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Resolución de imagen subnanométrica con modulación de amplitud en microscopía de fuerza atómica en Líquido

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DOI:

10.3791/54924

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20 de diciembre de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Durham University

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En este artículo

Resumen

Se presenta un método para lograr imágenes de alta resolución subnanométricas con (modo de descarga) con modulación de amplitud en la microscopía de fuerza atómica líquido. El método se muestra en microscopios de fuerza atómica comerciales. Se explica la razón de ser de nuestras opciones de parámetros y sugerir estrategias para la optimización resolución.

Resumen

La microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una técnica bien establecida para la obtención de imágenes a nanoescala de muestras en aire y en líquido. Estudios recientes han demostrado que cuando se opera en modo de modulación de amplitud (tapping), se pueden lograr imágenes de resolución a nivel atómico o molecular en una amplia gama de muestras blandas y duras en líquido. En estas situaciones, las pequeñas amplitudes de oscilación (SAM-AFM) mejoran la resolución al explotar el líquido solvatado en la superficie de la muestra. Aunque la técnica se ha aplicado con éxito en campos tan diversos como la ciencia de los materiales, la biología y la biofísica y la química de superficies, la obtención de imágenes de alta resolución en líquido puede seguir siendo un reto para los usuarios novatos. Esto se debe, en parte, a la gran cantidad de variables a controlar y optimizar, como la elección del voladizo, la preparación de la muestra y la correcta manipulación de los parámetros de imagen. Aquí, presentamos un protocolo para lograr imágenes de alta resolución de muestras duras y blandas en fluidos utilizando SAM-AFM en un instrumento comercial. Nuestro objetivo es proporcionar una guía práctica paso a paso para lograr imágenes de alta resolución, incluyendo la limpieza y preparación del aparato y la muestra, la elección del voladizo y la optimización de los parámetros de imagen. Para cada paso, explicamos la justificación científica detrás de nuestras elecciones para facilitar la adaptación de la metodología al sistema específico de cada usuario.

Introducción

Desde su invención, hace tres décadas, microscopía de fuerza atómica (AFM) 1 se ha establecido como una técnica de elección para la investigación de muestras en la nanoescala, especialmente donde un promedio de más áreas superficiales macroscópicas no es posible y se requiere información local. En una medición AFM típica, la deflexión de un voladizo flexible se utiliza para cuantificar la fuerza de interacción entre un pequeño número de moléculas y una punta ultrasharp montado en el extremo del voladizo. Dependiendo del tipo de las interacciones y de las escalas de tiempo considerado, una amplia gama de información se puede derivar, incluyendo las propiedades viscoelásticas de las membranas biológicas suaves 2,3, la fuerza de una sola sustancia química o enlace molecular de 4,5, los detalles de un atomísticos superficie 6-8, la magnética 9, capacitivos 10, la realización 11, térmicas 12,13 y 14 propiedades químicas de las muestras 15. Parte del éxito de AFM es su capacidad para funcionar en una amplia gama de materiales 16 y en múltiples entornos como de vacío 17, gas o líquido 11,18 19,20, ya que no se basa en una fuerza específica entre la sonda y la muestra .

En la práctica, sin embargo, que opera el AFM, en condiciones distintas de ambiente puede ser un reto y muchos resultados publicados todavía se obtienen en el aire. Una dificultad añadida viene del hecho de que por lo general es necesario para operar el AFM en modo dinámico (punta vibratoria) con el fin de preservar tanto punta y la muestra, evitando grandes fuerzas de fricción. Aunque más difícil, operación dinámica en principio, puede dar más información acerca de la muestra analizada, y sin pérdida de resolución espacial. Durante la última década, el campo de la AFM dinámico en líquido ha evolucionado de manera importante, desde el advenimiento de la velocidad de vídeo-AFM 21 - 23, a las mediciones multifrecuencia 24,25 y subnanométrica imágenes de las estructuras de hidratación en las interfases 26 - 31. AFM operación mientras se está inmerso en un líquido ahora se utiliza de forma rutinaria en la biología y la biofísica 32 - 36, la investigación de polímeros 37, electroquímica 38 - 40 y las interfaces de caracterización sólido-líquido 41 - de 44. La presencia de líquido alrededor de la voladizo vibrante altera considerablemente su dinámica 45, así como la interacción entre la punta y la muestra 29,42. Cuando se usa apropiadamente, el líquido puede ser explotado para mejorar la formación de imágenes de resolución 26,29, con una mejora típica de casi un orden de magnitud en comparación con la mejor resolución alcanzada en condiciones ambientales 46.

En AFM, la resolución espacial más alta alcanzable para una medición particular, depende tanto de la calidad de la propia AFM y la naturaleza de tque la interacción sondeó 20,47,48. En la actualidad, la mayoría de gama alta, AFM disponibles en el mercado presentan niveles de ruido que se acercan a la de límite térmico 12 por lo que el factor determinante para la resolución es por lo general la interacción punta-muestra. Es efectivamente el gradiente espacial de esta interacción que determina la resolución: mediciones basadas en corto alcance, en descomposición rápidamente interacción producen resultados resolución más alta que cuando las interacciones de largo alcance están en juego. En líquido, las fuerzas de solvatación puede mejorar la resolución de formación de imágenes, ya que tienden a desaparecer durante sólo unos pocos diámetros moleculares de líquido (típicamente <1 nm) cuando se aleja de la superficie de la muestra 49. Estas fuerzas se originan a partir de la interacción entre las moléculas del líquido y la superficie de la muestra. Un líquido con una fuerte afinidad por la superficie tenderá a ser más ordenada y menos móvil que el líquido a granel en la interfaz con la muestra 29,42,50. Como resultado,se necesita más energía para una punta del AFM que vibra para desplazar moléculas de líquido interfacial de líquidos a granel 42, lo que hace la medición altamente sensible a las variaciones locales en las propiedades del líquido interfacial en la nanoescala -el paisaje solvatación.

Con el fin de explotar las fuerzas de solvatación, varios aspectos prácticos deben ser tomadas en consideración. En primer lugar, la amplitud de oscilación de la punta tiene que ser comparable a la gama de las fuerzas de solvatación, típicamente <1 nm. En segundo lugar, el líquido utilizado debe formar un paisaje solvatación bien definida en la superficie de la muestra. Macroscópicamente, esto es equivalente a requerir un líquido 'humectación' para la muestra considerada. Por ejemplo, en el agua que es más fácil lograr la resolución a nivel molecular en mica hidrófilo que en 42,51 grafito hidrofóbico. Finalmente, la constante de resorte de la ménsula de soporte de la punta debe ser seleccionado apropiadamente 52,53. Cuando se trabaja en estos estafacondiciones, el AFM no sólo proporciona imágenes a nivel molecular de la interfaz, sino que también se deriva información sobre la afinidad de la muestra-líquido local que se puede utilizar para obtener información química sobre la superficie de la muestra 54.

Los modos dinámicos más comunes de operación de AFM en líquido son de modulación de amplitud (AM, también "modo de descarga ') AFM y la frecuencia de modulación de (FM) AFM. En el primer caso 55, la punta raster-escanea la muestra, mientras que su amplitud de la vibración se mantiene constante por un bucle de retroalimentación que continuamente re-ajusta la distancia punta-muestra. Una imagen topográfica de la muestra se obtiene a partir de la corrección aplicada por el bucle de realimentación. En FM-AFM 28,41,56, es la frecuencia de oscilación del cantilever / punta que se mantiene constante, mientras que la punta escanea la muestra. Ambas técnicas proporcionan una resolución topográfica comparable en líquido 36,57. La cuantificación de la interacción punta-muestra tiende a ser más straightforward y precisa en FM-AFM, pero AM-AFM es más fácil de implementar, más robusto y permite trabajar con voladizos más suaves, algo útil para el estudio de muestras fácilmente deformables o delicados. Significativamente, AM-AFM está más extendido entre los usuarios de AFM, en parte por razones históricas, sino también debido al hecho de que es técnicamente más fácil de controlar.

