Artículo de método

La cría y el doble-stranded RNA mediada gen desmontables en el Hide Escarabajo, Dermestes maculatus

DOI:

10.3791/54976

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28 de diciembre de 2016

 ,  , 
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

En este artículo

Resumen

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A continuación, presentamos los protocolos para la crianza de un escarabajo intermedia de gérmenes, Dermestes maculatus (D. maculatus) en el laboratorio. También compartimos protocolos para RNAi embrionario y de los padres y los métodos para el análisis de los fenotipos de embriones para estudiar la función de genes en esta especie.

Resumen

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Los avances en genómica han planteado la posibilidad de sondear la biodiversidad a una escala sin precedentes. Sin embargo, la secuencia por sí sola no será informativa sin herramientas para estudiar la función de los genes. Por lo tanto, el desarrollo y el intercambio de protocolos detallados para el establecimiento de nuevos sistemas modelo en los laboratorios, y de herramientas para llevar a cabo estudios funcionales, es crucial para aprovechar el poder de la genómica. Los coleópteros (escarabajos) son el clado más grande de insectos y ocupan prácticamente todos los tipos de hábitats del planeta. Además de proporcionar modelos ideales para la investigación fundamental, los estudios de escarabajos pueden tener impactos en el control de plagas, ya que a menudo son plagas de los hogares, la agricultura y las industrias alimentarias. Se presentan protocolos detallados para la cría y mantenimiento de colonias de laboratorio de D. maculatus y para llevar a cabo interferencias mediadas por dsRNA en D. maculatus. Se describen los procedimientos de ARNi embrionarios y parentales, incluida la configuración del aparato, la preparación, la inyección y la recuperación posterior a la inyección. También se presentan métodos para analizar los fenotipos embrionarios, incluida la viabilidad, los defectos de patrón en las larvas eclosionadas y las preparaciones de la cutícula para las larvas no eclosionadas. Estos ensayos, junto con la hibridación in situ y la inmunotinción para marcadores moleculares, hacen de D. maculatus un sistema modelo accesible para la investigación básica y aplicada. Además, proporcionan información útil para establecer procedimientos en otros sistemas modelo de insectos emergentes.

Introducción

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En 1998, Fire y Mello informaron de que el ARN de doble cadena (dsRNA) puede inducir la inhibición de la función de genes en Caenorhabditis elegans 1. Esta respuesta desencadenada por dsRNA se denomina ARN de interferencia (RNAi), y se informó como el silenciamiento de genes mediada por ARNi ser conservadas en los animales, las plantas y los hongos 2-7. En las plantas y algunos animales, las funciones de RNAi sistémica, lo que significa que el efecto se pueden propagar a otras células / tejidos en los que no se introduce directamente ARN de doble cadena (revisado en 8-10). Los científicos han hecho uso de esta respuesta ARNi celular endógeno mediante el diseño de ARN de doble cadena para apuntar genes de interés, llamando así a la baja la función de genes sin manipular directamente el genoma (revisado en 11-14).

RNAi es una herramienta poderosa para los estudios funcionales debido a las siguientes ventajas. En primer lugar, incluso con un mínimo de información de la secuencia de genes, un gen puede ser objetivo utilizando RNAi. Esto es especialmente importante para studies de organismos modelo que carecen de datos genómicos o transcriptómica. En segundo lugar, en los organismos donde la respuesta RNAi es robusta sistémica, mediada por RNAi desmontables gen se puede realizar en casi cualquier etapa de desarrollo. Esta característica es muy útil para estudiar la función de genes pleiotrópicos. En tercer lugar, en algunos casos, los efectos de RNAi se propagan a las gónadas y la progenie, como que los fenotipos se observan en la descendencia 15,16. Este fenómeno, conocido como parental RNAi (pRNAi), es especialmente ventajoso para los genes que afectan el desarrollo embrionario, tan numerosos descendencia producida por un solo padre inyectado puede examinarse sin manipulación directa de los huevos. Por estas razones, pRNAi es el método de elección. Sin embargo, si pRNAi es ineficaz, por ejemplo, para los genes necesarios para la ovogénesis, entonces embrionario RNAi (eRNAi) debe ser utilizado. En cuarto lugar, RNAi puede ser utilizado para generar el equivalente de una serie alélica en que la cantidad de dsRNA entregado se puede variar en un rango para producir débil para defectos fuertes. una gradación de fenotipos Tal puede ser útil para la comprensión de la función del gen cuando el gen está implicado en un proceso complejo y / o la pérdida completa de la función es letal. En quinto lugar, la entrega de dsRNA es generalmente fácil y factible, especialmente en animales que muestran robustas respuestas RNAi sistémicos. ARN de doble cadena puede ser introducido mediante microinyección 1,5, la alimentación / ingestión 17,18, remojo, 19,20 y virus / bacterias mediada por la entrega 21,22. En sexto lugar, a diferencia de algunos métodos de focalización / edición de genes, no hay necesidad para la detección de organismos portadores de la mutación o para llevar a cabo los cruces genéticos para generar homocigotos utilizando RNAi. Por lo tanto, en comparación con muchas otras técnicas para estudiar la función de genes, RNAi es rápido, barato, y se puede aplicar para pantallas de gran escala 23-25.

