la metástasis del hígado, incluyendo intracardiaca y modelos intraesplénicos. Específicamente, el modelo de inyección de la vena porta permite el estudio de una mayor gama de progresión de la enfermedad que el modelo intracardíaca, que a menudo está limitado por metástasis concomitantes en otros tejidos. Además, el modelo de la vena porta no se complica por la extirpación del bazo, como se hace en el modelo intraesplénica.

El modelo de inyección de la vena porta podría resultar una herramienta útil para el estudio de la metástasis de hígado en general. metástasis de hígado es el sitio más frecuente de metástasis en adenocarcinomas general, con tasas particularmente altas en los cánceres de páncreas (85% de las metástasis son al hígado), de colon y adenocarcinomas rectales (> 70%), así como de estómago y esofágico (> 30 %) 1. Aunque los modelos de tumor primario espontáneas y ortotópico de los adenocarcinomas de páncreas y colon más fácilmente metástasis en el hígado 78,79, el modelo de inyección en la vena porta puede prove útil para la comprensión del proceso metastásico de estos tipos de cáncer como la entrega controlada de las células tumorales permite evaluaciones bioquímicas, moleculares e histológicos en momentos específicos después de la llegada de las células tumorales. En resumen, el modelo de inyección en la vena portal representa una importante mejora en modelos de metástasis de hígado disponibles de cáncer de mama, y ​​también puede ser aplicable al campo de la metástasis de hígado en general.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar y declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a Alexandra Quackenbush por ayudar con los procedimientos quirúrgicos durante la filmación del protocolo de video, a Hadley Holden por su apoyo histológico, a Sonali Jindal por su aporte sobre la patología tumoral y hepática durante el desarrollo del método, y a Breanna Caruso por la revisión crítica del manuscrito. Las células tumorales mamarias D2A1 y D2.OR fueron un regalo de la Dra. Ann Chambers, las células tumorales D2A1-GFP fueron un regalo del Dr. Jeffrey Green y las células tumorales 4T1 fueron un regalo de la Dra. Heide Ford. Se utilizó el núcleo de microscopía óptica avanzada de OHSU en el Centro Jungers para la obtención de imágenes. El trabajo incluido en este manuscrito incluye financiamiento de NIH/NCI NRSA F31CA186524 (a ETG) y NIH/NCI 5R01CA169175 (a PS).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 1 ml con aguja de calibre 26Jeringa BD309597Para la inyección subcutánea de buprenorfina; Tenga cuidado, las
almohadillas de preparación con alcoholFisher Scientific06-669-62Para la limpieza del abdomen antes de la incisión quirúrgica
Esponjas multiusos, estérilesKendall80444" x 4", úselas sumergidas en solución salina estéril para mantener los intestinos grueso y delgado protegidos e hidratados durante cirugía
Lágrimas ArtificialesRugby 370114Aceite mineral 15%, vaselina blanca 83%; úselo para proteger los ojos durante la cirugía
Buprenorfina HCl, 0,3 mg/mlMfg. by Reckitt BenckiserNDC-12496-0757-1Úselo a 0,05 - 0,1 mg/kg de peso corporal, 1 - 2 veces al día durante 72 horas, inyectado por vía subcutánea
Bupivacaína HCl, 0,5% (5 mg/ml)Mfg. por Humira IncNDC-04091163-01Usar al 0,5%, 1x inmediatamente después de la cirugía, 10 μ l inyectado por vía subcutánea en el sitio de la incisión 
anticuerpo anti-CD45BD Pharmingen550539Uso en inmunofluorescencia multiplex para excluir leucocitos en la identificación de focos metastásicos
Celox™ Gasa hemostática rápidaMedtrade Products Ltd.FG08839011Cortar en trozos de 5 mm², usar para detener el flujo sanguíneo fuera de la vena porta con presión después de la inyección
DepilatorioÚselo para eliminar el vello del área quirúrgica; múltiples proveedores
Clorhexidina, solución al 2%Vet One1CHL008Tenga cuidado, no obtenga clorhexidina en las membranas mucosas ni en los oídos del ratón
anticuerpo anti-CK18Abcamab53118Uso en inmunofluorescencia multiplex para identificar focos metastásicos
Aplicadores con punta de algodón, estérilesFisher Scientific23-400-114Eje de madera de 6" 2 piezas/sobre
DMEM, HyClone con alto contenido de glucosaSH30243.01Base de medios de cultivo celular para usar con las líneas celulares de tumores mamarios D2A1, D2.OR y 4T1