Aunque la amplitud se mantiene constante mediante el circuito de retroalimentación durante la exploración AM-AFM, se permite que el retraso de fase entre la oscilación de la punta y la oscilación de accionamiento para cambiar libremente. El atraso de fase puede proporcionar información útil sobre las interacciones punta-muestra, por estar relacionados con la energía disipada durante la oscilación de la punta en la interfaz con la muestra 58. Por lo tanto la eliminación de imágenes se puede adquirir de forma simultánea a la imagen topográfica, y es a menudo complementaria para poner de relieve la heterogeneidad de la superficie de la muestra. formación de imágenes de fase se ha utilizado para diversos mapeo de interacciones, incluyendo el direct mapeo de energía de adhesión 42, 58 propiedades viscoelásticas y el paisaje hidratación de una interfaz 44.

En la práctica, la obtención de imágenes de alta resolución en líquido permanece no trivial, debido al gran número de parámetros a controlar, y la ausencia de un protocolo simple, sistemática que funciona en cada situación. La calidad de imagen general depende de la geometría en voladizo y la elasticidad, la química de punta, la amplitud de oscilación, y la rigidez de la muestra, entre otros 55. mediciones de AFM son también, por definición, perturbative al sistema. Como resultado, el cambio de las variables de imagen y las condiciones ambientales sin consideraciones apropiadas puede dar lugar a dificultades en la reproducción y / o observaciones misrepresentative ya resultados falsos.

A continuación, presentamos nuestro protocolo para lograr imágenes de alta resolución de muestras duras y blandas en solución, utilizando instrumentos comerciales operados en amplitude-modulación. Nuestro objetivo es ofrecer un procedimiento práctico para la optimización de los principales parámetros que pueden influir en la resolución sobre diferentes muestras, explicando en cada caso la justificación de nuestras elecciones de los principios físicos que subyacen al proceso de formación de imágenes. Detallamos un enfoque paso a paso, desde la limpieza y preparación del substrato, a elección del voladizo, el ajuste de los parámetros de imagen y resolución de problemas problemas comunes. Al explicar los fundamentos científicos detrás de nuestras decisiones y procedimientos para alta resolución debería ayudar a tomar decisiones racionales para la adaptación de la metodología, y servir como punto de partida para nuevos sistemas de formación de imágenes.

A lo largo de este texto utilizamos AM para referirse al modo de funcionamiento con modulación de amplitud de un AFM. Nos referimos a la parámetro de realimentación mantiene constante durante ya sea la desviación en voladizo (modo de contacto) o amplitud de oscilación (modo AM) como el valor de consigna. En el modo AM, el voladizo es accionado externamenteya sea por una oscilación acústica o por un láser de impulsos se centró en la base del voladizo. La amplitud de la unidad es la intensidad de la señal oscilatoria externa. El valor absoluto de la amplitud de excitación necesaria para lograr una amplitud de oscilación dada del voladizo depende de muchos parámetros, tales como el método de la conducción (acústico, fototérmica o magnéticamente), la fijación en voladizo y los parámetros (rigidez, geometría) y la alineación de láser. El valor exacto de la amplitud de la unidad, por lo tanto no es relevante pero se ajusta en cada experimento con el fin de proporcionar una amplitud de oscilación apropiado (y cuantificable) del voladizo. Cuando el voladizo accionado está lejos de la muestra y no amortiguación de su vibración se produce a través de interacciones punta-muestra, su amplitud de oscilación se llama la amplitud de oscilación libre. A medida que la punta vibratoria se acerca a la superficie de la muestra, su amplitud comienza a disminuir. Si se activa la regeneración, el Z-piezo constantly volver a ajustar su extensión para que la quilla a la amplitud nominal ajustada, constante. El valor de consigna normalmente es siempre menor que la amplitud libre. Es común referirse a la relación de punto de ajuste, la relación de la amplitud de consigna (amplitud de imagen) sobre la amplitud libre. Cuanto menor sea la relación de consigna, la más dura de las condiciones de formación de imágenes son.

Protocolo

1. Limpieza de herramientas y otras superficies

NOTA: Cuando el objetivo de alta resolución, cualquier forma de contaminación puede tener consecuencias perjudiciales. Por tanto, es necesario asegurar todas las herramientas utilizadas para manipular la muestra, sustrato o AFM consejos se limpian a fondo. Lo siguiente se aplica a cualquier superficie o instrumento (por ejemplo, pinzas) que puedan entrar en contacto con la muestra, de consola, o célula AFM, incluyendo la etapa propia muestra.

  1. Bath-sonicar los instrumentos en agua ultrapura (18,2 mO, <5 ppm orgánicos), seguido de isopropanol (99,7% de pureza), seguido de agua de nuevo ultrapura, cada uno para 10 min. Cuando sea posible, utilice isopropanol bajo una campana de extracción para reducir la inhalación de humos.
  2. Seca bajo un flujo de nitrógeno.
  3. Si inmersión total no es posible (por ejemplo, para el titular de voladizo / electrónica), físicamente limpia la superficie limpiando con una sola capa, tejidos de baja pelusa (tejidos ligeros escobillas) empapado en ultrapure agua, isopropanol y agua ultrapura, secuencialmente. Deje que la superficie se seque al aire (generalmente dentro de 15 a 30 min).

2. Preparación del substrato

NOTA: El sustrato designa la superficie sólida de soporte directamente las muestras, típicamente en contacto físico con el escáner AFM y la muestra. La mayoría de AFMs tienen una montura magnética y discos de acero se pueden utilizar, pero el mismo protocolo también es adecuado para sustratos tales como portaobjetos de vidrio. Aquí asumimos un disco de acero sobre la que se fija un disco de mica. El objetivo de este procedimiento es limitar lo más posible las fuentes externas de contaminación que pueden afectar la formación de imágenes. Los guantes deben ser usados ​​en todo momento.

  1. Bath-sonicar el disco de muestra de acero en agua ultrapura (18,2 mO), seguido de isopropanol, y por último por el agua ultrapura de nuevo, cada uno por 10 min.
  2. Se secan los discos bajo un flujo de nitrógeno.
  3. Preparar una pequeña cantidad de pegamento epoxi con reactivos mezclados a fondo y el lugar 10 ~81; l en el disco de acero.
  4. Colocar el sustrato (mica moscovita, SiO 2 cristal, vidrio, etc.) para el disco de acero mediante la aplicación de presión sobre el sustrato. Deje que el epoxi se cure durante varias horas a una temperatura elevada (ver especificaciones del fabricante).
  5. Asegúrese de que no epoxi está expuesto directamente al aire, alrededor de los bordes del sustrato. Esto ocurrirá si se utiliza una cantidad excesiva de epoxi y puede llegar a ser una fuente de contaminación.
    1. Para un sustrato de mica, presione firmemente ~ cinta adhesiva de 2,5 cm de ancho sobre el sustrato, de modo que toda la cara está cubierta, y sin problemas despegarlo. Use cinta adhesiva ligeramente, y la cáscara de la mica tirando paralela a la superficie. El material eliminado es visible en la cinta. Repita este proceso 2-3 veces, hasta que la mica es lisa como un espejo en el ojo.
    2. Para el vidrio / SiO2, si se requiere una nueva modificación química de la superficie, repetir la rutina de baño de ultrasonidos de pasos 2.1-2.2. Como alternativa, utilice Uunidad de exposición V (18 W lámparas germicidas UV-C) durante 30-60 minutos, dependiendo de alimentación) para pirolizar los compuestos orgánicos que pueden quedar en la superficie. Este procedimiento también hace la superficie más hidrófila sin aumentar significativamente la rugosidad.

