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Artículo de método

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

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DOI:

10.3791/54929

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15 de diciembre de 2016

 ,  , 
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

En este artículo

Resumen

El establecimiento de sistemas de cultivo para la expansión de células madre neurales adultas (aNSCs) permite el examen y la aplicación de aNSCs para la terapia. La zona subcallosa (SCZ) ha sido reconocida recientemente como una nueva región formadora de neuroblastos en ratones adultos. Aquí, se describen los métodos para el aislamiento, la expansión y la diferenciación de las SCZ-aNSC.

Resumen

Las células madre neurales adultas (aNSCs) se pueden utilizar para la regeneración del tejido cerebral dañado. Las NSC tienen el potencial de diferenciación y proliferación en tres tipos de células: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La identificación de las regiones derivadas de las aNSC y la caracterización de las propiedades de las aNSC son fundamentales para el uso potencial de las aNSC y para la elucidación de su papel en la regeneración neuronal. Recientemente se ha informado que la zona subcallosa (SCZ), ubicada entre la sustancia blanca y el hipocampo, contiene aNSC y continuamente da lugar a neuroblastos. Un bajo porcentaje de aNSCs de la SCZ se diferencia en neuronas; La mayoría de las células se diferencian en células gliales, como los oligodendrocitos y los astrocitos. Se sugiere que estas células tienen un potencial terapéutico para la lesión cortical traumática. Este protocolo describe en detalle el proceso para generar SCZ-aNSCs a partir del cerebro de un ratón adulto. Se utiliza una matriz cerebral con intervalos de 1 mm para obtener los cortes coronales que contienen SCZ y para diseccionar con precisión la SCZ de todo el cerebro. Las secciones de SCZ se someten inicialmente a un cultivo de neurosfera. Un sistema de cultivo bien desarrollado permite la verificación de sus características y puede aumentar la investigación sobre las NSC. Un sistema de cultivo de la neurosfera proporciona una herramienta útil para determinar la proliferación y recolectar las NSC genuinas. Un cultivo monocapa es también un sistema in vitro para ensayar la proliferación y diferenciación. Significativamente, este sistema de cultivo proporciona un entorno más homogéneo para las NSC que el sistema de cultivo de la neurosfera. Por lo tanto, utilizando una región cerebral discreta, estos sistemas de cultivo serán útiles para ampliar nuestro conocimiento sobre las aNSC y sus aplicaciones para usos terapéuticos.

Introducción

NSCs tienen características de autorrenovación y diferenciación de múltiples linajes. Para confirmar estas propiedades, se ha utilizado ampliamente un sistema de cultivo de neurosfera. El sistema de cultivo neurosphere se desarrolló a principios de la década de 1990 y sirvió como un sistema estándar de cultivo de células madre1. Dependiendo de la potencia de autorrenovación, las NSC proliferan continuamente y generan una masa celular en un cultivo en suspensión. Se considera que el número de células y el tamaño de la neurosfera están estrechamente asociados con las propiedades de proliferación de las NSC. Los cultivos monocapa también se utilizan ampliamente para el mantenimiento y la diferenciación de las NSC. En comparación con el cultivo de la neurosfera, el sistema de cultivo monocapa proporciona un mejor mantenimiento y expansión homogéneos de las NSC2. Estos dos sistemas de cultivo bien desarrollados han contribuido a la caracterización de las aNSCs in vitro.

