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Artículo de método

Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia

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DOI:

10.3791/54975

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6 de marzo de 2017

 ,  , 
1Institute of Chemistry and The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para medir la fuerza de las interacciones entre una superficie inorgánica bien definido y, o bien péptidos o aminoácidos mediante medidas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula usando un microscopio de fuerza atómica (AFM). La información obtenida de la medición es importante para entender mejor la interfase material peptídico-inorgánico.

Resumen

Las interacciones entre las proteínas o péptidos y materiales inorgánicos conducen a varios procesos interesantes. Por ejemplo, la combinación de proteínas con minerales conduce a la formación de materiales compuestos con propiedades únicas. Además, el proceso no deseable de contaminación biológica se inicia por la adsorción de biomoléculas, principalmente proteínas, en las superficies. Esta capa orgánica es una capa de adhesión para las bacterias y les permite interactuar con la superficie. La comprensión de las fuerzas fundamentales que gobiernan las interacciones en la interfaz orgánica-inorgánica tanto, es importante para muchas áreas de investigación y podría conducir al diseño de nuevos materiales para aplicaciones ópticas, mecánicas y biomédicas. Este artículo demuestra una técnica de espectroscopia de fuerza de una sola molécula que utiliza un AFM para medir la fuerza de adhesión entre cualquiera de los péptidos o aminoácidos y superficies inorgánicas bien definidos. Esta técnica implica un protocolo para la fijación de la biomolécula a la AFMinclinar a través de un enlazador flexible covalente y medidas de espectroscopia de fuerza de una sola molécula por microscopio de fuerza atómica. Además, se incluye un análisis de estas mediciones.

Introducción

La interacción entre las proteínas y los minerales inorgánicos conduce a la construcción de materiales compuestos con propiedades distintivas. Esto incluye materiales con alta resistencia mecánica o propiedades ópticas únicas. 1, 2 Por ejemplo, la combinación de la proteína colágeno con la hidroxiapatita mineral genera cualquiera de huesos blandos o duros para diferentes funcionalidades. 3 Los péptidos cortos también pueden unirse materiales inorgánicos con alta especificidad. 4, 5, 6 La especificidad de estos péptidos se ha utilizado para el diseño de nuevos materiales magnéticos y electrónicos, 7, 8, 9 la fabricación de materiales nanoestructurados, el crecimiento de cristales, 10 y sintetizar nanopartículas. 11 La comprensión del mecanismo subyacente a las interacciones entre las proteínas y péptidos o materiales inorgánicos, por tanto, nos permitirá diseñar nuevos materiales compuestos con mejores propiedades de adsorción. Además, puesto que la interfase de los implantes con una respuesta inmune está mediada por proteínas, una mejor comprensión de las interacciones de las proteínas con los materiales inorgánicos mejorará nuestra capacidad de diseñar implantes. Otra área importante que implica proteínas que interactúan con superficies inorgánicas es la fabricación de materiales antiincrustantes. 12, 13, 14, 15 de la contaminación biológica es un proceso no deseable en el que los organismos se adhieren a una superficie. Tiene muchas consecuencias perjudiciales en nuestras vidas. Por ejemplo, la contaminación biológica de las bacterias en los dispositivos médicos conduce a infecciones adquiridas en el hospital. La contaminación biológica de los organismos marinos en los barcos y buques de gran tamaño aumenta la el consumo de combustible. 12, 16, 17, 18