3. Preparación de voladizo y Tip

  1. Sumergir el chip en voladizo en un baño de isopropanol, seguido de agua ultrapura, cada uno por 60 min.
  2. Si el voladizo / punta requiere una limpieza exhaustiva (por ejemplo, después de un almacenamiento prolongado en el cuadro de gel), añadir un remojo de 30 minutos en acetona (> 99,5% de pureza) antes de la etapa 1 (véase también la sección dedicada a la contaminación). El almacenamiento de los consejos en cajas de gel es, en nuestra experiencia, una de la principal fuente de contaminación que puede ocurrir muy rápidamente 59.
  3. Exponer la punta a los rayos UV se iluminan brevemente (<5 min) con el fin de favorecer la formación de sitios de hidratación estables 60. Evitar la sobreexposición veces más largos, ya que puede dañar la punta o incREase su radio de curvatura.
  4. Insertar el voladizo en el soporte en voladizo del AFM y la pipeta ~ 50 l de solución de imagen (siendo investigado la naturaleza de la solución dependerá de la muestra, pero en este caso usar una solución de 10 mM de cloruro de rubidio en agua ultrapura) sobre el voladizo y la punta de pre-mojado; Esto limitará la aparición de burbujas de aire cuando se acerca a la muestra.

4. Puesta en marcha de AFM de la célula

  1. Montar el disco de muestra y el sustrato en la etapa de la muestra y añadir una gota de líquido de imágenes (líquido típicamente de 2-3 mm de grosor en su punto más alto).
  2. Conectar el soporte voladizo a la AFM.
  3. Llevar el voladizo y de la muestra en estrecha proximidad con el fin de formar un puente capilar entre los fluidos en el voladizo / punta y la muestra.

5. Inicialización de Medición y Calibración de voladizo

  1. Alinear el láser de medición (generalmente rojo) cerca de la punta-end del voladizo. Dependiendo del modelo de AFM, hacerlo bien a través de controles de software o mediante el ajuste manual de la posición del láser. Adquirir espectro térmico del voladizo en líquido (véase la Figura 1A). El proceso registra las fluctuaciones térmicas del voladizo utilizando el láser, a fin de encontrar la frecuencia de resonancia principal del voladizo (modo propio fundamental). En la mayoría de AFM moderno, esto se realiza a través de procedimientos automatizados en los controles de software, pero los detalles puede variar de AFM de AFM.

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Figura 1: Ajuste y calibración del voladizo. A: espectro de ruido térmico de deflexión vertical del voladizo (negro) con un ajuste oscilador armónico simple (SHO) del modo propio fundamental (rojo). Aquí, la resonancia es de 18,7 kHz en agua. Las tres primeras frecuencias de resonancia que corresponden a los tres primeros modos de vibración de flexión son highlighted con flechas azules. B: Calibración de inverso óptico palanca de sensibilidad del voladizo. La desviación lineal de la voladizo presionado contra una superficie rígida (no deformable) se utiliza para medir el factor de conversión (InvOLS) entre la deformación medida en voltios y el valor correspondiente en nanómetros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Grabar una deflexión frente a la curva distancia con el voladizo sobre un sustrato rígido (por ejemplo, mica o de vidrio) y calibrar la desviación mediante la imposición de que la pendiente de la curva en la zona de desviación lineal (como en la figura 1B) es la unidad 61-63.
    NOTA: Este proceso encuentra el factor de conversión entre la deformación medida sobre el fotodetector (en voltios) y la deflexión real de la voladizo (en nanómetros) - known como la inversa de la palanca óptico Sensibilidad (InvOLS). La calibración puede dañar la punta, por lo que es mejor para llevar a cabo después de que todas las medidas se completaron. Utilice el valor InvOLS derivada de otra voladizo del mismo tipo durante un experimento anterior para obtener una estimación (normalmente> 90% exacto) de la amplitud real antes de la calibración.
  2. Montar el pico de resonancia en el espectro térmico con un sencillo modelo de oscilador armónico 64-66 para obtener la constante de resorte del voladizo. Este procedimiento es automatizado en la mayoría del software AFM y por lo general no requiere un conocimiento especializado del modelo en cuestión.
  3. Sintonizar el voladizo. Encontrar la respuesta de amplitud del voladizo cuando se maneja externamente (por ejemplo, acústicamente o por excitación fototérmica) en un rango de frecuencias cerca de su frecuencia de resonancia nominal. Ajuste la frecuencia de accionamiento a la cerca del máximo en este espectro, ligeramente a la izquierda. Si el voladizo es Acoustically impulsado, muchos máximos espuria puede aparecer cuando la sintonización.
    1. Seleccionar un pico de resonancia lo más cerca posible a (y dentro de la envoltura de) la resonancia identificada en el espectro térmico utilizando el software de control de la AFM pero específicos puede depender del tipo y la versión de software que controla el AFM.

6. Enfoque y examen inicial de la muestra

  1. Establecer la amplitud de la conducción de modo que la amplitud de la oscilación libre es de aproximadamente 5 nm. Esto corresponde normalmente a 0,2-0,8 V en la mayoría de AFM (en el caso de los InvOLS no está calibrado). Ajuste el punto de ajuste de amplitud de ~ 80% de la amplitud libre.
  2. Establecer las ganancias de realimentación relativamente alto (el valor absoluto depende de la AFM), pero que no se produzca inestabilidad o timbre.
  3. Ajuste la velocidad de exploración inicial y el tamaño de escaneo para valores pequeños (por ejemplo, a ~ 1 Hz y 10 nm, respectivamente). Esto ayuda a mantener la punta en el caso de que algunos parámetros de retroalimentación están mal ajustadasevitando la exploración a grandes distancias. El tamaño de escaneo puede ampliarse a un valor mayor (por ejemplo, 100 nm) si las condiciones de exploración aparecen adecuado.
  4. Determinar la altura aproximada de la superficie (en algunos casos esto debe hacerse ópticamente) antes de la aproximación.
  5. Iniciar el enfoque de la punta a la superficie utilizando el software de control AFM. Los detalles finos de este proceso dependerán del modelo de AFM y el software utilizado.
    1. Si hay problemas con el enfoque cuando se utiliza un voladizo suave, llevar a cabo el enfoque en el modo de contacto. En este caso, asegúrese de que las ganancias son menores que en el modo AM, y establecer el punto de ajuste a un valor relativamente bajo (0,1-0,2 V después de centrar el láser sobre el fotodetector) para preservar la punta.
    2. Evaluar si la punta ha alcanzado la superficie sin empezar a imagen cambiando ligeramente el valor de consigna (aumento en el modo de contacto o disminución en el modo AM). Si la punta está en la superficie, el efecto sobre tque la extensión de la Z-piezo debería ser insignificante. Los movimientos en vivo de la Z-piezo generalmente se muestran gráficamente en el software de control de la mayoría de AFM. Si el cambio de consigna desencadena un movimiento visible del elemento piezoeléctrico, esto indica una falsa Engage. En este último caso, vuelva a iniciar el enfoque de la posición de la punta de corriente, usando un poco más alto (contacto) o menor valor de consigna (AM).
  6. Una vez que la punta ha alcanzado la superficie, retraer el piezo-Z (por lo general simplemente pulsando "STOP") y volver a sintonizar el voladizo (repita el paso 5.4.); la frecuencia de resonancia es probable que se han desplazado a un valor inferior debido a la interacción punta-muestra.
  7. Para cambiar el valor de ~ 80% de la amplitud libre recién sintonizada (a esta distancia punta-muestra).
  8. Enganche el voladizo y realizar una exploración nm 2 10 × 10 de la superficie en el modo AM para verificar que los parámetros de imagen son adecuados.
    1. Compruebe que la traza (exploración de izquierda a derecha) y volver sobre (escaneado para la izquierda)perfiles se superponen. Si no es así a reducir aún más el valor de consigna y tratar de aumentar la ganancia.
    2. Bajar las ganancias si la imagen se vuelve ruidosa.
  9. Repetir la operación con una gran - 1 × 1 m 2 a 5 x 5 m 2 - exploración de la muestra siempre que ello sea posible. En muestras blandas o biológicos, esto podría dar lugar a una contaminación de la punta.

