Artículo de método

Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido

DOI:

10.3791/54922

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23 de diciembre de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Sogang University

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Actualmente hay muchas herramientas químicas disponibles para introducir sondas químicas a las proteínas para estudiar su estructura y función. Un método útil es la conjugación de proteínas genéticamente mediante la introducción de un aminoácido no natural que contiene un grupo funcional bioorthogonal. Este informe describe un protocolo detallado para la conjugación de anticuerpo específico del sitio. El protocolo incluye detalles experimentales para la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida-, y la reacción de conjugación por cicloadición de azida-alquino cepa promovido (SPAAC). Esta reacción cepa promovido procede por simple mezcla de las moléculas que reaccionan a pH y temperatura fisiológica, y no requiere reactivos adicionales, tales como iones de cobre (I) y ligandos quelantes de cobre. Por lo tanto, este método sería útil para la conjugación de proteínas en general y el desarrollo de conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC).

Introducción

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Desde que se informó de la incorporación genética de -methoxyphenylalanine p en Escherichia coli, 1 más de 100 aminoácidos no naturales (UAAs) se han incorporado con éxito en varias proteínas. 1-3 Entre estos UAAs, los aminoácidos que contienen grupos funcionales bioorthogonal han sido ampliamente estudiados y representan la proporción más grande. Los grupos funcionales bioorthogonal utilizados en los UAAs incluyen cetona, 4 azida, 5 alquino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturados amida, 9 norboneno, 10 transcyclooctene, 11 y biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 A pesar de que cada grupo funcional tiene sus ventajas y desventajas, los aminoácidos que contienen azida se han utilizado más ampliamente para la conjugación de la proteína. p -Azidophenylalanine (AF), uno de los aminoácidos que contienen azido-, está fácilmente disponible, y su incorporación efficiency es excelente. Las proteínas mutantes que contienen este aminoácido se pueden hacer reaccionar con alquinos de cicloadición catalizada con cobre o con cyclooctynes ​​por SPAAC. 12-20

Recientemente, los productos biofarmacéuticos han estado atrayendo una gran atención en la industria farmacéutica. El conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) es una clase de anticuerpos terapéuticos que son ventajosos debido a su capacidad para la terapia dirigida para el tratamiento de cánceres humanos 21 y otras enfermedades. Más de 50 ADC están actualmente en ensayos clínicos, y el número está aumentando rápidamente. En el desarrollo de ADCs, muchos factores necesitan ser considerados para maximizar la eficacia y minimizar los efectos secundarios. Entre estos factores, una reacción de conjugación eficaz y específica de sitio para formar un enlace covalente entre un anticuerpo y un fármaco es crítica. La eficiencia deseada y especificidad en la reacción de conjugación se puede lograr mediante conjugación con un grupo funcional en un bioorthogonalno natural de aminoácidos que se incorpora específicamente en un anticuerpo. 22-26 Aquí, se presenta un protocolo para incorporar específicamente en el sitio AF en un fragmento de anticuerpo y el conjugado del fragmento de anticuerpo mutante con una sonda de bioquímica.

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Protocolo

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1. Construcción del plásmido

  1. Construir un plásmido de expresión (pBAD-HerFab-L177TAG) que exprese el gen del anticuerpo diana (pBAD-HerFab-WT) con un 6-Su etiqueta, y sustituir el codón para leucina-177 con el codón ámbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénesis dirigida al sitio convencional.
    Véase la Tabla de Materiales.
  2. Construir otro plásmido de expresión (pEVOL-AFRS) que contiene los genes para el evolucionado tRNA Tyr y aminoacil-tRNA sintetasa par (aaRs). Utilice el vector plásmido especialmente diseñado, pEVOL, para su incorporación eficiente de UAAs. Los protocolos detallados de información y plásmido de clonación se describen en el informe anterior. 28
  3. Obtener ADN plásmido de alta calidad mediante el uso de kits de preparación de plásmidos disponibles comercialmente. La relación 260/280 de ~ 1,8 es óptimo para el ADN purificado. Si es necesario, llevar a cabo la electroforesis en gel de agarosa al 1% para comprobar la pureza de la DNA.