espectroscopia de fuerza Single-molécula (SMF), utilizando un AFM, se puede medir directamente las interacciones entre un aminoácido o un péptido con un sustrato. 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 Otros métodos como la presentación de fagos, 27, 28 microbalanza de cristal de cuarzo (QCM) 29 o resonancia de plasmón superficial (SPR) 29, 30, 31, 32,ref "> 33 medida las interacciones de péptidos y proteínas a superficies inorgánicas a granel. 34, 35, 36 Esto significa que los resultados obtenidos por estos métodos se refieren a conjuntos de moléculas o agregados. En SMFS, una o muy pocas moléculas se fijan a la punta del AFM y sus interacciones con el sustrato deseado se mide. Este enfoque se puede ampliar para estudiar el plegamiento de proteínas tirando de la proteína de la superficie. Además, se puede utilizar para medir las interacciones entre las células y las proteínas y la unión de anticuerpos a sus ligandos. 37, 38, 39, 40 En este trabajo se describe en detalle cómo conectar cualquiera de los péptidos o aminoácidos a la punta del AFM utilizando la química de silanol. Además, el documento explica cómo realizar las mediciones de la fuerza y ​​la forma de analizar laresultados.

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Protocolo

1. Consejo Modificación

  1. Compra de nitruro de silicio (Si 3 N 4) voladizos AFM con puntas de silicona (radio voladizo nominal de ~ 2 nm).
  2. Limpiar cada voladizo AFM por inmersión en etanol anhidro durante 20 min. En seco a temperatura ambiente. A continuación, el tratamiento de los voladizos al exponerlos a plasma de O2 durante 5 min.
  3. Suspender las puntas limpias anteriores (3 cm) que contiene una solución de metiltrietoxisilano y 3- (aminopropil) trietoxisilano en una proporción de 15: 1 (v / v) en un desecador bajo una atmósfera inerte (nitrógeno o argón) y conectar el desecador hasta una bomba de vacío. Vacío durante 2 h para formar una monocapa de estos dos tipos de compuestos de silano mixtos.
  4. Utilice un soporte de la punta metálica (fabricada para este proceso) para colocar la punta sobre una placa caliente. Después hay que secar las puntas durante 10 minutos a 70 ° C en condiciones atmosféricas. Antes del uso, limpie la placa caliente, titular de pinzas metálicas y el uso de etanol.
  5. Enfriar las puntas en sala de temperatura y, a continuación, sumergir la punta en una solución de fluorenilmetiloxicarbonil-PEG-N-hidroxisuccinimida (Fmoc-PEG-NHS, MW 5000 Da) a una concentración de 5 mM en cloroformo que contiene 0,5% (v / v) de trietilamina durante 1 hora a temperatura ambiente.
  6. Sumergir la punta en cloroformo durante 5 minutos y luego sumergirlo en dimetilformamida (DMF) durante 5 minutos más. Con el fin de desproteger el grupo Fmoc de las moléculas de PEG unidas, sumergir la punta en piperidina al 20% (v / v) en DMF durante 30 min. Sumergir la punta en DMF durante 4 min y luego en N-metil-2-pirrolidona (NMP) para adicional 4 min. Repita la inmersión secuencial en tres ocasiones.
  7. Para el acoplamiento de aminoácidos, sumergir la punta en una solución que contiene N-terminal amino ácido protegido (AA) / diisopropiletilamina (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluophosphate (HBTU), en una relación molar de 1: 1: 1 a una concentración total de 30 mM en 5 ml de NMP durante 1,5 h.
  8. Para el acoplamiento de péptidos, sumergir la punta en una solución de 5 ml containing 40 mg del péptido protegido (N terminales y cadenas laterales, por ejemplo Fmoc-Gln (Trt) -Pro-Ala-Ser (tBu) -Ser (tBu) -Arg (PBF) Tyr (tBu) -COOH). , 15 mg de 2- (1H-benzotriazol-1-il) 1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU), y 5 ml de DIPEA en NMP durante 2 h.
  9. Sumergir la punta en NMP durante 4 min. A continuación, para proteger el escariado libre / no reaccionado NH 2 por el grupo acetilo, sumergir la punta de 30 min en una mezcla de anhídrido acético / DIPEA en una relación molar 4: 1 y una concentración total de 0,65 M en NMP.
  10. Para el acoplamiento de péptidos, realizar dos pasos adicionales.
    1. Con el fin de desproteger las cadenas laterales del péptido, sumergir la punta en una solución que contiene 95% de TFA, 2,5% triisopropilsilano, y 2.5% de agua durante 1 h, y luego se lava con cloroformo y DMF.
    2. Con el fin de eliminar el grupo Fmoc del péptido, sumergir la punta en piperidina al 20% (v / v) en DMF durante 30 min.
  11. Secuencialmente sumergir el péptido / ácido amino-funcionalizarconsejos d para cuatro min cada uno en DMF (para los péptidos) o NMP (para los aminoácidos), cloroformo, 50% de etanol y agua. Por último, secar la punta en el aire.