La amplia utilidad del ARNi proporciona medios para llevar a cabo estudios funcionales en una amplia gama de organismos, la ampliación de la gama de especies disponibles para el estudio Beyond los sistemas modelo tradicional para el que se han desarrollado herramientas genéticas. Por ejemplo, se requieren estudios que utilizan sistemas que no son modelos para dar una visión de la evolución de los genes y las redes de genes mediante la comparación de las funciones de los ortólogos de especies que representan diferentes modos de desarrollo o exhibir características morfológicas distintas 26-29. Estos tipos de estudios proporcionarán una mejor comprensión de la diversidad biológica, con repercusiones tanto para la investigación básica y aplicada.

Siendo el grupo animal más grande del planeta, los insectos proporcionan una gran oportunidad para explorar los mecanismos de la diversidad subyacente. Además, los insectos son generalmente pequeños, tienen ciclos de vida cortos, alta fecundidad, y son fáciles de criar en el laboratorio. En las últimas dos décadas, el ARNi se ha aplicado con éxito en los insectos que abarca órdenes, incluyendo dípteros (moscas verdaderas) 5, Lepidoptera (mariposas y polillas) 30, coleópteros (escarabajos) 16,31, himenópteros (Sawfmentiras, avispas, hormigas y abejas) 32, hemípteros (chinches), Isoptera (termitas) 34, Blattodea (cucarachas) 35, ortópteros (grillos, saltamontes, langostas y saltamontes) 36 y Phthiraptera (piojos) 37. La aplicación exitosa de RNAi ha proporcionado datos funcionales para el estudio de los patrones en la embriogénesis temprana (eje antero-posterior 32, eje dorso-ventral 28, la segmentación 26,38), la determinación del sexo 39,40, la biosíntesis de quitina / cutícula 41, ecdisona señalización 42, el comportamiento social de 43 años, y más. Métodos de ARNi desarrollados para diferentes especies de insectos pueden ser de beneficio adicional en que es probable que sea útil para el control de plagas (revisado en 44 a 46). RNAi efectos serán de genes específicos, así como específico de la especie, siempre que las regiones no conservadas se eligen para la orientación. Para las especies de insectos beneficiosos como las abejas y gusanos de seda, dirigidos a los genes vitales para la supervivencia devirus o parásitos para controlar la infección pueden proporcionar una nueva estrategia para proteger estas especies 47,48.

Dermestes maculatus (D. maculatus), nombre común ocultar escarabajo, se distribuye en todo el mundo a excepción de la Antártida. Como un insecto holometabolous, el ciclo de vida de D. maculatus incluye embrionario, larvas, pupas y adultos etapas (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus se utiliza en museos para esqueletizar animales muertos y entomólogos forenses se puede utilizar para estimar el tiempo de la muerte 49,50. D. maculatus se alimenta de productos de origen animal, incluyendo canales, carne seca, queso y las pupas / capullos de otros insectos y por lo tanto causa daño a los hogares, los alimentos almacenados, y la seda, el queso, la carne y las industrias de 51,52. La aplicación de RNAi en este escarabajo podría proporcionar una forma eficiente y respetuosa con el medio ambiente para reducir al mínimo su impacto económico. Nuestro laboratorio ha utilizado D. maculatus como un nuevo mOdel insectos para estudiar la segmentación 53. Además de ser susceptible a la cría de laboratorio, D. maculatus es de interés para la investigación básica, ya que es un desarrollador intermedio de gérmenes, por lo que es una especie útil para estudiar la transición entre el desarrollo a corto y largo germen.

