Aquí, presentamos un protocolo para introducir sondas químicas específicas en un fragmento de anticuerpo mediante la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida, y posteriormente acoplar la azida con una sonda química mediante cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC).
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Artículo de método
Eficiente y específica del sitio del anticuerpo etiquetado por cicloadición de azida-alquino Strain-promovido
En este artículo
Resumen
Resumen
Actualmente hay muchas herramientas químicas disponibles para introducir sondas químicas a las proteínas para estudiar su estructura y función. Un método útil es la conjugación de proteínas genéticamente mediante la introducción de un aminoácido no natural que contiene un grupo funcional bioorthogonal. Este informe describe un protocolo detallado para la conjugación de anticuerpo específico del sitio. El protocolo incluye detalles experimentales para la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida-, y la reacción de conjugación por cicloadición de azida-alquino cepa promovido (SPAAC). Esta reacción cepa promovido procede por simple mezcla de las moléculas que reaccionan a pH y temperatura fisiológica, y no requiere reactivos adicionales, tales como iones de cobre (I) y ligandos quelantes de cobre. Por lo tanto, este método sería útil para la conjugación de proteínas en general y el desarrollo de conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC).
Introducción
Desde que se informó de la incorporación genética de -methoxyphenylalanine p en Escherichia coli, 1 más de 100 aminoácidos no naturales (UAAs) se han incorporado con éxito en varias proteínas. 1-3 Entre estos UAAs, los aminoácidos que contienen grupos funcionales bioorthogonal han sido ampliamente estudiados y representan la proporción más grande. Los grupos funcionales bioorthogonal utilizados en los UAAs incluyen cetona, 4 azida, 5 alquino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturados amida, 9 norboneno, 10 transcyclooctene, 11 y biciclo....
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Protocolo
1. Construcción del plásmido
- Construir un plásmido de expresión (pBAD-HerFab-L177TAG) que exprese el gen del anticuerpo diana (pBAD-HerFab-WT) con un 6-Su etiqueta, y sustituir el codón para leucina-177 con el codón ámbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénesis dirigida al sitio convencional.
Véase la Tabla de Materiales. - Construir otro plásmido de expresión (pEVOL-AFRS) que contiene los genes para el evolucionado tRNA Tyr y aminoacil-tRNA sintetasa par (aaRs). Utilice el vector plásmido especialmente diseñado, pEVOL, para su incorporación eficiente de UAAs. Los protocolos detallados de....
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Resultados
En este estudio, un fragmento de anticuerpo era específicamente en el sitio conjugado con un fluoróforo mediante la incorporación de un aminoácido que contiene azida-en el fragmento y hacer reaccionar el fragmento de anticuerpo mutante con un cyclooctyne tensa (Figura 1). HerFab fue seleccionado como el fragmento de anticuerpo de destino en la que la FA fue incorporado como un aminoácido que contiene azida. Para elegir el residuo en HerFab para la sustitución con FA, se .......
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Discusión
La incorporación genética de aminoácidos no naturales en proteínas tiene varias ventajas sobre otros métodos utilizados para la modificación de proteínas. 1-3 Una de las ventajas importantes es su aplicabilidad general a cualquier tipo de proteína. En principio, no hay limitación en la selección de una proteína diana y un sitio diana de la proteína. Sin embargo, la sustitución de un residuo importante estructural o funcionalmente con un UAA puede dar lugar a la alteración de la estructura y función de la prot.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1. Construcción > plásmido | |||
| plásmido fuerte pBAD_HerFab_L177TAG | Opcionalmente contiene el codón de parada ámbar (TAG) en la posición deseada. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plásmido pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., y Schultz, P. G. Un sistema mejorado para la mutagénesis de aminoácidos no naturales en E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression |
| Host Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Bromuro de etidio | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Caldo | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Preparación de cultivos | |||
| 2.1 Electroporación | |||
| Micro emisor de impulsos | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro cubeta de impulsos | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm espacio entre electrodos, paquete de 50 |
| Ampicilina Sódica | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Cloranfenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medio | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expresión y purificación de HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expresión de Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-fenilalanina (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinosa, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Ácido clorhídrico, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Lisis Celular | |||
| Tris(hidroximetil)aminometano, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA sal disódica dihidratada, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sacarosa | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lisozima | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Cromatografía de afinidad Ni-NTA | |||
| Resina de Ni-NTA | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Columna de polipropileno | QIAGEN | 34924 | 50/paquete, capacidad de 1 mL |
| Imidazol, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Fosfato de sodio monobásico, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Cloruro de sodio, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugación de HerFab-L177AF purificado con sondas de alquino utilizando cicloadición de azida-alquino promovida por cepa (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purificación de | |||
| filtros centrífugos HerFabAmicon Ultra 0.5 mL | MILLIPORE | UFC500396 | 96/paquete, 500 μ L capacity |
| 6. Análisis SDS-PAGE de escaneo de gel fluorescente y HerFab marcado | |||
| 1,4-ditio-DL-treitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| Tampón de muestra NuPAGE LDS, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| Tampón de funcionamiento MES | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% Geles SDS PAGE | Thermofisher | NO0321 | de 12 pocillos |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 generador de imágenes de modo variable | Amersham Biosciences |
Referencias
- Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
- Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
- Liu, C. C., Schultz, P. G.
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Reimpresiones y permisos