7. Imagen de alta resolución

  1. Reducir el tamaño de escaneado a un valor adecuado para la visualización de las características (por ejemplo, 100 x 100 nm 2 para cristales de proteína o 20 × 20 nm 2 de mica o calcita).
  2. Reducir la amplitud de accionamiento del voladizo suficiente para que el bucle de retroalimentación para retraer automáticamente el Z-piezo y por lo tanto la punta de la superficie. Mientras que el voladizo está lejos de la superficie, ajustar la amplitud de accionamiento de manera que la amplitud en voladizo es de ~ 1-2 nm (pico a pico).
  3. Usando el software de control AFM, Progrèssivamente reducir el punto de ajuste de unas pocas decenas de mV a la vez hasta la Z-piezo se extiende de nuevo hacia la superficie y la imagen original se recupera. Mantenga la amplitud de consigna entre 75% y 95% de la nueva amplitud libre.
  4. Reajuste las ganancias utilizando el software de control AFM; mayores ganancias se pueden utilizar en amplitudes más bajas sin introducir ruido significativo.
    1. Repetir el 7/2 a 7/4 pasos a fin de determinar la mejor combinación de amplitud libre, punto de ajuste y de ganancia para alta resolución. Las condiciones óptimas dependen de la muestra (paisaje solvatación y las propiedades humectantes del líquido), sino también el voladizo (constante de elasticidad, rigidez).
    2. Explora diferentes combinaciones de amplitudes para optimizar las condiciones de formación de imágenes. Puede ser necesario aumentar de nuevo la amplitud libre 42. En tal caso, primero ajustar el punto de ajuste a un valor más alto y luego aumentar la unidad (es decir, el procedimiento inverso al utilizado para disminuir la amplitud).
    3. Mantenga el setpoint amplitud en el rango de 0,5 nm - 1,5 nm (pico a pico) con relaciones de consigna mantiene por encima de 0,7 (típicamente 0,75 a 0,95). Para las interfaces solvofílica, utilizar voladizos con una constante de resorte de 0,5 - 2 N / m. Esto es suficiente para la punta para eliminar la mayor parte del líquido interfacial sin golpear la superficie. Una regla de oro se propone en la ec. 4 de referencia 29.

Resultados

El protocolo descrito en la sección anterior se ha aplicado con éxito con varios AFMs comerciales para lograr imágenes molecular- o a nivel atómico. Todas las imágenes se obtuvieron con amplitudes de trabajo entre 0,5 nm y 1,5 nm ajustados individualmente siguiendo el procedimiento los pasos 7,1-7,4. Los resultados podrían ser obtenidos a través de una amplia gama de suave (Figura 2) y (3) Figura muestras rígidas. En cada caso, se resaltan las características de interés. Una de las grandes ventajas de la técnica es que las pequeñas amplitudes de oscilación y altos puntos de ajuste minimizan la fuerza ejercida por la punta en la muestra, lo que permite frágiles auto-ensamblados de lípidos (Figura 2A), proteínas (Figura 2 B y D), y moléculas anfifílicas (Figura 2C) para obtener imágenes sin daño en solución. Los materiales más duros cristalinos tales como minerales (Figuras 3A, B, C) yiones metálicos individuales adsorbidos sobre una superficie (Figura 3C) se pueden obtener imágenes utilizando el enfoque porque en cada caso, es el líquido interfacial que es imaginada eficazmente con el protocolo descrito. Las fuerzas de solvatación son comparables en las muestras de las figuras 2 y 3 muestran: todas las muestras son hidrófilas (más en general, "solvofílica" en el caso de las figuras 2C, 3B, 3D) con respecto a la solución de formación de imágenes. Consistentemente, los voladizos con rigidez comparable (0,2 - 0,8N / m) se utilizaron en todos los casos. Tanto la muestra y la punta deben ser solvofílica para asegurar que las moléculas de líquido forman una estructura de solvatación bien definido que se pueden obtener imágenes. Esto no siempre es una condición suficiente, pero en la mayoría de los casos y para moléculas de líquido relativamente pequeño, el propio líquido re-estructuras de una manera que imita la simetría de muestra. El principal motor de la alta resolución es la variación local en la afinidad de las moléculas de disolvente adsorbidospara las superficies (Ångström escala, en el caso de las Figuras 2A, 3A, 3C). La técnica se por lo tanto, más adecuado para materiales en los que la estructura de disolvente varía en gran medida a través de la superficie.

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Figura 2: las interfaces suaves imaginada por AM-AFM en soluciones acuosas. R: dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) bicapa lipídica en la fase de gel en la imagen in KCl 150 mM. Los grupos de cabeza hexagonal de lípidos lleno se distinguen tanto en la topografía y la fase, junto con el contraste local que indica las variaciones específicas del sitio en la hidratación. B: membranas púrpura de Halobacterium salinarum fotografiado en KCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,4. Varios trímeros de proteína bacteriorrodopsina se resaltan. La fase exhibe un contraste diferente de la topografía debido a sitios de hidratación locales en las proteínas. trímeros de proteínas individuales se pueden hacer fuera (líneas de trazos). C: tinte anfifílico (Z907) moléculas adsorbidas en la superficie de una nanopartícula TiO 2 en una célula solar sensibilizada con colorante. La imagen fue adquirida en sulfona etil-isopropil. El aspecto esponjoso que es creado por las moléculas de colorante adsorbido. D: cristal Acuaporina en las membranas de lentes bovinas autóctonas imagen formada en el mismo tampón B. Un tetrámero acuaporina se pone de relieve. Sub-estructura que corresponde a los bucles entre helicoidales son visibles en la topografía mientras que la fase muestra un contraste sorprendentemente diferente debido al comportamiento inusual agua cerca de la proteína. Las imágenes son una adaptación de los árbitros 36 (B), ref 38 (C) y ref 67 (D). La barra de escala es de 5 nm (A), 10 nm (B), 3 nm en (C), y 15 nm (D) La escala de color indica, respectivamente, una variación de la altura y fase de 200 pm y 15 ° (A), 600 pm y 4 ° (B), 2,5 nm y 2,5 ° (C), y 1,6 nm y 9,5 ° (D).carga / 54924 / 54924fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Imágenes representativas AM-AFM de muestras duras en soluciones fluidas. R: La calcita cristalina [ figure-results-3 ] Superficie con la imagen en una solución de agua ultrapura equilibrada. B: titanato de estroncio fotografiada obtenida en sulfóxido de dimetilo (DMSO). -Alta resolución no fue posible en el agua. C: la mica moscovita reflejado en RbCl 3 mm - individuales adsorbidos iones Rb + son visibles en los sitios de celosía de la mica en ambas exploraciones de fase y de la altura. D: El carburo de silicio en fotografiada en DMSO. Los arreglos cristalográficas esperados se muestran en imágenes B y D. Las imágenes son una adaptación de ref 68 (A), ref 42 (B y D),y ref 44 (C). La barra de escala es de 3 nm (A, B, C) y 5 nm (C). La escala de colores indica, respectivamente, una variación de la altura y la fase de 250 horas y 14 ° (A), a 600 pm y 5,5 ° (B), a 800 pm y 15 ° (C), y 500 pm y 3,5 ° (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Suponiendo que el líquido de formación de imágenes y la rigidez en voladizo se han seleccionado apropiadamente, los pasos más críticos para la consecución de éxito de alta resolución son el ajuste de la amplitud de formación de imágenes, y la limpieza general del sistema investigado.

Amplitudes comparables al espesor de la región interfacial líquido (típicamente menos de 2 nm) sondas principalmente la variación en las propiedades de la interfacial disolvente 42. Si la amplitud de la oscilación es demasiado grande, la punta vibratoria será atravesar de largo alcance, campos de fuerza no lineales 52 que impiden la estabilidad del movimiento en voladizo, e inevitablemente afectó la muestra, independientemente de las condiciones de formación de imágenes 29, lo que resulta en el deterioro de la resolución. Aparte de la pérdida de resolución, armónicos superiores comienzan a aparecer en el movimiento de la punta y el sistema se hace más complicado para modelar 55. Alternativamente, si la amplitud de imagen es demasiado pequeña oparte ólo de la interfaz se sonda (capas típicamente específico del líquido interfacial) y formación de imagen estable sólo se puede conseguir con voladizos rígidas (> 10 N / m en agua 53) para una relación satisfactoria de señal a ruido, con el riesgo de muestras gaseosas perjudiciales sobre grandes variaciones de altura. La necesidad de voladizos rígidas es superar el ruido térmico que puede ser más significativo que la señal medida Cuando se trabaja con pequeñas amplitudes, las interacciones de largo alcance entre la punta y la muestra son todavía presente, pero son en gran parte constante y no afectan a la alta resolución de contraste en las imágenes obtenidas.