2. Preparación cultura

  1. La electroporación
    1. Añadir cada ADN 1 l de pEVOL-AFRS 28 y pBAD-HerFab-L177TAG a 20 l cepa de Escherichia coli DH10β. Mezclar con cuidado, usando una pipeta. Los plásmidos se pueden transformar juntos o en reacciones independientes.
    2. Para cubetas de 0,1 cm, establecer la configuración de electroporación a 25 mF y 2,5 kV.
    3. Insertar la cubeta en el portaobjetos de la cámara impactante. Empuje la corredera en la cámara hasta que la cubeta haga contacto con los electrodos de la cámara.
    4. Pulso vez pulsando el botón de pulso hasta que la máquina emite un pitido electroporación.
    5. Añadir 1 ml de caldo súper óptima con represión catabólica (SOC) medio que contiene 2% (w / v) triptona, 0.5% (w / v) de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl 2, y glucosa 20 mM a la cubeta de forma rápida y transferir la mezcla a un tubo de ensayo. Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C con agitación.
    6. Spread transformado células de E. coli en caldo de Lisogenia (LB) placas de agar que contenían los antibióticos apropiados (35 mg / ml de cloranfenicol y 100 mg / ml de ampicilina para la selección de pEVOL-AFRS y pBAD-HerFab-L177TAG, respectivamente). Las placas se incuban a 37 ° C durante 12 h.
  2. preparación de cultivo
    1. Se inocula una sola colonia transformada en medio que contiene 5 ml de LB antibióticos. Incubar durante 12 horas a 37 ° C con agitación.

3. Expresión y purificación de HerFab-L177AF

  1. Expresión de HerFab-L177AF
    1. Transferir el cultivo primario (5 ml) en 200 ml de LB medio que contiene ampicilina (100 mg / ml) y AF (1 mM), seguido de incubación a 37 ° C con agitación.
      NOTA: mM AF 100 solución madre (10 ml) se preparó disolviendo 206 mg AF en 100 mM de ácido clorhídrico (10 ml, el volumen final).
    2. Añadir 2 ml de 1,6 M arabinosa (16mM concentración final) cuando el cultivo alcanzó la fase logarítmica (DO550 = 0,8, DO = densidad óptica). Incubar durante 12 horas a 30 ° C con agitación.
    3. Cosecha células por centrifugación a 11.000 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y congelar el sedimento a -20 ° C.
  2. Lisis celular
    1. Resuspender los sedimentos celulares en 20 ml de tampón de lisis que contiene 30 mM periplásmico Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 20% de sacarosa, y 0,2 mg / ml de lisozima, y ​​se incuba la mezcla durante 1 h a 37 ° C.
    2. Centrifugar el lisado de células a 18.000 xga 4 ° C durante 15 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y desechar el sedimento.
  3. Cromatografía de afinidad Ni-NTA
    1. Añadir suspensión de resina Ni-NTA a cada tubo de centrífuga (400 l de resina para una cultura 200 ml), y se mezcla suavemente a 4 ° C durante 1 h.
    2. Se vierte la suspensión en una columna de polipropileno y lavar la resina tres veces con 5 ml de lavado buffer que contiene 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazol 20 mM, y NaCl 300 mM.
    3. Eluir el anticuerpo diana con tampón de elución 300 l que contiene mM NaH 2 PO 4 50 (pH 8,0), imidazol 250 mM, y NaCl 300 mM.
    4. Determinar la concentración de la proteína mutante por ensayo de proteínas de Bradford 29 o mediante la medición de la absorbancia a 280 nm. Calcular el coeficiente de extinción (75.866 M -1 cm -1) para HerFab-L177AF a 280 nm mediante la calculadora coeficiente de extinción de proteínas utilizando el coeficiente de extinción (2.471 M -1 cm -1) para la FA.
      NOTA: La secuencia de aminoácidos de HerFab se puede encontrar en el sitio web de NCBI (GI: 783 282 791 y GI: 783282792).

4. La conjugación de Purificada HerFab-L177AF con Acetileno Sondas Uso de cicloadición de azida-alquino Strain-promovido (SPAAC)

  1. Añadir 20 l de Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo) en H2O (20081; M concentración final) a una solución de 10 l de HerFab-L177AF (10 mM de concentración final) en tampón de fosfato que contiene 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) y NaCl 100 mM.
    NOTA: Como alternativas, cyclooctyne difluorado (DIFO) y biciclo [6.1.0] derivados nonino (BCN) también están disponibles para la misma aplicación.
  2. Deje que la reacción de cicloadición cepa ascendido a proceder durante 6 horas a 37 ° C. Si se utiliza una sonda sensible a la luz (por ejemplo, Cy5.5), cubra el recipiente de reacción con papel de aluminio.
  3. Se purifica el HerFab etiquetados de acuerdo con el paso 5.

5. Purificación de HerFab Etiquetada

  1. Añadir 500 l de muestra a una columna de filtro giratorio centrífugo.
  2. Se centrifuga la columna de centrifugación a 14.000 xga 4 ° C durante 15 minutos.
  3. Descarte el filtrado y la transferencia purificados muestra de la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  4. Como una alternativa al paso de 5.1 5.3, realice Purificación por diálisis contra el mismo tampón.
  5. Almacenar el HerFab marcada purificada a 4 ° C.