Preparación 2. Superficie

  1. Preparar la mica. Escindir los sustratos (9,9 mm de diámetro) antes de cada uso mediante el uso de cinta adhesiva. A continuación, lavar las superficies con agua destilada triple (TDW).
  2. Preparar TiO2 de silicio recubierta.
    1. Cortar la oblea de silicio (100) en cuadrados de 2 cm utilizando una pluma de diamantes.
    2. Coloque el sustrato en un tubo de 15 ml lleno de prueba con acetona y sonicar durante cinco minutos en un baño de ultrasonidos. A continuación, colocar esta superficie en un tubo de 15 ml de prueba lleno de isopropanol y sonicar durante 5 min. Se seca el sustrato usando nitrógeno.
    3. Disolver el agente tensioactivo (por ejemplo, BYK-348) en etanol para preparar una solución al 5% (peso / volumen). A continuación, añadir 0,02 ml de la solución de tensioactivo a un 2 dispersión 2 ml de 30% TiO.
    4. A partir de la solución resultante, Gota fundido a 0.2 ml en un sustrato de Si limpia.
    5. Recocido de estas superficies fundido-gota a 250 ° C durante 2 h en aire. 41

3. sola molécula mediciones de fuerza Espectroscopia

  1. Coloque la superficie deseada a un soporte metálico del AFM con disponible comercialmente pegamento de dos componentes. Coloque el soporte metálico en el soporte del cristal de la AFM, que está conformado como una pequeña placa de Petri. Llenar este soporte con tampón Tris (50 mM, pH = 7,4) o cualquier medio deseado. Luego, coloque el soporte en el escenario AFM por debajo del soporte de la punta.
  2. Calibrar los voladizos AFM con constantes de resorte que van de 10 a 30 pN / nm utilizando el método térmico fluctuación 26 (incluido en el software AFM) con una incertidumbre absoluta de alrededor de 10%.
  3. Medir la fuerza de la interacción por acercarse el aminoácido o péptido punta funcionalizado al sustrato hasta que esté en contacto con el sustrato con una compresiónla fuerza de ~ 200 pN y luego retraer la punta de inmediato a varias velocidades, de 0,1 a 0,8 micras / s, en una distancia de ~ 200 nm.

Análisis 4. Datos

  1. Convertir los valores de deflexión (V) para forzar al multiplicar la sensibilidad fotodiodo (V / m) y el uso de la constante de elasticidad determinado experimentalmente. 42 Esto se hace automáticamente por el software de AFM.
    1. Para obtener las curvas de productos alimenticios y bebidas con una sola molécula de eventos, ficha varios cientos de curvas (800-1,500). Obtener dos picos en una curva de una sola molécula: el primer pico indica interacciones no específicas entre la punta y la superficie y el segundo pico corresponde a la interacción específica de la molécula con la superficie. Cuando, la curva FD contiene más de estos dos picos, descartarlos del cálculo de la fuerza más probable.
      NOTA: Sólo eventos de adhesión individuales se tienen en cuenta (de 10 a 30% de las curvas). 43
  2. para calcular la tasa de carga aparente, ajuste al menos 50 fuerza frente a curvas de distancia con la cadena de gusano (WLC) modelo 44 justo antes de la ruptura para obtener un conjunto de regímenes de carga, que luego se utilizan para la preparación de los histogramas las tasas de carga evidentes. Derivar las fuerzas no vinculante entre los péptidos / aminoácidos y la superficie de la salto en vigor después de separar el voladizo del sustrato.