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Figura 1: Ciclo de vida de D. maculatus. Las fotografías de D. maculatus en diferentes etapas de la vida, como se indica. El ciclo de vida de huevo a adulto dura tres semanas a 30 ° C, pero ya a temperaturas más bajas. (A, F), los embriones recién puestos son de color blanco a amarillo claro y ovalados, de aproximadamente 1,5 mm de longitud. Embriogénesis toma ~ 55 horas a 30 ° C. (B, C y G) Las larvas tienen rayas pigmentadas oscuras y están cubiertas de pelos. Las larvas pasan por varios estadios en función del entorno y su duración puede extenderse hasta más de 1 cm. (D, H) (E, I) Poco después de la eclosión, pigmentación oscura aparece sobre el cuerpo del escarabajo adulto. Los adultos pueden vivir hasta varios meses y una hembra puede poner cientos de embriones durante su vida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Anteriormente, hemos demostrado que el ARNi es eficaz en el derribo de genes en función de D. maculatus 53. Aquí nuestra experiencia crianza de colonias D. maculatus en el laboratorio es compartido junto con los protocolos de paso a paso, tanto para los padres embrionario y ARNi puesta en marcha, la inyección, la atención post-inyección, y el análisis fenotípico. Los métodos de derribo y análisis de genes mediada por dsRNA introducidos aquí no sólo proporcionar información detallada para abordar cuestiones de D. maculatus, sino que también tienen importancia potencial for la aplicación de RNAi en otros no modelo escarabajo / especies de insectos.

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Protocolo

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1. Cría de D. maculatus

NOTA: Una colonia de reproducción de D. maculatus se creó en el laboratorio de los autores utilizando los adultos y las larvas adquirido comercialmente. La identidad de la especie se verifica por medio de códigos de barras de ADN 53.

  1. Para configurar una nueva jaula en el laboratorio, extender una capa delgada de virutas de madera en una jaula de insectos de tamaño mediano (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Coloque un ~ 10 x 6 x 3 cm 3 trozo de espuma de poliestireno en la jaula para que las larvas para ocultar la fase de pupa. Añadir 20 - 50 (escarabajos adultos o larvas tarde). Los escarabajos se esconden en las virutas de madera.
  2. Añadir la comida para gatos en húmedo en una placa Petri o un barco de pesaje. Cubrir la jaula con tela de malla y colocar la jaula en una incubadora.
  3. Para el mantenimiento de una colonia de cría en el laboratorio, ajustar la temperatura entre 25 y 30 ° C. D. maculatus crece más rápido a temperaturas más altas, pero esto también promueve el crecimiento de hongos y ácaros. Para mantener un sanartu colonia, use 25 - 28 ° C durante regulares Stock mantenimiento y 30 ° C durante la rápida expansión de la colonia. El ciclo de vida dura aproximadamente tres semanas a cuatro meses dependiendo de factores ambientales 50 (Figura 2).

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Figura 2: D. maculatus colonia de laboratorio. Se muestra la fotografía de una jaula de insectos típica D. maculatus. virutas de madera se extienden a dejar que los escarabajos se esconden. La comida para gatos se añade en una pequeña placa de Petri o recipiente pesado. Espuma de poliestireno se coloca en la jaula como un refugio para las larvas de último instar a convertirse en crisálidas. La jaula se muestra aquí es 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 y alberga unos pocos cientos de larvas, pupas y adultos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Pastocinco huevos en la jaula para madurar. Para expandir la colonia, establecer nuevas jaulas con los huevos recogidos (como se describe en la Sección 2), larvas o adultos, como el anterior. D. maculatus ponen huevos a lo largo de la jaula, especialmente cerca de la fuente de alimento.
  2. Vuelva a colocar la comida para gatos mojada alrededor de dos veces a la semana.
    NOTA: Debido al olor desagradable de comida para gatos mojada, las fuentes alternativas de alimentos también fueron probados (ver Discusión).