Limpieza del entorno de formación de imágenes es de suma importancia cuando se trata de alta resolución de AFM. compuestos no deseados en el sistema pueden interferir tanto con la formación de imágenes y la espectroscopia de fuerza. Hay dos categorías principales de las contaminaciones que tienden a afectar los experimentos: (i) los contaminantes directamente visibles cuando se generan imágenes ( Figura 4B, 4C) y (ii) la falta sin explicación general de alta resolución. Caso (i) tiende a ocurrir sólo en sistemas altamente idealizadas como en la interfaz de mica agua donde agregados moleculares adsorbidas que interfieren con las interacciones de punta-muestra claramente en contraste contra la superficie de mica atómicamente plana (Figura 4A). Antes de cambiar la punta y la muestra, vale la pena adquirir curvas espectroscópicos con una gran desviación, presionando eficazmente dura la punta contra la muestra repetidamente. Esto normalmente dañar una nueva punta, pero en ocasiones puede limpiar una punta sucio o inducir a los sitios de hidratación estables adecuadas para la formación de imágenes. Este truco, sin embargo, inevitablemente, en penetración y por lo tanto sea sólo es adecuado para la muestra plana, incluso si la imagen mejora. En caso de sospecha de contaminación sobre muestras rígidas, puede ser vale la pena probar a la imagen con el segundo modo propio del voladizo antes de intentar el procedimiento algo destructivo descrito anteriormente. Esto simplemente requiere swpicazón de la frecuencia de accionamiento de la segunda modo propio y reajustar la amplitud / valor de referencia (véase la discusión de resolución de problemas). La rigidez efectiva de los incrementos en voladizo considerablemente si se utilizan en el segundo modo propio y de cualquier contaminante débilmente adsorbido puede ser empujado lejos de la punta mientras que las imágenes. Esta estrategia no reemplaza la necesidad de una muestra limpia y la punta, pero ofrece algunas posibilidades adicionales para adquirir imágenes satisfactorias cuando una punta / muestra claramente no es lo ideal.

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Figura 4: Ejemplos de contaminación observados cuando se generan imágenes mica moscovita que inhiben la formación de imágenes de alta resolución. R: Mica fotografiada en RbCl 5 mM - no hay partículas contaminantes son visibles. B: La contaminación tomando la forma de agregados del orden de decenas de nm a través de la formación de imágenes, mientras que en el agua ultrapura nominalmente. C: estructuras autoensambladas formadas por contamiNant partículas anfifílicas presumiblemente en la naturaleza. La exploración tuvo lugar de nuevo en agua ultrapura nominalmente. D: secciones verticalmente de desplazamiento correspondientes a las líneas de puntos en A, B y C ilustran la desviación de la superficie atómicamente plana de mica. Las barras de escala en A, B y C corresponden a 300 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Caso (ii) es más común y se caracteriza principalmente por el hecho de que las características frustrante sub-nanómetros simplemente no se pueden resolver, independientemente de las condiciones de formación de imágenes. La firma de este tipo de situaciones suele ser visible en la medición de espectroscopia de fuerza que tienden a mostrar algunas inconsistencias. Estos pueden incluir curvas poco reproducible y amplitud vs curvas de distancia que se desvían significativamente de una forma sigmoidea típica 42. Si los contaminantes iónicos, o de otra manera, son Dispersed de forma homogénea en todo el fluido, que puede no aparecer en la imagen topográfica, pero podría alterar la estructura de la hidratación de la muestra 69, que es crucial para mantener una interacción punta-muestra regular de 29 y 70 para obtener alta resolución. También puede haber efectos directos de los contaminantes en la muestra, especialmente en experimentos suaves, biológicos. Por ejemplo, es bien sabido que la presencia de alcoholes (del procedimiento de limpieza) puede fluidificar bicapas de lípidos en fase gel 71 a 73, lo que hace resolución a nivel de sub-nanómetros imposible. Si de alta resolución no es posible, se debe tener cuidado primero en el proceso de limpieza, centrándose especialmente en cualquier equipo que entra en contacto con la solución de formación de imágenes. Incluso los compuestos aparentemente estables, tales como la resina epoxi pueden solvato en el fluido, en cierta medida, si no completamente curado.

-Alta resolución de imagen con AM-AFM es exigente, requiere paciencia ya menudo varias pruebas antes de alcanzar las mejores condiciones posibles de imagen. Pequeños problemas experimentales pueden convertirse fácilmente lo suficientemente importante como para impedir alta resolución y solución de problemas habilidades son esenciales. De aquí en adelante se indican algunos de los problemas más comunes que nos encontramos con nuestra solución propuesta.

tuning en voladizo

La mayoría de AFMs comerciales utilizan la excitación acústica para conducir el voladizo. En tal caso, el ajuste del voladizo, como se describe en el paso 5.4, cerca de su frecuencia de resonancia a menudo proporciona un rendimiento suficiente para el funcionamiento en el aire. En entornos de líquido, el líquido tiende a inducir algunos de acoplamiento entre las diferentes partes mecánicas de la AFM como chip de voladizo y el soporte. Esto puede afectar la resonancia aparente del voladizo, a menudo ilustrado por un espectro de frecuencias en voladizo que presenta muchos picos agudos y valles comúnmente descritos como un "bosque de picos". Como resultado, a menudo es difícil encontrar el correfrecuencia de accionamiento ct. Estos picos también existen en los entornos de gas, pero debido al alto valor del factor de calidad de voladizo, la amplitud en resonancias es considerablemente mayor 74,75. En líquido seleccionando el pico apropiado para conducir el voladizo puede ser no es fácil y puede requerir ensayo y error. En la práctica, el pico de frecuencia con una variación más pronunciada en amplitud en el "bosque de picos" en torno a la frecuencia de resonancia es generalmente la mejor opción a pesar de ser no necesariamente exactamente en la resonancia y, a menudo proporciona una frecuencia de excitación adecuada para obtener imágenes de alta resolución.

distorsión de la imagen

la deriva de imagen es a menudo un problema en la búsqueda de alta resolución y hace que las imágenes se vean distorsionadas (típicamente estirada). Su origen es generalmente térmica, ya sea porque el escáner / AFM no ha alcanzado su temperatura de funcionamiento de equilibrio, o porque parte de la muestra de líquido se está evaporando rápidamente (por ejemplo, imágenes en alcoholes ). En todos los casos, la deriva se convierte en insignificante, en el equilibrio térmico. Por tanto, es útil para fijar la temperatura de la muestra si es posible. De lo contrario, vale la pena salir de la AFM para escanear una muestra en blanco (exploración de gran tamaño a una velocidad de barrido lento) durante varias horas antes de realizar el experimento. Si la evaporación no es un problema, este procedimiento se realiza mejor después de la etapa 6 del procedimiento, teniendo cuidado de retirar primero la punta una distancia corta (por ejemplo, 20 micras) de la superficie. De vez en cuando, la tendencia se mantendrá incluso después de una extensa thermalization. Esto suele indicar que el voladizo o su chip está arrastrando parte de la muestra mientras que las imágenes, algo que puede ocurrir en muestras cohesivos blandos, tales como películas delgadas o si la punta / voladizo / chip no se coloca adecuadamente. En los chips que alojan más de un voladizo / punta, a menudo es útil para romper el voladizo que no están en uso en lugar de dejar que ellos arrastran sobre la superficie.