NSCs residen en diferentes regiones del cerebro, como la zona subventricular (SVZ) del ventrículo lateral y la zona subgranular (SGZ) del hipocampo3-5. La zona subcallosa (SCZ) de la sustancia blanca subcortical caudal se reconoce como una nueva región neurogénica6-8. Recientemente se ha reportado que las SCZ-aNSCs tienen potencial terapéutico en el traumatismo craneoencefálico9. En comparación con otras regiones neurogénicas, la SCZ reside a lo largo de la sustancia blanca subcortical. En el cerebro humano, la materia blanca subcortical ocupa una región más grande que enel cerebro del ratón. Por lo tanto, es importante comprender las características de las SCZ-aNSC mediante un sistema de cultivo in vitro para promover el uso potencial de estas células para la regeneración neuronal. Se requiere una disección precisa de la región cerebral deseada para descartar una posible contaminación por regiones no deseadas que contengan NSC activas o inactivas. Por ejemplo, las aNSC en regiones no neurogénicas pueden activarse y producir nuevas células neuronales en cerebros lesionados o durante el cultivo in vitro 11. Para obtener NSC de la SCZ, se recolectaron células de cortes de cerebro que contenían la SCZ. A continuación, se realizó una microdisección cuidadosa de la región SCZ con una aguja fina. Para generar la neurosfera a partir de la SCZ, los trozos de tejido SCZ microdisecados se disociaron en células individuales y luego se cultivaron como una suspensión en presencia de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF). Después de que las SCZ-aNSC forman neurosferas, también pueden mantenerse como neuroesferas o monocapas para su expansión. Este procedimiento también demuestra procesos de inmunotinción con diversos marcadores para la detección de NSCs y su progenie tras su expansión y diferenciación en un cultivo monocapa. Aquí, se presenta un protocolo visual del sistema de cultivo SCZ-aNSC. Este protocolo contiene instrucciones detalladas para la microdisección de la región SCZ y para el mantenimiento y el paso de las células.

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Protocolo

1. Preparación de Materiales y Medio de Cultivo

  1. Para la disección y la disociación de la SCZ, envolver la matriz de cerebro, hoja de doble filo de afeitar, y las pinzas con papel de aluminio y, a continuación, esterilizarlos en autoclave.
  2. Preparar 50 ml de tampón de PBS fría para lavar todo el cerebro del ratón.
  3. Establecer un microscopio de disección y preparar las herramientas quirúrgicas requeridas para la disección del cerebro (tijeras y pinzas en autoclave) y el aislamiento de la (jeringa de 1 ml, 30 aguja G, matriz de cerebro, y unas pinzas finas) SCZ.
  4. Preparación de N2 Medio:
    1. Preparar F-12 / DMEM (+ L-glutamina, + bicarbonato de sodio) medio con 2% B27, 1% suplementos de N2, y 1% de penicilina-estreptomicina.
      Nota: El medio de crecimiento consiste en N2 medianas y factores de crecimiento (20 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico purificada (EGF) y 20 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF2)).
  5. Preparar un tampón de digestión (40 unidades / ml de papaína, 2,4 unidad / ml dispase II, y 2% de penicilina-estreptomicina en PBS) para la digestión del tejido.
  6. Preparación de la placa de revestimiento y Coverslip:
    1. Preparar poli-L-ornitina (OLP; 0,01%) y laminina (10 mg / ml disueltos en DH 2 O). Para revestir placas de 6 pocillos para el mantenimiento de SCZ-aNSCs como una monocapa o cubreobjetos de 18 mm para la inmunotinción, incubarlos con la OLP durante la noche a 4 ° C. Entonces ellos lavar 3 veces con DH 2 O. Dejar que las placas y los cubreobjetos se sequen después del último lavado.
    2. A continuación, se incuban las placas con laminina durante la noche a 4 ° C. A continuación, lavar 3 veces con DH 2 O.
      Precaución: No secar la laminina, lo que afectará a la unión celular.
      Nota: Las soluciones de revestimiento se pueden reutilizar 3 veces.