2. Colección de Embriones

  1. Para configurar una colección, separar al menos 50 machos y 50 hembras de la colonia. Los adultos jóvenes son los mejores. Colocar en una jaula de tamaño mini (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) y sin virutas de madera adultos. Añadir la comida para gatos en un recipiente pesado.
  2. Antes de iniciar la recopilación, comprobar la jaula cuidadosamente en busca de embriones presentes y eliminarlos. Poner una bola de algodón se extendía en la jaula, y dejar la jaula en un 30 ° C incubadora. Después de que la ventana de tiempo adecuado, la bola de algodón estará listo para la recogida de embriones.
  3. Doblezun pedazo de papel de construcción negro (tamaño A4) por la mitad para crear un pliegue, y luego se desarrollan.
  4. Retire la bola de algodón se extendía desde la jaula. Retire los adultos de la bola de algodón y ponerlos de nuevo en la jaula.
  5. Mientras aprieta la bola de algodón estirada con mucha suavidad, destrozarlo lentamente en filamentos finos de algodón para permitir que los huevos caen sobre el papel negro.
    NOTA: D. maculatus embriones son frágiles y difíciles de ver en el algodón. Ellos se pueden triturar fácilmente si la celebración de la bola de algodón con demasiada firmeza.

3. Preparación de dsRNA

  1. Preparación de plantilla de ADN para ARN de doble cadena Síntesis
    1. Ejecutar 4-6 50 l reacciones de PCR usando los cebadores que contienen las secuencias del promotor T7 en ambos extremos 5 'para amplificar la plantilla de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    2. Se purifica el producto de PCR utilizando un kit comercial de purificación de PCR, siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración final ideal de plantilla de ADN es ≥100 ng / l.
  2. Inyección de tampón de preparación de
    1. Preparar 100 ml de tampón de inyección (0,1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM de KCl). Ajustar el pH a 6,8 con NaOH 5 M.
    2. almacenar alícuotas a -20 ° C.
  3. Síntesis dsRNA
    1. Configurar una reacción en un tubo de 0,2 ml PCR en hielo y llevar a cabo una reacción de transcripción in vitro con T7 polimerasa, siguiendo las instrucciones del fabricante, utilizando ~ 500 ng de molde por reacción.
    2. Incubar el tubo a 37 ° C durante la noche.
    3. Digerir el molde de ADN con DNasa, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    4. Calentar el tubo a 94 ° C y mantener a 94 ° C durante 3 min.
    5. Para recocer el dsRNA, enfriar lentamente el tubo por 1 ° C / min hasta que llega a 45 ° C después de 1 hr.
      NOTA: Los pasos 3.3.2 a través de 3.3.5 se puede realizar en un termociclador.
    6. Al etanol precipitado de ARN de doble cadena, añadir 280 lde RNasa libre de agua a 20 l de reacción para ajustar a un volumen final de 300 microlitros. Añadir 30 l de NaOAc 3 M (pH 5,2) y 650 l de etanol. Coloque el tubo en el congelador a -20ºC durante la noche.
    7. Después de centrifugar a 15.682 xg durante 30 min a 4 ° C, se lava el sedimento de ARN de doble cadena con 70% de etanol. pellet seco y se disuelven en 20 l de tampón de inyección.
    8. Medir la concentración de la dsRNA utilizando un espectrofotómetro a una 260. La concentración ideal es 3 - 5 de mg / l. Comprobación de la calidad mediante la ejecución de 5 l de una dilución 1:25 de dsRNA en un gel de agarosa al 1% a 90 V durante 30 min. Una sola banda del tamaño esperado será fácilmente visible.
    9. Almacenar el ARN de doble cadena a -20 ° C o menos.
      NOTA: Para cada experimento knockdown RNAi, incluye un control de dsRNA, que no se esperaría que un impacto en el proceso que está siendo estudiado. gfp dsRNA es un excelente control de la mayoría de los experimentos. Preparar e inyectar los ARN de doble cadena de control de lado a lado con el EXPERIMENTAL ARN de doble cadena.

4. Montaje de Microinyector y Micromanipulador

NOTA: Consulte la Figura 3.

  1. Conectar nitrógeno u otro suministro de aire a la entrada de presión de un instrumento de bomba neumática. Si una bomba neumática no está disponible, aplique presión con una jeringa de 50 ml conectada a un tubo fino.
  2. Conectar un interruptor de pie para el conector remoto de la bomba para controlar el flujo de la presión de expulsión.
  3. Fijar un soporte capilar de vidrio al puerto de presión de expulsión de la bomba con el tubo.
  4. Fije el soporte capilar en un micromanipulador cerca de un microscopio de disección.