Fuerza iónica

ntent "> Dado que la imagen está dominada por el líquido interfacial, a veces es útil para añadir un poco de sal para imágenes de alta resolución de la superficie cargada en el agua. El papel de la sal es doble. En primer lugar, modifica el paisaje hidratación de la superficie con la imagen sobre la adsorción, que a menudo mejora el contraste. en segundo lugar, ayuda a pantalla fuertes interacciones electrostáticas entre la punta y la muestra (por ejemplo, sobre mica). en general, los iones más grandes, potasio, rubidio y cesio permiten mejores imágenes debido a sus propiedades específicas de hidratación 76, y el hecho de que a menudo se adsorben principalmente en un estado de hidratación única 77.

Mala voladizo / consejo

Si se sospecha que el voladizo es una fuente de contaminación (ver síntomas descritos anteriormente), debe ser inspeccionado primero bajo un microscopio óptico. Si se almacena en una caja de gel, el voladizo puede recoger restos de polímeros de gel o aceite de silicio 59 que puede aparecer, En casos extremos, como manchas más oscuras, en la parte posterior del voladizo (como en la figura 5A). Fototérmica oscilación del voladizo puede inducir manchas similares, pero son debido a la degradación / sobrecalentamiento del recubrimiento en voladizo por el láser se conduce. La contaminación tiende a parecer al azar en el voladizo. A (12 h) Limpieza durante más tiempo con isopropanol y, a continuación, con agua ultrapura puede eliminar las partículas no deseadas del voladizo.

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Figura 5: Comparación entre una nueva voladizo y una idéntica que se ha utilizado ampliamente en las superficies duras y la izquierda en una caja de gel durante un periodo prolongado. A: superior; imagen óptica de voladizo completamente nuevo que ha sido limpiado (ver procedimiento). Fondo; óptica de imagen que demuestra la aparición de contaminación visible (flecha azul) de la caja de gel. B: Comparación de los espectros respectivos térmica voladizos.Ampliación del primer pico de resonancia del viejo voladizo es evidente (flecha verde) y en algunos modos de orden superior se han mejorado (flecha azul). Los espectros de haber sido una desviación vertical y presentado en una escala log-log para mayor claridad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Si no se logra la resolución sub-nanométrica requerida, a pesar de las imágenes aceptables en una resolución más baja, es posible que la punta del AFM ha convertido modificado químicamente durante su entorno de almacenamiento. Esto puede ser tratado por la exposición del chip en voladizo a un oxidante ultravioleta durante 120 seg, que ayuda a la creación de grupos de superficie hidrófilo sobre la punta 60. Se debe tener cuidado sin embargo, como la hora exacta necesaria puede variar dependiendo de la geometría de la punta y la potencia UV, y la sobreexposición puede provocar embotamiento de la punta y resolución reducida.

El ruido térmico

De imágenes de alta resolución requiere una gran sensibilidad a las variaciones de la fuerza y las distancias (típicamente fuerzas sub-PN y sub-Ångström se distancia 78). Para voladizos más suaves, el movimiento termomecánica del voladizo debido a su movimiento Browniano intrínseca (vibración térmica) puede ser un problema. En primera aproximación, con un voladizo de rigidez k, no es posible medir características más pequeño que figure-discussion-3 , La amplitud del ruido térmico, donde k B es constante de Boltzmann y T es la temperatura. En la práctica, el uso de voladizo con frecuencias de resonancia más altas se propaga el ruido en un rango de frecuencias mayor, y reduce el nivel general de ruido en el ancho de banda de medición 79.

proyección de imagen modo propio más alto

A veces puede ser útil para operar el voladizo en su segundo modo propiodebido a la rigidez efectiva aumento (véase la discusión de la contaminación). Prácticamente, esto se hace simplemente mediante el accionamiento del voladizo en su segundo modo propio (el segundo pico de resonancia a una frecuencia más alta, ver Figura 1A). Cuando se ajusta un voladizo, sólo tiene que seleccionar el segundo modo propio en lugar de la resonancia principal y continúe en el paso 5.4. Tenga en cuenta que las InvOLS serán diferentes cuando el voladizo es accionado a la segunda modo propio; típicamente ~ 1/3 de los InvOLS medidos en el paso 5.2 para un voladizo rectangular.

La principal limitación de la técnica es que requiere un paisaje solvatación estable en la superficie de la muestra. La muestra debe ser lo suficientemente robusta como para permitir perturbar el líquido interfacial sin inducir una deformación importante de la propia muestra. Esto puede ser un reto en este tipo de grandes biomoléculas muy suaves y muestras inestables. Además, en pequeña amplitud AFM como se describe aquí no se puede obtener información acerca de la mecánica propiedades de una muestra, como la punta en voladizo pasa la mayor parte de su tiempo en el líquido interfacial. Para esto, puede ser beneficioso utilizar otros enfoques, tales como cuantitativa nanomecánicos Mapping 80 o hacer uso de los armónicos más altos de movimiento en voladizo. Las armónicas más altas son generalmente mejoran cuando la formación de imágenes en el líquido (con la calidad-factores bajas) 29,81 - 83 y puede proporcionar simultáneamente la topografía y la rigidez de las muestras 25,81 - 84 pero en general son perjudiciales para alta resolución. Otras limitaciones inherentes a todas las técnicas de microscopía de sonda de barrido siguen siendo válidas aquí, en particular, el hecho de que los resultados incluyen inevitablemente información sobre la punta de medición. El uso de pequeñas amplitudes no es ideal para las muestras con grandes variaciones de altura; el bucle de realimentación inevitablemente reacciona más lentamente cuando las variaciones de altura son más grandes que la amplitud de formación de imágenes, por lo tanto, correr el riesgo de la muestra y la punta de daños. El uso of voladizo más suave mitiga este problema en cierta medida.

La principal ventaja del método que aquí se presenta es el hecho de que proporciona la resolución de imagen más alta posible con un AFM en líquido, pero se puede implementar en cualquier AFM comercial, siempre que los niveles de ruido de la máquina son lo suficientemente bajos. resolución comparable en los instrumentos comerciales se consigue normalmente en el modo de contacto, u ocasionalmente en FM-AFM con voladizos rígidas. Trabajando en AM-modo y con voladizos relativamente suaves permite una gama más amplia de muestras, y es más fácil de implementar que la FM-AFM en la mayoría de los sistemas. El enfoque se basa en la explotación de las fuerzas de solvatación existentes en la interfaz entre cualquier sólido y líquido para mejorar la resolución y obtener información química local. Se puede, en principio, ser utilizada en condiciones ambiente, basándose únicamente en las capas de agua (típicamente varios nanómetros de espesor) que se acumulan en la mayoría de las superficies debido a la humedad del aire. Los principios que subyacen a laestrategia de alta resolución se mantienen sin cambios, pero la mayor parte de la punta está en el aire, con sólo un puente capilar entre el ápice de la punta y la muestra 85. De alta resolución ha sido demostrada en muestras rígidas en estas condiciones 86,87. Las condiciones de formación de imágenes son sin embargo diferentes a los de líquido sumergido debido a un mayor factor Q de oscilación del voladizo. En la práctica, nos pareció difícil lograr un funcionamiento estable sobre muestras blandas o irregulares, presumiblemente debido a los cambios temporales del puente capilar y aumentamos factores Q para una rigidez en voladizo dado.