2. Aislamiento y disociación de la SCZ adulto

  1. Antes de la preparación de cultivo, colocar la matriz cerebro y la maquinilla de afeitar de doble filo en hielo.
    Nota: No congelar la matriz cerebral, debido a que el anchoain podría agregar a dicho informe.
  2. Sacrificio un ratón (8 semanas de edad) por asfixia con CO2 o dislocación cervical.
    1. Cortar la cabeza con unas tijeras afiladas después de rociar 70% de etanol. Para inmovilizar la cabeza, sujete los dos lados de la cabeza con fuerza. Cortar la piel con unas tijeras en la línea media en dirección caudal rostral. Esto promueve la eliminación completa de la piel del cráneo.
    2. Retire la parte caudal del cráneo (posterior a la lambda) en primer lugar y, a continuación, insertar la pinza entre el cráneo y el cerebro en la posición de la línea media dorsal. Agarrar el hueso parietal izquierda (o derecha) y cuidadosamente pele apagado. Repita este procedimiento para la eliminación del otro hueso parietal.
      Nota: La desconexión del nervio óptico y la eliminación de las meninges del cerebro que sea más fácil separar el cerebro del cráneo.
    3. Transferir el cerebro a un tampón de PBS frío (25 ml) y enjuague dos veces para eliminar el exceso de sangre.
  3. Coloque el cerebro en la matriz cerebral en hielo y make cortes coronales para obtener rodajas de 1 mm de espesor. La transferencia de los cortes de cerebro (1 mM) que contenía las regiones SCZ que se encuentran en la parte posterior del cerebro a un PBS frío en una placa petri de plástico 35 mm.
    Precaución: Con el fin de obtener un plano paralelo de secciones coronales, asegúrese de que la fisura cerebro se coloca en la línea media de la matriz de cerebro; es crítico para evitar variaciones innecesarias en las secciones.
    Nota: Obtener cortes de cerebro a 2-3 mm posterior al bregma; esto permite la separación de la SCZ de la SVZ.
  4. Bajo el microscopio de disección con un aumento bajo, micro-diseccionar el SCZ desde el área de materia blanca de la corteza y el hipocampo con un 6,9 aguja 30G doblada. A continuación, retire las regiones de la corteza por encima de la SCZ. Coloque la región SCZ disecados de las rebanadas en una placa petri de plástico de 35 mm en el hielo sin PBS frío.
    Nota: La contaminación de las regiones adicionales que contienen las neuronas maduras podría afectar a la viabilidad de aNSCs y la formación de neuroesferas bebido a que se someten a la muerte celular en condiciones de cultivo ANSC.
  5. Usando una aguja doblada 30 G, cortar inmediatamente los tejidos disecados en trozos pequeños.
    Nota: Si se requiere más tiempo para diseccionar el tejido SCZ, sumerja los tejidos disecados en PBS frío antes de cortar.
  6. Vuelva a suspender el tejido picado con 1 ml de tampón de digestión, la transferencia de tejido a un tubo de 15 ml que contiene 2 ml de tampón de digestión, y se incuba durante 30 min en un baño de agua a 37 °.
    Nota: Agitar el tubo cada 10 minutos para mezclar bien.

3. derivados de Zona subcallosal Cultura adulto Neural Stem Cell

  1. Toque suavemente el tubo para disociar el tejido digerido, y centrifugar el tubo a 145 g durante 5 min. Descartar el sobrenadante, se resuspendió el tejido digerido con 1 ml de medio precalentado N2 para lavar el tampón de digestión, y la pipeta suavemente la solución de muestra un máximo de 5 veces usando una pipeta P1000.
    Nota: El exceso de trituración con una estrechapunta de la pipeta puede disminuir la viabilidad celular y el crecimiento subsiguiente.
  2. Centrifugar el tubo a 145 xg durante 5 min. Después de desechar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento celular en 1 ml de medio N2.
  3. Preparar 1 ml de medio N2 en una placa no recubierta 6 pocillos y añadir 1 ml de las células suspendidas para hacer un volumen final de 2 ml.
  4. Añadir EGF (20 ng / ml) y bFGF (20 ng / ml) en cada pocillo. Agitar suavemente la placa de cultivo de 6 pocillos con la mano para mezclar los factores de crecimiento añadidos a las células sembradas. Mantenga la placa de 6 pocillos en un incubador de CO2 al 37 ° C y 5%.
  5. Añadir EGF (20 ng / ml) y bFGF (20 ng / ml) a cada pocillo cada día durante 8 días. Cada tercera día, añadir 200 l de los medios de comunicación N2 para mantener el volumen aproximado 2 ml del medio.