5. embrionarias RNAi

NOTA: La figura 4 muestra un diagrama de flujo de D. maculatus embrionario RNAi.

  1. Preparación eRNAi
    1. Preparar un embrión recogida de Petri tapa de la placa (90 mm de diámetro). Coloque un pedazo de papel de filtro negro de csobre el interior de la tapa. Ponga un portaobjetos de microscopio estándar en el papel negro.
    2. Diluir dsRNA a la concentración apropiada con tampón de inyección. Utilice 2 - 3 mg / l para los experimentos iniciales. Siempre mantenga dsRNA en hielo antes de la inyección.
    3. Añadir el colorante de alimento a las 1:40 de dilución para el ARN de doble cadena y la pipeta suavemente varias veces para mezclar bien.
  2. Recogida de embriones para Inyección
    NOTA: A 25 ° C, núcleos de embriones de 6 - 8 horas después de la puesta de huevos (AEL) migran hacia el óvulo periferia 53. Un blastodermo celular se estableció dentro de 8 - 10 h 53 AEL. Para asegurarse de embriones antes de la etapa de blastodermo celular se utilizan para la inyección, 0 - se recomiendan embriones AEL 3 hr 53 para su uso. recogida de embriones, la preparación y la inyección suelen realizarse en menos de 2 horas si los capilares de vidrio están en buena forma. Por lo tanto, todo el proceso puede ser completado dentro de 5 AEL hr.
    1. Recoger los embriones como se describe en los pasos 2.2-2.5.
    2. Toque en el papel de construcción negro para transferir embriones en la recogida de Petri tapa de la placa.
    3. Pegue cinta de doble cara a lo largo del borde de la diapositiva.
    4. El uso de un cepillo de pintura, alinear los embriones en la cinta perpendicular al borde deslizante con el anterior o extremo posterior en el borde. Tenga en cuenta que los extremos anterior y posterior de los embriones tempranos no son fácilmente distinguibles, por tanto, en la mitad se inyectará promedio en el extremo posterior, que es ideal.
  3. Carga del ARN de doble cadena en el capilar de vidrio
    1. Tomar hasta 2 - 4 l de ARN de doble cadena en una punta de pipeta de 20 l microloader.
    2. Inserte la punta en un capilar de vidrio pre-sacado (en adelante, la aguja) y suavemente la pipeta la solución de ARN de doble cadena en el capilar. Preparar las agujas de capilares de vidrio comerciales utilizando un extractor de micropipeta. Un ejemplo de una aguja de tirado ideal se muestra en la Figura 5. pueden necesitar ser optimizado af La longitud y conicidad de agujasensayos de inyección ter.
    3. Fijar el capilar de vidrio en el soporte capilar de vidrio.
    4. Montar el soporte capilar en el micromanipulador.
  4. La inyección de dsRNA en embriones
    1. transferir con cuidado el portaobjetos con embriones en la etapa del microscopio de disección.
    2. Mueva el control a llevar un embrión hasta el centro de la microscopio de campo y el enfoque.
    3. Coloque la punta del capilar con el micromanipulador mientras se mira en el microscopio de disección. Llevar la punta cerca del final de la primera embrión en la fila.
    4. Encienda el nitrógeno u otro suministro de aire.
    5. Ajuste el selector de entrada del solenoide de vacío.
    6. Ajuste el regulador de presión de expulsión a 10 - 15 psi. Ajustar la presión en función del aparato.
    7. Abrir el capilar si es necesario. Una vez que la punta está abierta, la solución de color dsRNA se llene la punta.
    8. Mueva la punta capilar hacia adelante para perforar el correombryo. Si el ajuste de presión es ideal, no fluido embrionario fluirá en el capilar.
    9. Paso el interruptor de pedal para expulsar solución dsRNA en el embrión hasta que se expulse una cantidad apropiada de solución. La figura 5 muestra ejemplos de morfología del embrión tras la inyección de cantidades apropiadas e inapropiadas de solución.
    10. Mantenga la punta capilar en el interior del embrión durante ~ 2 segundos, y luego retirarla.
    11. Mueva el capilar a la siguiente embrión y repita los pasos 5.4.8 - 5.4.10 hasta que se inyectan todos los embriones. Cambiar capilar de vidrio si se obstruye o se rompe.
  5. La recuperación después de la inyección-e Incubación
    1. Después de la inyección, colocar la placa en una placa de Petri.
    2. Añadir una bola de algodón húmedo para la placa de Petri. No deje que la bola de algodón toque la diapositiva.
    3. Cubrir la placa de Petri y se envuelve con una película de sellado. Etiquetar el plato con el nombre del ARN de doble cadena, concentración, fecha, hora y número de inyectarembriones.
    4. Coloque la placa de Petri en una incubadora a 30 ° hasta que la escotilla de embriones.