El protocolo descrito en el presente documento ofrece una metodología para lograr imágenes de alta resolución a nivel molecular de muestras de líquido con la mayoría de AM-AFMs comerciales modernos. Proporcionamos la razón científica detrás de nuestra elección de los parámetros de imagen y destacar el papel de las fuerzas de solvatación. También se discuten los problemas comunes y, en particular, la contaminación. Las interacciones específicas punta-muestra de can varía dramáticamente dependiendo del contenido de la solución de imagen, la geometría y el material en voladizo, y la química de la muestra. El conocimiento práctico de la naturaleza de las fuerzas dominantes presentes durante la exploración tanto, es esencial para adaptar este protocolo para nuevos sistemas y garantizar resultados confiables. Cuando optimizado, el enfoque experimental es eficaz de obtener una visión in situ a nivel molecular locales de muestras en solución.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

La financiación del Consejo de Investigación de Ciencias Físicas y de Ingeniería (subvenciones 1.452.230 y EP / M023915 / 1), la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación (Grant BB / M024830 / 1) y el Consejo Europeo (7PM CIG 631.186) se agradece.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Multimodo IIIA AFMBruckerNAUna de las máquinas usadas
Cypher ES AFMAsylum ResarchNAUna de las máquinas usadas
AFM voladizo/puntaNanoworldArrow UHF-AUDmejor para alta frecuencia
AFM voladizo/puntaOlympusRC800-PSA agua ultrapuraversátil y barata
MiliporeNAlos sistemas de filtrado de laboratorio pueden inducir contaminación
DimetilsulfóxidoSigma-Aaldrich200-664-3 Químico estándar, sin más purificación
Sales monovalentesSigma-Aaldrichproducto químico estándar, sin purificación adicional
LípidosAvanti Polar Lipidesbicapas lipídicas formadas mediante protocolos de stadard
Cristales Cristales pulidosMTI
Cinta adhesiva3MScotch Magic TapeLa cinta translúcida funciona mejor. Los palos transparentes se adhieren con demasiada fuerza