Esterilizadorde perlas de vidrio secoÚselo entre cirugías para esterilizar herramientas de acero inoxidable, tenga cuidado, extremadamente caliente; Múltiples proveedores
Etanol, soluciónUse cuidado inflamable; úselo para limpiar el área quirúrgica según sea necesario; múltiples proveedores
Suero fetal bovinoHyCloneSH30071.03Aditivo para medios de cultivo celular para usar con las líneas celulares de tumores mamarios D2A1, D2.OR y 4T1, uso al 10% en DMEM Gasa de alta glucosa
estérilKendall21462" x 2", uso sumergido en solución de clorhexidina al 2% para la limpieza del abdomen antes de la incisión quirúrgica
anticuerpo anti-proteína fluorescente verdeVector LaboratoriesBA0702Úselo para tinturar para D2A1 marcado con GFP u otras líneas celulares de tumores mamarios
L-glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081Aditivo de medios de cultivo celular para usar con líneas celulares de tumores mamarios D2A1, D2.OR y 4T1, uso a 2 mM (1x) en DMEM
almohadilla térmica de alta glucosa, x 2 - 3Úselo para mantener el calor corporal durante la cirugía y la recuperación; múltiples proveedores
HemotitómetroHausser Scientific1483Para uso en cultivo celular para contar células
Pinzasde acero inoxidable; múltiples proveedores
anticuerpo anti-Heppar-1DakoM7158Uso en inmunofluorescencia multiplex para excluir hepatocitos en la identificación de focos metastásicos
Jeringa de insulina, 0,3 ml, calibre 29BD   324702Para la inyección de bupivacaína en el sitio de sutura; tenga cuidado,
IsofluranoPiramalNDC-66794-017-25administrado al 2,5%
Vaporizador de isofluranoVetEquip911103Tenga cuidado, vaporiza los gases anestésicos
Fuente de luz Usopara visualizar el campo quirúrgico; Múltiples proveedores
Formalina tamponada neutra, 10%Anatech Ltd.135Tenga cuidado, tóxico; utilícelo como fijador de tejidos para los criterios de valoración de la metástasis y la evaluación de la carga metastásica mediante histología
Opal™ kit de fIHC de 4 coloresPerkinElmer, Inc.NEL794001KTUso para la inmunofluorescencia multiplex de Heppar-1/CD45/CK18 para detectar metástasis en el hígado murino
Tijeras deoperación Acero inoxidable; use cuidado, afilado; múltiples proveedores
Penicilina/estreptomicina, 100xCorning30-002-ClAditivo de medios de cultivo celular para uso con líneas celulares tumorales mamarias D2A1, D2.OR y 4T1, uso a 1x en solución salina tamponada con fosfato con alto contenido de glucosa DMEM
Uso en 1x para resuspender células tumorales antes de la inyección, múltiples proveedores
Jeringa de aguja extraíble, 25 μ l, Modelo 1702Hamilton7654-01Para la inyección de la vena porta; Tenga cuidado, especialmente cuando trabaje con agujas cargadas de células tumorales, afiladas cuando la aguja está conectada
MangoAcero inoxidable; múltiples proveedores
Hoja de bisturí, #15Acero al carbono, estéril, tamaño 15; múltiples proveedores
Agujas extraíbles de cubo pequeño, calibre 32Hamilton7803-04Para inyección de vena porta, 1" de longitud, estilo de punta 4, 12 grados; También se pueden utilizar agujas reutilizables de calibre 33 a 34; Tenga cuidado, especialmente cuando trabaje con agujas cargadas de células tumorales,
hipocloritoUse precaución, corrosivo; úselo al 10% para desinfectar el espacio de trabajo y las superficies, múltiples proveedores
solución salina estérilFisher ScientificBP358-212solución de NaCl al 0,9%; alternativamente, puede ser casero y estéril
filtrado Guantes quirúrgicos, estérilesMúltiples proveedores
Suturas Estériles EthiconJ310H4-0 Vitryl recubierto de 27" con aguja de ethalloy cónica 1/2c de 22 mm; Tenga cuidado, afilado
Máquina de anestesia portátil de mesaVetEquip901801Úselo con vaporizador de isoflurano para anestesia de ratón
PinzasAcero inoxidable, dentado, romo; Múltiples proveedores
Toallas Cortinas Estériles Dynarex441018" x 26", para cubrir la almohadilla térmica y proporcionar un espacio de trabajo estéril durante la cirugía
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Para uso en cultivo celular para evaluar la viabilidad, use 1:1 con células en 1x PBS
Tripsina/EDTA, 0.05% (1x)Gibco25300-054Uso en cultivo celular para separar células tumorales de placas de cultivo de tejidos
químico al 70% , hemostáticas de bisturí de sodio afilado de vendaje para el pulgar

Referencias

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