6. SDS-PAGE análisis de HerFab Etiquetada

  1. Añadir 5 l LDS tampón de muestra de proteína que contiene 106 mM de Tris · HCl, mM de base 141 Tris (pH 8.5), 2% LDS, 10% de glicerol, EDTA mM 0,51, 0,22 mM SERVA azul G250, y fenol 0,175 mM roja a 13 l de purificado marcado HerFab (7,8 M o 0,38 mg / ml) en presencia (+) o ausencia (-) de 2 l de ditiotreitol (DTT, 100 mM de concentración final). Incubar la mezcla a 95 ° C durante 10 min.
  2. Una el Bis-Tris casete de gel de SDS-PAGE al 4-12% a la celda de electroforesis y añadir tampón de desarrollo. Cargar las muestras de proteínas conjugadas y el marcador de peso molecular pre-manchada. Realizar electroforesis en gel durante 35 minutos a 200 V.
    Nota: Mantenga la celda de electroforesis en la oscuridad durante todo el período de minimizar foto-blanqueo del fluoróforo.
  3. Después de la electroforesis, la transferencia deel gel a un escáner gel fluorescente, y escanear de emisión de fluorescencia a la longitud de onda apropiada. Para Cy5.5, utilice el modo de Cy5 en el software del escáner.
  4. Tinción del gel con una tinción de proteínas comercial.

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Resultados

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En este estudio, un fragmento de anticuerpo era específicamente en el sitio conjugado con un fluoróforo mediante la incorporación de un aminoácido que contiene azida-en el fragmento y hacer reaccionar el fragmento de anticuerpo mutante con un cyclooctyne tensa (Figura 1). HerFab fue seleccionado como el fragmento de anticuerpo de destino en la que la FA fue incorporado como un aminoácido que contiene azida. Para elegir el residuo en HerFab para la sustitución con FA, se ...

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Discusión

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La incorporación genética de aminoácidos no naturales en proteínas tiene varias ventajas sobre otros métodos utilizados para la modificación de proteínas. 1-3 Una de las ventajas importantes es su aplicabilidad general a cualquier tipo de proteína. En principio, no hay limitación en la selección de una proteína diana y un sitio diana de la proteína. Sin embargo, la sustitución de un residuo importante estructural o funcionalmente con un UAA puede dar lugar a la alteración de la estructura y función de la prot...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1. Construcción > plásmido
plásmido fuerte pBAD_HerFab_L177TAGOpcionalmente contiene el codón de parada ámbar (TAG) en la posición deseada. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plásmido pEvol-AFRSYoung, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., y Schultz, P. G. Un sistema mejorado para la mutagénesis de aminoácidos no naturales en E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10BInvitrogenC6400-03Expression
Host Plasmid Mini-prep kitNucleogen5112200/pack
AgaroseIntron biotechnology32034500  g
Bromuro de etidioAlfa AesarL074821 g
LB CaldoBD Difco244620500  g
2. Preparación de cultivos
2.1 Electroporación
Micro emisor de impulsosBIO-RAD165-2100
Micro cubeta de impulsosBIO-RAD165-20890.1  cm espacio entre electrodos, paquete de 50
Ampicilina SódicaWako018-1037225 g
CloranfenicolAlfa AesarB2084125 g
AgarSAMCHUN214230500 g
SOC medioSigmaS1797100 mL
3. Expresión y purificación de HerFab-L177AF
3.1 Expresión de Herfab-L177AF
p-azido-L-fenilalanina (AF)BachemF-3075.00011 g
L(+)-Arabinosa, 99%Acros104981000100 g
Ácido clorhídrico, 35~37%SAMCHUNH0256500 mL
3.2 Lisis Celular
Tris(hidroximetil)aminometano, 99%SAMCHUNT1351500 g
EDTA sal disódica dihidratada, 99.5%SAMCHUNE00641 kg
SacarosaSigmaS9378500 g
LisozimaSiyaku126-06711 g
3.3 Cromatografía de afinidad Ni-NTA
Resina de Ni-NTAQIAGEN3021025 mL
Columna de polipropilenoQIAGEN3492450/paquete, capacidad de 1 mL
Imidazol, 99%SAMCHUNI05781 kg
Fosfato de sodio monobásico, 98%SAMCHUNS09191 kg
Cloruro de sodio, 99%SAMCHUNS29071 kg
4. Conjugación de HerFab-L177AF purificado con sondas de alquino utilizando cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC)
Cy5.5-ADIBO FutureChemFC-61191 mg
5. Purificación de
filtros centrífugos HerFabAmicon Ultra 0.5 mLMILLIPOREUFC50039696/paquete, 500 μ L capacity
6. Análisis SDS-PAGE de escaneo de gel fluorescente y HerFab marcado
1,4-ditio-DL-treitol, DTT, 99.5%Sigma1070898400110 g
Tampón de muestra NuPAGE LDS, 4xThermofisherNP000710 mL
Tampón de funcionamiento MESThermofisherNP0002500 mL
Nupage Novex 4-12% Geles SDS PAGEThermofisherNO0321de 12 pocillos
Coomassie Brilliant Blue R-250Wako031-1792225 g
Typhoon 9210 generador de imágenes de modo variableAmersham Biosciences
etiquetados

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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