Referencias

  1. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical mapping of single membrane proteins at submolecular resolution. Nano Lett. 11 (9), 3983-3986 (2011).
  3. Payam, A. F., Ramos, J. R., Garcia, R. Molecular and nanoscale compositional contrast of soft matter in liquid: interplay between elastic and dissipative interactions. ACS Nano. 6 (6), 4663-4670 (2012).
  4. Grandbois, M. How Strong Is a Covalent Bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
  5. Oesterhelt, F. Unfolding Pathways of Individual Bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), 143-146 (2000).
  6. McLean, R. S., Doyle, M., Sauer, B. B. High-Resolution Imaging of Ionic Domains and Crystal Morphology in Ionomers Using AFM Techniques. Macromolecules. 33 (17), 6541-6550 (2000).
  7. Scheuring, S., Reiss-Husson, F., Engel, A., Rigaud, J. L., Ranck, J. L. High-resolution AFM topographs of Rubrivivax gelatinosus light-harvesting complex LH2. EMBO J. 20 (12), 3029-3035 (2001).
  8. Novoselov, K. S., et al. Two-dimensional atomic crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (30), 10451-10453 (2005).
  9. Freeman, M. R., Choi, B. C. Advances in magnetic microscopy. Science. 294 (5546), 1484-1488 (2001).
  10. Bockrath, M., et al. Scanned Conductance Microscopy of Carbon Nanotubes and λ-DNA. Nano Lett. 2 (3), 187-190 (2002).
  11. Oliver, R. A. Advances in AFM for the electrical characterization of semiconductors. Reports Prog. Phys. 71 (7), 076501(2008).
  12. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6 (1), 1-7 (1995).
  13. Majumdar, A., Carrejo, J. P., Lai, J. Thermal imaging using the atomic force microscope. Appl. Phys. Lett. 62 (20), 2501(1993).
  14. Vezenov, D. V., Noy, A., Ashby, P. Chemical force microscopy: probing chemical origin of interfacial forces and adhesion. J. Adhes. Sci. Technol. 19 (3-5), 313-364 (2005).
  15. Gerber, C., Lang, H. P. How the doors to the nanoworld were opened. Nat. Nanotechnol. 1 (1), 3-5 (2006).
  16. Bharat, B. Encyclopedia of Nanotechnology. , Springer Netherlands. Dordrecht. (2012).
  17. Giessibl, F. J. Subatomic Features on the Silicon (111)-(7x7) Surface Observed by Atomic Force Microscopy. Science. 289 (5478), 422-425 (2000).
  18. Haugstad, G. Atomic Force Microscopy. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2012).
  19. Moreno-Herrero, F., Colchero, J., Gòmez-Herrero, J., Barò, A. M. Atomic force microscopy contact, tapping, and jumping modes for imaging biological samples in liquids. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 69 (3), Pt 1 031915(2004).
  20. Gan, Y. Atomic and subnanometer resolution in ambient conditions by atomic force microscopy. Surf. Sci. Rep. 64 (3), 99-121 (2009).
  21. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
  22. Picco, L. M., et al. High-speed AFM of human chromosomes in liquid. Nanotechnology. 19 (38), 384018(2008).
  23. Fantner, G. E., et al. Components for high speed atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 106 (8-9), 881-887 (2006).
  24. Garcia, R., Herruzo, E. T. The emergence of multifrequency force microscopy. Nat. Nanotechnol. 7 (4), 217-226 (2012).
  25. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 809-814 (2011).
  26. Fukuma, T., Higgins, M. J., Jarvis, S. P. Direct imaging of individual intrinsic hydration layers on lipid bilayers at Angstrom resolution. Biophys. J. 92 (10), 3603-3609 (2007).
  27. Higgins, M. J., et al. Structured water layers adjacent to biological membranes. Biophys. J. 91 (7), 2532-2542 (2006).
  28. Kobayashi, K., Oyabu, N., et al. Visualization of hydration layers on muscovite mica in aqueous solution by frequency-modulation atomic force microscopy. J. Chem. Phys. 138 (18), 184704(2013).
  29. Voïtchovsky, K. Anharmonicity, solvation forces, and resolution in atomic force microscopy at the solid-liquid interface. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 88 (2), 022407(2013).
  30. Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat. Nanotechnol. 3 (5), 261-269 (2008).
  31. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Di Cerbo, A., Caramaschi, T., Facci, P. What do we really measure in AFM punch-through experiments on supported lipid bilayers. Soft Matter. 7 (15), 7054(2011).
  32. Schmidt, S., Biegel, E., Müller, V. The ins and outs of Na(+) bioenergetics in Acetobacterium woodii. Biochim. Biophys. Acta. 1787 (6), 691-696 (2009).
  33. Bippes, C. A., Muller, D. J. High-resolution atomic force microscopy and spectroscopy of native membrane proteins. Reports Prog. Phys. 74 (8), 086601(2011).
  34. Chada, N., et al. Glass is a Viable Substrate for Precision Force Microscopy of Membrane Proteins. Sci. Rep. 5, 12550(2015).
  35. Möller, C., Allen, M., Elings, V., Engel, A., Müller, D. J. Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces. Biophys. J. 77 (2), 1150-1158 (1999).
  36. Antoranz Contera, S., Voïtchovsky, K., Ryan, J. F. Controlled ionic condensation at the surface of a native extremophile membrane. Nanoscale. 2 (2), 222-229 (2010).
  37. Kumaki, J. Observation of polymer chain structures in two-dimensional films by atomic force microscopy. Polym. J. 48 (1), 3-14 (2015).
  38. Voïtchovsky, K., et al. In Situ Mapping of the Molecular Arrangement of Amphiphilic Dye Molecules at the TiO Surface of Dye-Sensitized Solar Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 10834-10842 (2015).
  39. Segura, J. J., et al. Adsorbed and near surface structure of ionic liquids at a solid interface. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (9), 3320-3328 (2013).
  40. Hayes, R., Warr, G. G., Atkin, R. Structure and Nanostructure in Ionic Liquids. Chem. Rev. 115 (13), 150601082109009(2015).
  41. Fukuma, T., Kobayashi, K., Matsushige, K., Yamada, H. True atomic resolution in liquid by frequency-modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 87 (3), 034101(2005).
  42. Voïtchovsky, K., Kuna, J. J., Contera, S. A., Tosatti, E., Stellacci, F. Direct mapping of the solid-liquid adhesion energy with subnanometre resolution. Nat. Nanotechnol. 5 (6), 401-405 (2010).
  43. Siretanu, I., et al. Direct observation of ionic structure at solid-liquid interfaces: a deep look into the Stern Layer. Sci. Rep. 4, 4956(2014).
  44. Ricci, M., Spijker, P., Voïtchovsky, K. Water-induced correlation between single ions imaged at the solid-liquid interface. Nat. Commun. 5, 4400(2014).
  45. Kiracofe, D., Raman, A. On eigenmodes, stiffness, and sensitivity of atomic force microscope cantilevers in air versus liquids. J. Appl. Phys. 107 (3), 033506(2010).
  46. San Paulo, A., Garcìa, R. High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes. Biophys. J. 78 (3), 1599-1605 (2000).
  47. Garcìa, R., San Paulo, A. Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy. Phys. Rev. B. 60 (7), 4961-4967 (1999).
  48. Butt, H. J. Electrostatic interaction in atomic force microscopy. Biophys. J. 60 (4), 777-785 (1991).
  49. Israelachvili, J. N. Intermolecular and Surface Forces. Intermol. Surf. Forces. , (2011).
  50. Yu, C. -J., et al. Order in molecular liquids near solid-liquid interfaces. Appl. Surf. Sci. 182 (3-4), 231-235 (2001).
  51. Ortiz-Young, D., Chiu, H. -C., Kim, S., Voïtchovsky, K., Riedo, E. The interplay between apparent viscosity and wettability in nanoconfined water. Nat. Commun. 4, 2482(2013).
  52. Patil, S. V., Hoffmann, P. M. Small-Amplitude Atomic Force Microscopy. Adv. Eng. Mater. 7 (8), 707-712 (2005).
  53. Fukuma, T., Jarvis, S. P. Development of liquid-environment frequency modulation atomic force microscope with low noise deflection sensor for cantilevers of various dimensions. Rev. Sci. Instrum. 77 (4), 043701(2006).
  54. Burkhardt, M., et al. Concept of a molecular charge storage dielectric layer for organic thin-film memory transistors. Adv. Mater. 22 (23), 2525-2528 (2010).
  55. Garcìa, R. Amplitude Modulation Atomic Force Microscopy. , Wiley: Weinheim. (2010).
  56. Uchihashi, T., et al. Quantitative force measurements in liquid using frequency modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 85 (16), 3575(2004).
  57. Yamada, H., et al. Molecular Resolution Imaging of Protein Molecules in Liquid Using Frequency Modulation Atomic Force Microscopy. Appl. Phys. Express. 2 (9), 095007(2009).
  58. Stark, M., et al. From Images to Interactions: High-Resolution Phase Imaging in Tapping-Mode Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 80 (6), 3009-3018 (2001).
  59. Lo, Y. -S., et al. Organic and Inorganic Contamination on Commercial AFM Cantilevers. Langmuir. 15 (19), 6522-6526 (1999).
  60. Akrami, S. M. R., Nakayachi, H., Watanabe-Nakayama, T., Asakawa, H., Fukuma, T. Significant improvements in stability and reproducibility of atomic-scale atomic force microscopy in liquid. Nanotechnology. 25 (45), 455701(2014).
  61. Meyer, G., Amer, N. M. Novel optical approach to atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 53 (12), 1045(1988).
  62. Alexander, S., et al. An atomic-resolution atomic-force microscope implemented using an optical lever. J. Appl. Phys. 65 (1), 164(1989).
  63. Green, C. P., et al. Normal and torsional spring constants of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 75 (6), 1988(2004).
  64. Cleveland, J. P., Manne, S., Bocek, D., Hansma, P. K. A nondestructive method for determining the spring constant of cantilevers for scanning force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 64 (2), 403(1993).
  65. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev. Sci. Instrum. 64 (7), 1868(1993).
  66. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 66 (7), 3789(1995).
  67. Ricci, M., Quinlan, R., Voitchovsky, K. No Title. Soft Matter. , Forthcoming (2016).
  68. Ricci, M., Spijker, P., Stellacci, F., Molinari, J. -F., Voïtchovsky, K. Direct visualization of single ions in the Stern layer of calcite. Langmuir. 29 (7), 2207-2216 (2013).
  69. Kilpatrick, J. I., Loh, S. -H., Jarvis, S. P. Directly probing the effects of ions on hydration forces at interfaces. J. Am. Chem. Soc. 135 (7), 2628-2634 (2013).
  70. Fukuma, T., et al. Mechanism of atomic force microscopy imaging of three-dimensional hydration structures at a solid-liquid interface. Phys. Rev. B. 92 (15), 155412(2015).
  71. Maula, T., Westerlund, B., Slotte, J. P. Differential ability of cholesterol-enriched and gel phase domains to resist benzyl alcohol-induced fluidization in multilamellar lipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (11), 2454-2461 (2009).
  72. Schroeder, F., Morrison, W. J., Gorka, C., Wood, W. G. Transbilayer effects of ethanol on fluidity of brain membrane leaflets. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 946 (1), 85-94 (1988).
  73. Tierney, K. J., Block, D. E., Longo, M. L. Elasticity and phase behavior of DPPC membrane modulated by cholesterol, ergosterol, and ethanol. Biophys. J. 89 (4), 2481-2493 (2005).
  74. Basak, S., Raman, A. Dynamics of tapping mode atomic force microscopy in liquids: Theory and experiments. Appl. Phys. Lett. 91 (6), 064107(2007).
  75. Eslami, B., Solares, S. D. Experimental approach for selecting the excitation frequency for maximum compositional contrast in viscous environments for piezo-driven bimodal atomic force microscopy. J. Appl. Phys. 119 (8), 084901(2016).
  76. Collins, K. D., Neilson, G. W., Enderby, J. E. Ions in water: characterizing the forces that control chemical processes and biological structure. Biophys. Chem. 128 (2-3), 95-104 (2007).
  77. Lee, S. S., Fenter, P., Park, C., Sturchio, N. C., Nagy, K. L. Hydrated cation speciation at the muscovite (001)-water interface. Langmuir. 26 (22), 16647-16651 (2010).
  78. Liang, S., et al. Thermal noise reduction of mechanical oscillators by actively controlled external dissipative forces. Ultramicroscopy. 84 (1-2), 119-125 (2000).
  79. Hodges, A. R., Bussmann, K. M., Hoh, J. H. Improved atomic force microscope cantilever performance by ion beam modification. Rev. Sci. Instrum. 72 (10), 3880(2001).
  80. Adamcik, J., Berquand, A., Mezzenga, R. Single-step direct measurement of amyloid fibrils stiffness by peak force quantitative nanomechanical atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 98 (19), 193701(2011).
  81. Preiner, J., Tang, J., Pastushenko, V., Hinterdorfer, P. Higher harmonic atomic force microscopy: imaging of biological membranes in liquid. Phys. Rev. Lett. 99 (4), 046102(2007).
  82. Dulebo, A., et al. Second harmonic atomic force microscopy imaging of live and fixed mammalian cells. Ultramicroscopy. 109 (8), 1056-1060 (2009).
  83. Xu, X., Melcher, J., Basak, S., Reifenberger, R., Raman, A. Compositional contrast of biological materials in liquids using the momentary excitation of higher eigenmodes in dynamic atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. 102 (6), 060801(2009).
  84. Turner, R. D., Kirkham, J., Devine, D., Thomson, N. H. Second harmonic atomic force microscopy of living Staphylococcus aureus bacteria. Appl. Phys. Lett. 94 (4), 043901(2009).
  85. Barcons, V., Verdaguer, A., Font, J., Chiesa, M., Santos, S. Nanoscale Capillary Interactions in Dynamic Atomic Force Microscopy. J. Phys. Chem. C. 116 (14), 7757-7766 (2012).
  86. Wastl, D. S., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomically resolved graphitic surfaces in air by atomic force microscopy. ACS Nano. 8 (5), 5233-5239 (2014).
  87. Wastl, D. S., Judmann, M., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomic Resolution of Calcium and Oxygen Sublattices of Calcite in Ambient Conditions by Atomic Force Microscopy Using qPlus Sensors with Sapphire Tips. ACS Nano. 9 (4), 3858-3865 (2015).

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