6. RNAi parental

  1. Las pupas para aislar pRNAi
    1. Recoger las pupas de la colonia.
    2. Ordenar pupas hembra bajo el microscopio masculinos y (véase la Figura 6). Mantenga en dos placas de Petri separadas en una incubadora a 30 ° para asegurar que no se produce apareamiento antes de la inyección.
    3. Comprobar todos los días para los adultos eclosed. La pupación tiene generalmente 5 - 7 días a 30 ° C.
    4. Transferencia eclosed machos y hembras (ver Figura 6) a dos platos separados de Petri y se les dan de comer comida para gatos cada dos días hasta que estén listos para la inyección.
    5. Proceder a la inyección una vez que hay suficientes hembras y machos en edad apropiada. Las hembras de 4 a 8 días después de la eclosión son los mejores. Para un análisis típico, 8 - 12 se utilizan hembras. Se necesita un número igual de machos para aparearse 54.
    2. La inyección de dsRNA en Mujer Abdomen
    1. Preparar dsRNA en hielo (5.1.2 y 5.1.3).
    2. Conecte una aguja de calibre 32 a una jeringa de 10 microlitros.
    3. Anestesiar a las hembras en fase de CO2.
    4. Cargar solución dsRNA en la jeringa sin ocupar cualquier aire.
    5. Mantenga un lado ventral femenina con una mano y sostener la jeringa con la otra.
    6. penetrar suavemente la segmacoria (membrana) entre esternitas 2 y 3 con la punta de la aguja. La Figura 7 muestra una hembra durante la inyección. Si la aguja no penetra en el tejido fácilmente, ángulo de la aguja hacia arriba y presione hacia abajo lentamente. Inserto de aproximadamente 2 mm de la aguja en el cuerpo.
    7. Compruebe la escala de la jeringa mientras empuja lentamente el émbolo inyectando ~ 2 l por hembra.
    8. Después de la inyección, mantenga la aguja todavía durante al menos 5 segundos antes de sacarla del abdomen de la hembra.
    9. Transferencia de las hembras inyectadas a una placa de Petri (diámetro 90 mm) y se alimentan con comida para gatos.
    10. Etiquetar la placa de Petri con el nombre de ARN de doble cadena, cantidad inyectada, la fecha y el número de hembras.
  2. La recuperación después de la inyección, y el apareamiento
    1. Incubar la placa de Petri en un incubador a 30 °.
    2. Después de 24 horas, la transferencia de las hembras inyecta a una mini jaula.
    3. Añadir a la jaula de un número igual de machos jóvenes no inyectados, y la etiqueta de la jaula.
    4. Añadir un barco de pesada con comida para gatos en la jaula.
    5. Deja la jaula en una incubadora a 30 ° para permitir el apareamiento. Después de 24 horas, las mujeres deben comenzar a poner huevos y embriones pueden ser recogidos diariamente o en intervalos de tiempo requeridos.

7. El análisis fenotípico después de RNAi

NOTA: A 30 ° C, se tarda ~ 55 horas para los huevos eclosionan a 50.

