El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

Resumen

Este artículo describe un método para evaluar las interacciones y ensamblajes de proteínas integrales de membrana in vitro con varios factores asociados en un entorno proximal de lípidos.

Resumen

Los estudios de proteínas integrales de membrana in vitro con frecuencia se complica por la presencia de un dominio transmembrana hidrófobo. Para complicar aún más estos estudios, la reincorporación de proteínas de membrana solubilizada con detergente en los liposomas es un proceso estocástico donde topología de la proteína es imposible de aplicar. Este trabajo ofrece un método alternativo para estas técnicas desafiantes que utiliza un andamio a base de liposomas. solubilidad de la proteína se ve reforzada por la supresión del dominio transmembrana, y estos aminoácidos se sustituyen con un resto de anclaje, tal como una etiqueta de His. Esta correa de sujeción interactúa con un grupo de anclaje (Ni ²⁺ coordinado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni ²⁺⁾⁾ para marcado con His proteínas), que hace cumplir una topología de proteína uniforme en la superficie del liposoma. Se presenta un ejemplo en el que la interacción entre la proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) con una proteína de membrana, la fisión mitocondrial Factor (MFP), fue investigated utilizando este método andamio liposoma. En este trabajo, hemos demostrado la capacidad de reclutar Mff eficiente Drp1 solubles a la superficie de los liposomas, que estimuló su actividad GTPasa. Por otra parte, Drp1 pudo tubulate la plantilla de lípidos decorados a Mff en presencia de lípidos específicos. Este ejemplo demuestra la eficacia de los liposomas de andamio usando ensayos estructurales y funcionales y destaca el papel de Mff en la regulación de la actividad Drp1.

Introducción

El estudio de las interacciones proteína-proteína de membrana proximal es una tarea difícil debido a la dificultad para recapitular el entorno natural de las proteínas integrales de membrana que participan ^1. Esto es debido a la necesidad de solubilización de detergente y la orientación inconsistente de proteínas en proteoliposomas. Con el fin de evitar estos problemas, se ha empleado una estrategia en la que dominios solubles de proteínas integrales de membrana se expresan como proteínas de fusión His-tag, y estos fragmentos solubles están anclados a los liposomas de andamio a través de interacciones con NTA (Ni ²⁺⁾ grupos de cabeza en el lípid....

Protocolo

1. Preparación de liposomas Andamios

NOTA: Idealmente, los experimentos iniciales se debe utilizar un andamio relativamente simple y sin rasgos (compuesto por DOPC (1,2-sn dioleoyl- glicero-3-fosfocolina o PC) y DGS-NTA (Ni2 ⁺⁾ (1,2-dioleoil - sn -glicero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) Building fuera de estos experimentos, la carga de los lípidos, la flexibilidad, y la curvatura puede introducirse como factores individuales con el potencial de alterar las interacciones de membrana proximal. Estos cambios se pueden lograr mediante la adición de cantidades ....

Resultados

Mientras que la interacción entre Drp1 y Mff ha demostrado ser importante para la fisión mitocondrial, esta interacción ha sido difícil de recapitular in vitro. Nuestro objetivo era emular mejor el entorno celular en el que Drp1 y Mff interactúan. Con este fin, los liposomas que contienen concentraciones limitantes de NTA (Ni ²⁺⁾ grupos de cabeza se prepararon mediante rehidratación de una película de lípidos como se describió anteriormente. La solución de lípidos con.......

Discusión

Este protocolo ofrece un método para la investigación de las interacciones proteína-proteína que participa en proteínas integrales de membrana. Mediante la utilización de un andamio modular de liposomas, los investigadores son capaces de evaluar la actividad de una o más proteínas en un entorno de lípidos proximal. Estudios anteriores han demostrado un método similar para las enzimas de los receptores de la membrana plasmática ^24-26. Hemos ampliado este método para incorporar cofactores .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fosfatidilcolina (DOPC)	Lípidos polares Avanti	850375
fosfatidiletanolamina (DOPE)	Lípidos polares Avanti	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Lípidos polares Avanti	790404
corazón bovino Cardiolipina (CL)	Lípidos polares Avanti	840012
cloroformo	Acros Organics
Extrusora de liposomas	268320010 Avanti Lípidos polares	610023
rejillas de tinción negativas de Cu/Rh Tubo de	Ted Pella	79712
	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Tiras de placa de	microtitulaciónThermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Tinte Azul Instantáneo Coomassie	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Cloruro de magnesio	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Colorante de carga	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malaquita Carbinol Verde	Sigma Aldrich	229105
Molibdato de amonio Tetrahidrato	Sigma Aldrich	A7302
Película de laboratorio	Parafilm	PM-996
Acetato de uranilo	Polysciences	21447
Microscopio Tecnai T12 100 keV	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
CentriVap refrigerado Concentrador	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Lector de microplacas	Molecular Devices

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