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Resultados

La Figura 1 muestra el procedimiento de modificación de punta. En el primer paso, un tratamiento de plasma cambia la superficie de la punta de nitruro de silicio. La punta presenta grupos OH. Estos grupos serán entonces reaccionar con los silanos. Al final de este paso, la superficie de la punta será cubierto por libres -NH 2 grupos. Estas aminas libres entonces reaccionar con Fmoc PEG-NHS, un enlazador covalente. El grupo Fmoc del enlazador PEG se elimina por...

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Discusión

Los pasos 1.3, 1.4 y 1.7 en el protocolo debería llevarse a cabo con gran cuidado y de una manera muy suave. En la etapa 1.3, la punta no debe estar en contacto con la mezcla de silano y el proceso de silanización debe llevarse a cabo en una atmósfera inerte (libre de humedad). 45 Esto se realiza con el fin de evitar la formación de múltiples capas y porque las moléculas de silano experimentan fácilmente hidrólisis en presencia de humedad. 45

E...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Beca Internacional de Reintegración Marie Curie (EP7). P. D. agradece el apoyo del Consejo Israelí para la Educación Superior.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Voladizos AFM de nitruro de silicio (Si3N4)Bruker (Camarilo, CA, EE. UU.)MSNL10, radio nominal de los voladizos ~2 nm 
Metiltrietoxisilano Acros Organics (Nueva Jersey, EE. UU.)Para la silaylación de la punta AFM 
3-(aminopropil) trietoxisilanoSigma-Aldrich (Jerusalén, Israel)Para la sililación de la punta AFM
TriisopropilsilanoSigma-Aldrich (Jerusalén, Israel)Utilizado para la desprotección de péptidos
N-EtildiisopropilaminaAlfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)Utilizado para la modificación
TrietilaminaAlfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)Utilizado para la punta modificación
PiperidinaAlfa-Aesar (Lancashire, Reino Unido)Se utiliza para la desprotección de la punta Fmoc
Fluorenilmetiloxicarbonil-PEG-N-hidroxisuccinimida  (FMOC-PEG-NHS)Iris Biotech GmbH (Alemania, Alemania)Utilizado como enlazador flexible covalente  (MW = 5.000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-hexafluorofosfato de tetrametiluronio (HBTU)Alfa Aser (Heysham, Inglaterra)Utilizado como reactivo de acoplamiento. 
N-metil-2-pirrolidona (NMP)Acros Organics (Nueva Jersey, EE. UU.)Utilizado como disolvente en el procedimiento de modificación de la punta
DMF (dimetilformamida)Merck (Darmstadt, Alemania)Utilizado como disolvente en el procedimiento de modificación
ChloroformBio-Lab (Jerusalén, Israel)Utilizado como disolvente en el procedimiento de modificación de la punta
Etanol (anhidro)Gadot (Netanya, Israel)Utilizado como disolvente en el procedimiento de modificación de la punta
Ácido trifluoroacético (TFA)Merck (Darmstadt, Alemania)
Anhídrido acéticoMerck (Darmstadt, Alemania)
PéptidosGL Biochem (Shanghai, China).
Fenilalanina y tirosina Biochem (Darmstadt, Alemania) 
Dispersión < 30% de TiO>2 en la mezcla de disolvente 2-(2-metoxietoxi) etanol (DEGME) y 3-etoxipropionato de etilo (EEP)Applied Vision Laboratories (Jerusalén, Israel)(30%) en la mezcla de disolvente 2-(2 metoxietoxi) etanol (DEGME) y 3-etoxipropionato de etilo (EEP). Se utiliza para la preparación de sustratos de TiO2
Sustratos de micaTED PELLA, INC. (Redding, California, EE. UU.)9,9 mm de diámetro
de la punta de la punta

Referencias

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