  1. Análisis de Viabilidad eRNAi
    1. Calcular tasa de eclosión comparando el número de larvas incubadas a la nu total dember de los embriones inyectados. Asegúrese de incluir una inyección de control negativo como embriones pueden ser dañados o muertos por el procedimiento de inyección. tasas de eclosión típicos varían de 30% - 60%. Cuidado con las larvas nacidas comer huevos sin eclosionar.
  2. Análisis de Viabilidad pRNAi
    NOTA: Si viabilidad hembra se ve afectada por el gen blanco de RNAi, las hembras inyectados con dsRNA específico pero no control negativo dsRNA comenzarán a morir. Si se ve afectada la producción de huevos o la puesta de huevos, las hembras exhibirán esterilidad parcial o completa. Puntuación supervivencia de las hembras en comparación con los controles negativos o comparar número total de huevos puestos por hembras experimentales y de control (7.2.3).
    1. Configurar recogida de embriones siguiente paso 2.2.
    2. Después de 24 horas, recoger embriones siguientes pasos 2.4 - 2.5.
    3. Contar el número total de los embriones.
    4. La transferencia de los embriones a un plato de Petri 90 mm. Etiquetar la placa de Petri con el gen blanco, fecha de recolección, y el número de embriones.
      5. Incubar los embriones en una incubadora a 30 ° hasta que eclosionan. Ya que los piensos larvas incubadas con embriones no eclosionados, compruebe la placa de Petri con frecuencia y por separado larvas nacidas a partir de embriones no eclosionados con unas pinzas (ver Discusión).
  3. Contar el número de embriones eclosionados y calcular la tasa de eclosión.
  • El examen de los defectos de la cutícula de las larvas tramado
    1. Recoger las larvas incubadas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. En una campana de extracción, añadir 1 ml de solución de fijación.
    3. Deje el tubo de microcentrífuga a 4 ° C al menos durante la noche para permitir que la solución penetre en el tejido de las larvas.
    4. Para visualizar, eliminar la mayor cantidad de fijación del tubo como sea posible.
    5. larvas de enjuague al menos tres veces con PBST.
    6. Transferencia de las larvas a una placa de vidrio de múltiples pocillos con PBST usando una punta de pipeta P-1000 con el extremo cortado para ensancharlo.
    7. Bajo un microscopio de disección, estirar las larvas utilizando pinzas para examinar los defectos. yot es crítica para estirarse larvas para examinar los defectos de su contrato como cuerpos en fijador.
  • El examen de los defectos de la cutícula en eclosionar las larvas
    Nota: Este procedimiento es útil para el examen de fenotipos embrionarias tempranas, sobre todo para los embriones que no sobreviven a la eclosión.
    1. Para pRNAi, añadir PBST en la placa de Petri (7.2.4) y la transferencia de embriones eclosionados a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml usando una punta de pipeta P-1000 con el extremo cortado. Para eRNAi, añadir PBST en la placa de Petri (5.5.4), cepillo de embriones no eclosionados del portaobjetos de microscopio y transferirlas a un tubo de microcentrífuga.
    2. Fijar los embriones con solución de fijación y enjuague con PBST para la visualización siguiendo los pasos 7.3.2 - 7.3.6.
    3. Con unas pinzas, diseccionar embriones fuera de la cáscara de los huevos bajo un microscopio de disección en PBST.
    4. La transferencia de los embriones de nuevo a 1,5 ml tubo de microcentrífuga (~ 200 l de embriones en cada tubo).
    5. Eliminar la mayor cantidad de solUtion como sea posible.
    6. Añadir 1 ml de 90% de ácido láctico / 10% EtOH. Deje el tubo de centrífuga en una incubadora a 60 ° al menos durante la noche.
      NOTA: Los embriones se puede dejar en 60 ° C durante varios días.
    7. Para montar los embriones, una pipeta de ellos en un portaobjetos de microscopio utilizando una punta de pipeta P-1000 con el extremo cortado.
    8. posicionar manualmente los embriones con fórceps para una orientación ideal.
    9. Cubrir los embriones con un cubre y visualizar bajo el microscopio utilizando DIC.
  • El examen de los defectos Celular y Molecular
    NOTA: Este procedimiento es útil para la investigación de las causas subyacentes de la cutícula o fenotipos de letalidad que no se acompaña de defectos de la cutícula.
    1. Para pRNAi, embriones separados de las bolas de algodón en la etapa de desarrollo adecuado y las transfieren a una cesta de recogida de embriones. La cesta de recogida puede ser el mismo o similar al utilizado para las colecciones de embrión de Drosophila.
      1. Hacerla cesta del huevo de un vial de centelleo de plástico de 25 ml con la parte inferior del vial eliminado, y un círculo de corte de la tapa (más o menos 1 cm de diámetro). Coloca un círculo de super fina malla alrededor de 2,5 cm de diámetro dentro de la tapa, y luego atornillar el vial de centelleo de usar y al revés.
      2. A medida que la malla se puede quitar fácilmente una vez que los embriones se lavan, se sumerja la malla en un tubo de microcentrífuga con agua para recuperar los embriones que se pegan a la malla.
    2. Para eRNAi, en la etapa apropiada, añadir PBST a la placa de Petri. Cepillarse los embriones fuera del portaobjetos de microscopio y transferirlas a una cesta de recogida de embriones.
      NOTA: La fijación, hibridación in situ, tinción de anticuerpos, y los protocolos de tinción nuclear se pueden encontrar en Xiang et al. 2015 53.

