Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Resumen

El establecimiento de sistemas de cultivo para la expansión de células madre neurales adultas (aNSCs) permite el examen y la aplicación de aNSCs para la terapia. La zona subcallosa (SCZ) ha sido reconocida recientemente como una nueva región formadora de neuroblastos en ratones adultos. Aquí, se describen los métodos para el aislamiento, la expansión y la diferenciación de las SCZ-aNSC.

Resumen

Las células madre neurales adultas (aNSCs) se pueden utilizar para la regeneración del tejido cerebral dañado. Las NSC tienen el potencial de diferenciación y proliferación en tres tipos de células: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La identificación de las regiones derivadas de las aNSC y la caracterización de las propiedades de las aNSC son fundamentales para el uso potencial de las aNSC y para la elucidación de su papel en la regeneración neuronal. Recientemente se ha informado que la zona subcallosa (SCZ), ubicada entre la sustancia blanca y el hipocampo, contiene aNSC y continuamente da lugar a neuroblastos. Un bajo porcentaje de aNSCs de la SCZ se diferencia en neuronas; La mayoría de las células se diferencian en células gliales, como los oligodendrocitos y los astrocitos. Se sugiere que estas células tienen un potencial terapéutico para la lesión cortical traumática. Este protocolo describe en detalle el proceso para generar SCZ-aNSCs a partir del cerebro de un ratón adulto. Se utiliza una matriz cerebral con intervalos de 1 mm para obtener los cortes coronales que contienen SCZ y para diseccionar con precisión la SCZ de todo el cerebro. Las secciones de SCZ se someten inicialmente a un cultivo de neurosfera. Un sistema de cultivo bien desarrollado permite la verificación de sus características y puede aumentar la investigación sobre las NSC. Un sistema de cultivo de la neurosfera proporciona una herramienta útil para determinar la proliferación y recolectar las NSC genuinas. Un cultivo monocapa es también un sistema in vitro para ensayar la proliferación y diferenciación. Significativamente, este sistema de cultivo proporciona un entorno más homogéneo para las NSC que el sistema de cultivo de la neurosfera. Por lo tanto, utilizando una región cerebral discreta, estos sistemas de cultivo serán útiles para ampliar nuestro conocimiento sobre las aNSC y sus aplicaciones para usos terapéuticos.

Introducción

NSCs tienen características de autorrenovación y diferenciación de múltiples linajes. Para confirmar estas propiedades, se ha utilizado ampliamente un sistema de cultivo de neurosfera. El sistema de cultivo neurosphere se desarrolló a principios de la década de 1990 y sirvió como un sistema estándar de cultivo de células madre¹. Dependiendo de la potencia de autorrenovación, las NSC proliferan continuamente y generan una masa celular en un cultivo en suspensión. Se considera que el número de células y el tamaño de la neurosfera están estrechamente asociados con las propiedades de proliferación de las NSC. Los cultivos monocapa también se utilizan ampliament....

Protocolo

1. Preparación de Materiales y Medio de Cultivo

1. Para la disección y la disociación de la SCZ, envolver la matriz de cerebro, hoja de doble filo de afeitar, y las pinzas con papel de aluminio y, a continuación, esterilizarlos en autoclave.
2. Preparar 50 ml de tampón de PBS fría para lavar todo el cerebro del ratón.
3. Establecer un microscopio de disección y preparar las herramientas quirúrgicas requeridas para la disección del cerebro (tijeras y pinzas en autoclave) y el aislamiento de la (jeringa de 1 ml, 30 aguja G, matriz de cerebro, y unas pinzas finas) SCZ.
4. Preparación de N2 Medio:
   1. Preparar F-12 / DMEM (+ L-glutamina,....

Resultados

Definir el sistema de cultivo de aNSCs de la región neurogénica desconocido es esencial para la comprensión de estas células y para el desarrollo de su potencial uso en la reparación del cerebro ^12. Se sabe que NSCs en diferentes etapas de desarrollo o en diferentes regiones comportan de manera diferente ^3,4. Recientemente, se informó de que las células derivadas-SCZ exhiben potenciales diferenciales para la diferenciación neuronal in vivo e in vitro

Discusión

Este documento describe un protocolo detallado para generar células madre neurales de la SCZ ratón adulto y mantenerlas para diversas aplicaciones. Hay tres pasos críticos para el establecimiento del sistema de cultivo in vitro necesaria para purificar y expandir SCZ-NSC. En primer lugar, es importante asegurarse de que la región SCZ se diseca precisamente hacia fuera de otras regiones neurogénicas potenciales (Figura 1B). Secciones gruesas y precisos que contienen las regiones SCZ se obtuviero.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Componentes medios
DMEM/F12	Gibco	11320-033	+L-glutamina, +Bicarbonato de sodio
Pluma/Estreptococo	Invitrogen	15140-122
Suplemento N2	Gibco	17502-048
Suplemento B27	Gibco	17504-044
Factor de crecimiento
bFGF	R& D	233-FB
EGF	Gibco	PHG0313
tampón
PBS (10x)	BIOSOLUTION	BP007a	1x dilución
HBSS	Gibco	14175-095
tampón de disociación
Dispasa II	Roche	04-942-078-001
Papain	Worthington	3126
Accutase	ICT	AT-104
Tool
Pinzas finas	WPI	555229F
Tijeras	Storz	E3321-C
Matriz cerebral (1 mm)	RWD	68707
Maquinilla de afeitar de doble filo	DORCO	ST-300
Aguja de 30 G	SUNGSHIM	N1300
Materiales
15 ml tubos	SPL	50015
tubos de 50 ml	SPL	50050
Plato de 35 mm	SPL	10035	Plato de Petri
100 mm	SPL	10090	Placa de Petri
Cubreobjetos (18 mm)	Deckglaser	111580
Plato de 12 pocillos	SPL	32012	sin recubrimiento
Plato de 6 pocillos	SPL	32006	sin recubrimiento
Materiales de recubrimiento
PLO	Sigma	P4957	0.01%
Laminin	Gibco	23017-015	10 mg/ml
nbsp;
Nestin	Millipore	MAB353	ratón (1:1.000)
EGFR	Abcam	ab2430	conejo (1:1.000)
DCX	Santa Cruz	SC8066	cabra (1:500)
Tuj1	Sigma	T2200	conejo (1:2.000)
GFAP	Invitrogen	13-0300	rata (1:1.000)
O4	Millipore	MAB345	ratón (1:500)
BrdU	Abcam	ab6326	Rata (1:500)
Anticuerpos secundarios
anti-ratón 488	Invitrogen	A21202	1:500
anti-ratón cy3	Jackson	715-165-151
anti-ratón 647	Jackson	715-606-150
anti-conejo 488	Alexa	A21206
anti-conejo cy3	Jackson	711-165-152
anti-conejo 647	Jackson	711-605-152
anti-cabra 488	Alexa	A11055
anti-cabra cy3	Jackson	705-165-147
anti-cabra 647	Invitrogen	A21447
anti-ratas 488	Invitrogen	A21208
anti-ratas cy3	Jackson	712-166-150
anti-ratas 647	Jackson	712-605-153
Immunostaining materials
BSA	Millipore	82-100-6	3% BSA con 0.1% Triton X-100 en PBS
Triton X-100	usb	22686
4% PFA	Biosesang	P2031
Hoechest33342	Life Technology	H3570	Colorante para teñir núcleos

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