A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.
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Artículo de método
La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus
En este artículo
Resumen
Resumen
Los avances en genómica han planteado la posibilidad de sondear la biodiversidad a una escala sin precedentes. Sin embargo, la secuencia por sí sola no será informativa sin herramientas para estudiar la función de los genes. Por lo tanto, el desarrollo y el intercambio de protocolos detallados para el establecimiento de nuevos sistemas modelo en los laboratorios, y de herramientas para llevar a cabo estudios funcionales, es crucial para aprovechar el poder de la genómica. Los coleópteros (escarabajos) son el clado más grande de insectos y ocupan prácticamente todos los tipos de hábitats del planeta. Además de proporcionar modelos ideales para la investigación fundamental, los estudios de escarabajos pueden tener impactos en el control de plagas, ya que a menudo son plagas de los hogares, la agricultura y las industrias alimentarias. Se presentan protocolos detallados para la cría y mantenimiento de colonias de laboratorio de D. maculatus y para llevar a cabo interferencias mediadas por dsRNA en D. maculatus. Se describen los procedimientos de ARNi embrionarios y parentales, incluida la configuración del aparato, la preparación, la inyección y la recuperación posterior a la inyección. También se presentan métodos para analizar los fenotipos embrionarios, incluida la viabilidad, los defectos de patrón en las larvas eclosionadas y las preparaciones de la cutícula para las larvas no eclosionadas. Estos ensayos, junto con la hibridación in situ y la inmunotinción para marcadores moleculares, hacen de D. maculatus un sistema modelo accesible para la investigación básica y aplicada. Además, proporcionan información útil para establecer procedimientos en otros sistemas modelo de insectos emergentes.
Introducción
En 1998, Fire y Mello informaron de que el ARN de doble cadena (dsRNA) puede inducir la inhibición de la función de genes en Caenorhabditis elegans 1. Esta respuesta desencadenada por dsRNA se denomina ARN de interferencia (RNAi), y se informó como el silenciamiento de genes mediada por ARNi ser conservadas en los animales, las plantas y los hongos 2-7. En las plantas y algunos animales, las funciones de RNAi sistémica, lo que significa que el efecto se pueden propagar a otras células / tejidos en los que no se introduce directamente ARN de doble cadena (revisado en 8-10). Los científicos han hecho uso de esta respuesta ARNi ....
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Protocolo
1. Cría de D. maculatus
NOTA: Una colonia de reproducción de D. maculatus se creó en el laboratorio de los autores utilizando los adultos y las larvas adquirido comercialmente. La identidad de la especie se verifica por medio de códigos de barras de ADN 53.
- Para configurar una nueva jaula en el laboratorio, extender una capa delgada de virutas de madera en una jaula de insectos de tamaño mediano (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Coloque un ~ 10 x 6 x 3 cm 3 trozo de espuma de poliestireno en la jaula para que las larvas para ocultar la fase de pupa. Añadir 20 - 50 (escarabajos ....
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Resultados
Laboratorio de los autores ha utilizado la tecnología de ARNi para estudiar la evolución funcional de los genes que regulan la segmentación en los insectos 53,55. Mientras que todos los insectos son segmentados, los genes que regulan este proceso parecen haber divergido durante las radiaciones de insectos 26,38,56-63. Cribados genéticos en Drosophila identificaron un conjunto de nueve pares de reglas de segmentación de los genes que son responsables de la p.......
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Discusión
Si bien se han desarrollado un pequeño número de sistemas de modelos sofisticados (ratones, moscas, gusanos) durante el siglo 20, el siglo 21 ha visto una ola de nuevos sistemas de los animales que se desarrollan en los laboratorios de todo el mundo. Estos nuevos sistemas permiten a los científicos para hacer frente a cuestiones comparativos y evolutivos que no pueden ser palpados utilizando sólo los sistemas modelo "estándar". Este despliegue de nuevos modelos requiere el rápido desarrol.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a los Dres. Alison Heffer y Yong Lu por configurar el aparato de microinyección y compartir su invaluable conocimiento y experiencia con el ARNi de insectos. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01GM113230 a L.P.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Dermestes maculatus escarabajos vivos | Nuestro laboratorio o Carolina Biological Supply | #144168 | Nuestra cepa de laboratorio fue verificada por código de barras COI; No se puede descartar la variación de la cepa |
| de Carolina Comida húmeda para gatos | Fancy Feast | Trozos de carne con salsa. Se puede comprar en la mayoría de las tiendas de alimentos para mascotas y comestibles | |
| Comida seca para perros | Purina Puppy Chow | Se puede comprar en la mayoría de las tiendas de alimentos para mascotas y comestibles | |
| Jaula para insectos (tamaño mediano, 30,5 x 19 x 20,3 cm) | Exo Terra | PT2260 | Para el mantenimiento de colonias. Puede usar una jaula más grande si es necesario |
| Jaula para insectos (tamaño mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm) | Exo Terra | PT2250 | Para la recolección de embriones |
| Placa de Petri | VWR | 89038-968 | |
| Bola de algodón | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 kit de transcripción | Fisher | AM1334 | Para 40 reacciones |
| Bomba neumática | WPI | PV830 | |
| Soporte capilar | Micromanipulador WPI | ||
| NARISHIGE | MN-151 | ||
| Papel de filtro negro (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Colorante alimentario (verde) | McCormick | ||
| Capilar de vidrio de borosilicato | Hilgenberg | 1406119 | |
| Tirador de agujas (extractor de micropipetas) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Portaobjetos de vidrio para microscopio | 41351157 | de Ciencias de la Vida en todo el mundo | |
| Película de sellado (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Jeringa modelo 801 (10 y micro; l) | Aguja Hamilton | 7642-01 | |
| (calibre 32) | Hamilton | 7762-05 | |
| Solución de fijación (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Tóxico, debe manipularse en la campana extractora |
| Pinza (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cubreobjetos (24 x 50 mm, n.º 1,5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Punta de pipeta con microcargador | Fisher E5242956003 | ||
| Microscopía de disección para inyección de embriones | Leica | M420 | |
| Microscopía de disección para la visualización del fenotipo larvario | Zeiss | SteREO Discover. Microscopía DIC V12 | |
| Zeiss | AXIO Imager. M1 |
Referencias
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in....
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Reimpresiones y permisos