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    Resultados

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Laboratorio de los autores ha utilizado la tecnología de ARNi para estudiar la evolución funcional de los genes que regulan la segmentación en los insectos 53,55. Mientras que todos los insectos son segmentados, los genes que regulan este proceso parecen haber divergido durante las radiaciones de insectos 26,38,56-63. Cribados genéticos en Drosophila identificaron un conjunto de nueve pares de reglas de segmentación de los genes que son responsables de la p...

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    Discusión

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Si bien se han desarrollado un pequeño número de sistemas de modelos sofisticados (ratones, moscas, gusanos) durante el siglo 20, el siglo 21 ha visto una ola de nuevos sistemas de los animales que se desarrollan en los laboratorios de todo el mundo. Estos nuevos sistemas permiten a los científicos para hacer frente a cuestiones comparativos y evolutivos que no pueden ser palpados utilizando sólo los sistemas modelo "estándar". Este despliegue de nuevos modelos requiere el rápido desarrol...

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    Divulgaciones

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Agradecimientos

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Agradecemos a los Dres. Alison Heffer y Yong Lu por configurar el aparato de microinyección y compartir su invaluable conocimiento y experiencia con el ARNi de insectos. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01GM113230 a L.P.).

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    Dermestes maculatus escarabajos vivosNuestro laboratorio o Carolina Biological Supply#144168Nuestra cepa de laboratorio fue verificada por código de barras COI; No se puede descartar la variación de la cepa
    de Carolina Comida húmeda para gatosFancy FeastTrozos de carne con salsa. Se puede comprar en la mayoría de las tiendas de alimentos para mascotas y comestibles
    Comida seca para perrosPurina Puppy ChowSe puede comprar en la mayoría de las tiendas de alimentos para mascotas y comestibles
    Jaula para insectos (tamaño mediano, 30,5 x 19 x 20,3 cm)Exo TerraPT2260Para el mantenimiento de colonias. Puede usar una jaula más grande si es necesario
    Jaula para insectos (tamaño mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)Exo TerraPT2250Para la recolección de embriones
    Placa de PetriVWR89038-968
    Bola de algodónFisher22-456-883
    Megascript T7 kit de transcripciónFisherAM1334Para 40 reacciones
    Bomba neumáticaWPIPV830
    Soporte capilarMicromanipulador WPI
    NARISHIGEMN-151
    Papel de filtro negro (90  mm)VWR28342-010
    Colorante alimentario (verde)McCormick
    Capilar de vidrio de borosilicatoHilgenberg1406119
    Tirador de agujas (extractor de micropipetas)Sutter Instrument Co.P-97
    Portaobjetos de vidrio para microscopio41351157de Ciencias de la Vida en todo el mundo
    Película de sellado (Parafilm M)Fisher13-374-12
    Jeringa modelo 801 (10  y micro; l)Aguja Hamilton7642-01
    (calibre 32) Hamilton7762-05
    Solución de fijación (Pampel's)BioQuip Products, Inc.1184CTóxico, debe manipularse en la campana extractora
    Pinza (DUMONT #5)Fine Science Tools11252-30
    Cubreobjetos (24 x 50 mm, n.º 1,5)Globe Scientific1415-15
    Eppendorf Femtotips Punta de pipeta con microcargadorFisher E5242956003
    Microscopía de disección para inyección de embrionesLeicaM420
    Microscopía de disección para la visualización del fenotipo larvarioZeissSteREO Discover. Microscopía DIC V12
    ZeissAXIO Imager. M1
    División

    Referencias

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