4. pases de células madre neurales como neuroesferas y para los cultivos en monocapa

  1. Reunir las neuroesferas y transferirlos a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    Nota: El número de neuroesferas (> 50 micras de diámetro) per bien desde el SCZ de un solo cerebro de ratón era de 64,3 ± 7,31, que era menor que la de la SVZ (190,5 ± 6,33) 9.
  2. Incubar las neuroesferas con 0,5 ml de tampón de disociación de 5 minutos en un baño de agua a 37 ° para disociar las neuroesferas en células individuales. neuroesferas primarias pueden disociarse en células individuales y se mantuvieron durante varios pasajes como los cultivos de neuroesferas o monocapa.
    Nota: La expansión de SCZ-aNSCs como una monocapa es superior a neuroesferas porque SCZ-aNSCs pueden ser pasados> 10 veces en un formato de cultivo en monocapa, pero <5 veces en un formato de la cultura neurosphere.
    Precaución: SCZ-aNSCs exhiben una fuerte agregación, y es difícil de disociar en células individuales. Por lo tanto, el formato de la cultura neurosphere no se recomienda para la expansión de células de rutina.
  3. pipetear suavemente la solución de la muestra de arriba abajo con una pipeta P1000 menos de 5 veces y se centrifuga el tubo a 145 g durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y volver a supasar las neuroesferas con 1 ml de medio N2.
    Nota: Durante trituración con una pipeta de punta estrecha puede disminuir la viabilidad celular y el crecimiento subsiguiente.
  4. Para contar las células, hacer una mezcla 1: 1 de la suspensión celular (10 l) y la solución de azul de tripano al 0,4%, y luego contar el número de células vivas en un hematocitómetro. Después de recubrir una placa de 6 pocillos con PLO / laminina, la placa de las células a 2,5 x 10 5 células / ml con 2 ml de medio de N2 para cada pocillo.
    Nota: Los cambios en la densidad celular pueden afectar su condición y potencial de diferenciación.
  5. Mantener los SCZ-aNSCs con un tratamiento diario de factores de crecimiento (2 ml, 20 ng / ml) durante 5 días, y los pasaje ellos.

5. Diferenciación de los derivados de Zona subcallosal células madre adultas Neuronales

  1. ANSCs placa sobre un cubreobjetos de 18 mm recubiertos de laminina PLO / con 1 x 10 5 células / ml en 1 ml N2 con factores de crecimiento (20 ng / ml) para la diferenciación de los SCZ-aNSCs.
  2. El día siguiente,cuando las células están firmemente unidos al cubreobjetos, intercambiar el medio de crecimiento con N2 para eliminar los factores de crecimiento.
  3. Después de 6 días, se lavan las células diferenciadas con 1 ml de PBS para eliminar los restos celulares y fijarlos para inmunotinción.
    Nota: BrdU se puede incorporar en el ADN recién sintetizadas de las células proliferantes. Por lo tanto, si se desea, BrdU (10 mg / ml) puede ser añadido a las células vivas antes de la fijación de las células.

6. Las células madre neurales adultas inmunotinción y diferenciada Progenitores

  1. Para la inmunotinción, se lavan las células con PBS y fijarlas con 4% PFA durante 20 min a temperatura ambiente.
    Precaución: PFA es altamente tóxico; evitar el contacto con la piel y los ojos.
  2. Retire el 4% PFA, lavar las células fijadas con PBS 3 veces, y luego almacenarlos a 4 ° Cuntil que son necesarios para la inmunotinción.
  3. Se incuban las células en cubreobjetos con solución de bloqueo (3% de albúmina de suero bovino y 0,1% de Triton X-100 en 1 x PBS) durante al menos 30 min a temperatura ambiente.
  4. Preparar los anticuerpos primarios en solución de bloqueo fresco y se incuban las muestras durante la noche a 4 ° C.
    1. La inmunotinción los aNSCs
      1. Tinción de las aNSCs utilizando anticuerpos anti-BrdU anti-nestina y. Antes de la fijación, añadir 20 g de BrdU a las aNSCs y incubarlos durante 2 h. Realizar la etapa de desnaturalización usando HCl 2 N durante 20 minutos a 37 ° CAntes la realización de la etapa de bloqueo.
    2. La inmunotinción los progenitores diferenciadas:
      1. Utilizar anticuerpos anti-glial fibrilar ácida de la proteína (GFA) anti-O4, anti-bIII-tubulina, y para etiquetar los progenitores diferenciadas.
  5. Lavar las muestras con PBS 3 veces y se incuban con anticuerpos secundarios conjugados con colorantes fluorescentes (1: 500) en solución de bloqueo durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, lavar las muestras 3 veces con PBS.
    Nota: Use anticuerpos secundarios que responden a los anfitriones de la primariaanticuerpos. Hoechest33343 (1: 2000) se utiliza para la tinción nuclear.
  6. Añadir la solución de montaje a un portaobjetos de vidrio y proceder con el montaje. Observe y la imagen de muestra en un microscopio confocal en múltiples longitudes de onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), y Hoechest33343 (405 nm).

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Resultados

Definir el sistema de cultivo de aNSCs de la región neurogénica desconocido es esencial para la comprensión de estas células y para el desarrollo de su potencial uso en la reparación del cerebro 12. Se sabe que NSCs en diferentes etapas de desarrollo o en diferentes regiones comportan de manera diferente 3,4. Recientemente, se informó de que las células derivadas-SCZ exhiben potenciales diferenciales para la diferenciación neuronal in vivo e in vitro

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Discusión

Este documento describe un protocolo detallado para generar células madre neurales de la SCZ ratón adulto y mantenerlas para diversas aplicaciones. Hay tres pasos críticos para el establecimiento del sistema de cultivo in vitro necesaria para purificar y expandir SCZ-NSC. En primer lugar, es importante asegurarse de que la región SCZ se diseca precisamente hacia fuera de otras regiones neurogénicas potenciales (Figura 1B). Secciones gruesas y precisos que contienen las regiones SCZ se obtuviero...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación del Cerebro a través de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura de Corea (Subvenciones NRF-2015M3C7A1028790); y por una subvención del Proyecto de Investigación y Desarrollo de Tecnología de Salud de Corea a través del Instituto de Desarrollo de la Industria de la Salud de Corea (KHIDI), financiado por el Ministerio de Salud y Bienestar, República de Corea (HI14C3347).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Componentes medios
DMEM/F12 Gibco11320-033+L-glutamina, +Bicarbonato de sodio
Pluma/EstreptococoInvitrogen15140-122
Suplemento N2Gibco17502-048
Suplemento B27Gibco17504-044
Factor de crecimiento
bFGFR& D233-FB
EGFGibcoPHG0313
tampón
PBS (10x)BIOSOLUTIONBP007a1x dilución
HBSSGibco14175-095
tampón de disociación
Dispasa IIRoche04-942-078-001
PapainWorthington3126
AccutaseICTAT-104
Tool
Pinzas finasWPI555229F
TijerasStorzE3321-C
Matriz cerebral (1 mm)RWD68707
Maquinilla de afeitar de doble filoDORCOST-300
Aguja de 30 GSUNGSHIMN1300
Materiales
15 ml tubosSPL50015
tubos de 50 mlSPL50050
Plato de 35 mmSPL10035Plato de Petri
100 mmSPL10090Placa de Petri
Cubreobjetos (18 mm)Deckglaser111580
Plato de 12 pocillosSPL32012sin recubrimiento
Plato de 6 pocillosSPL32006sin recubrimiento
Materiales de recubrimiento
PLOSigmaP49570.01%
LamininGibco23017-01510 mg/ml
nbsp;
NestinMilliporeMAB353ratón (1:1.000)
EGFRAbcamab2430conejo (1:1.000)
DCXSanta CruzSC8066cabra (1:500)
Tuj1SigmaT2200conejo (1:2.000)
GFAPInvitrogen13-0300rata (1:1.000)
O4MilliporeMAB345ratón (1:500)
BrdUAbcamab6326Rata (1:500)
Anticuerpos secundarios
anti-ratón 488InvitrogenA212021:500
anti-ratón cy3Jackson715-165-151
anti-ratón 647Jackson715-606-150
anti-conejo 488AlexaA21206
anti-conejo cy3Jackson711-165-152
anti-conejo 647Jackson711-605-152
anti-cabra 488AlexaA11055
anti-cabra cy3Jackson705-165-147
anti-cabra 647InvitrogenA21447
anti-ratas 488InvitrogenA21208
anti-ratas cy3Jackson712-166-150
anti-ratas 647Jackson712-605-153
Immunostaining materials
BSAMillipore82-100-63% BSA con 0.1% Triton X-100 en PBS
Triton X-100usb22686
4% PFABiosesangP2031
Hoechest33342Life TechnologyH3570Colorante para teñir núcleos
de

Referencias

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