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Artículo de método

La identificación fiable de las neuronas dopaminérgicas de estar en el mesencéfalo culturas utilizando ARN-Secuenciación y promotor impulsado TH expresión de EGFP

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DOI:

10.3791/54981

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10 de febrero de 2017

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1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology (Caltech)

En este artículo

Resumen

En la enfermedad de Parkinson (EP), Sustancia negra (SNC) se degeneran las neuronas dopaminérgicas, que conduce a la disfunción motora. Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón expresan EGFP impulsada por una secuencia promotora tirosina hidroxilasa (TH), cosechando las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma utilizando ARN-ss.

Resumen

En la enfermedad de Parkinson (PD) hay una pérdida neuronal generalizado en todo el cerebro con la degeneración de las neuronas dopaminérgicas pronunciada en la SNC, que conduce a bradicinesia, rigidez y temblor. La identificación de la vida neuronas dopaminérgicas en cultivos primarios ventral mesencefálico (VM) usando un marcador fluorescente proporciona una forma alternativa para estudiar la vulnerabilidad selectiva de estas neuronas sin depender del inmunotinción de células fijadas. En este sentido, aislar, disociar, y la cultura neuronas de ratón VM durante 3 semanas. A continuación, identificar las neuronas dopaminérgicas en los cultivos utilizando eGFP fluorescencia (dirigido por un promotor tirosina hidroxilasa (TH)). Las neuronas individuales se recogen en tubos de microcentrífuga utilizando micropipetas de vidrio. A continuación, se lisan las células recogidas, y llevamos a cabo la síntesis de ADNc y "tagmentation" transposón mediada para producir bibliotecas de ARN-Seq sola celda 1, 2,culo = "xref"> 3, 4, 5. Después de pasar una revisión de control de calidad, las bibliotecas de unicelulares son secuenciados y posterior análisis se lleva a cabo para medir la expresión génica. Presentamos los resultados del transcriptoma para dopaminérgica individual y neuronas GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en la neurociencia y la biología molecular.

Introducción

La enfermedad de Parkinson (PD) es un trastorno neurodegenerativo incurable, relacionada con la edad. La causa de este trastorno relativamente común sigue siendo poco conocida. Hay una pérdida generalizada neuronal en todo el cerebro, con la degeneración neuronal pronunciada de las neuronas dopaminérgicas en la Substantia Nigra (SNC), que conduce a las características clínicas de diagnóstico de la bradicinesia, rigidez y temblor.

cultivos mixtos primarios que contienen las neuronas dopaminérgicas SNc son especialmente relevantes para la enfermedad de Parkinson. Área tegmental ventral (VTA) neuronas dopaminérgicas se han implicado en la recompensa y la adicción. Ventral mesencefálico (VM) primarias embrionarios culturas mixtas contienen tanto las neuronas dopaminérgicas Snc y VTA (DA) y las neuronas GABAérgicas. VM cultivos primarios pueden ser útiles para los ensayos de neuroprotección y para dilucidar la vulnerabilidad selectiva de las neuronas dopaminérgicas. No hay manera confiable para identificar las células dopaminérgicas en cultivo basándose en la morfología. Élre desarrollamos técnicas para identificar y cosechar las neuronas dopaminérgicas individuales, y construir una sola célula, bibliotecas de secuenciación de ARN de alto rendimiento.

Presentamos los datos de ARN del transcriptoma representativos de una sola neuronas dopaminérgicas y GABAérgicas en cultivos de mesencéfalo. Este protocolo se puede utilizar para la neuroprotección, neurodegeneración, y los ensayos farmacológicos para estudiar los efectos de diversos tratamientos sobre el transcriptoma DA / GABA. Debido a que las neuronas dopaminérgicas representan una pequeña minoría de las neuronas expresadas en cultivos primarios de VM, la capacidad de identificar de forma fiable estas neuronas en cultivos vivos permitirá una gama mejorada de los estudios de una sola célula. Estas nuevas técnicas facilitarán los avances en la comprensión de los mecanismos que tienen lugar a nivel celular y pueden tener aplicaciones en los campos de la neurociencia y la biología molecular en otro lugar.

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Protocolo

NOTA: Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con las directrices para el cuidado y uso de animales proporcionados por los Institutos Nacionales de Salud, y los protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional en el Instituto de Tecnología de California.

1. Derivación de Primaria cultivos celulares dopaminérgicos del cerebro de embriones de ratón

  1. Soluciones y Medio de Cultivo
    1. Preparación de ácido ascórbico de la Solución
      1. Pesar 352 mg de ácido ascórbico. Añadir H2O estéril hasta un volumen total final de 20 ml. Lugar en 37 ° C baño de agua para disolver. Se filtra a través punta de la jeringa de 0,2 micras y almacenar en 500 alícuotas a -20 ° C.
    2. Preparación de la papaína de la Solución
      1. Diluir la papaína a 15 unidades / ml en solución salina equilibrada Hanks'-1x (HBSS). Pipetear arriba y abajo 5 veces para mezclar bien. Preparar el día de la disección.
    3. Preparación de DNasa Stock Solution
      1. Pesar 20 mg de DNasa. Añadir H2O estéril hasta un volumen final total de 20 ml. filtro estéril con punta de filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 1 ml.
    4. Preparación de la solución de parada
      1. Diluir 5 ml de donantes de suero equino al 10% en 45 ml 1x HBSS. filtro estéril con una punta de filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
    5. Preparación de 4% albúmina de suero bovino solución madre (BSA)
      1. Pesar 2 g de BSA y añadir tamponada con fosfato 1x solución salina (PBS) hasta un volumen final total de 45 ml. Esterilizar por filtración con punta de filtro de jeringa de 0,2 micras. Almacenar a 4 ° C.
    6. Preparación del medio de baño
      1. En 494 ml de medio, añadir 1,25 ml de medios de cultivo que contiene L-alanil-L-glutamina (una fuente estabilizada de L-glutamina) y 5 ml de suero equino donante. Filtro de esterilizar con 0,2 micras jeringa filter punta. Almacenar a 4 ° C.
    7. Preparación de medio de cultivo celular
      1. En 196 ml de medio de chapado, añadir 4 ml B27 y ácido ascórbico 200 l. Filtro de esterilizar con 0,2 micras filtro. Almacenar la solución a 4 ° C y utilizar dentro de una semana.
    8. Preparación de paraformaldehído solución al 4% (PFA)
      Precaución: las precauciones generales para el uso de paraformaldehído son los siguientes: Utilice una campana de ventilación, evitar la piel y el contacto visual, evitar la inhalación del vapor, mantener lejos del calor o llamas libres. Usar ropa de protección personal adecuado. PFA puede causar sensibilización y dermatitis, por lo tanto, lavarse bien las manos después de manipular.
      1. Añadir 10 ml de 16% PFA a 30 ml de 1x PBS, pH 7,4.
    9. Preparación de 0,1% de Triton X-100
      1. Pipetear 1 ml de Triton X-100 en 9 ml de 1x PBS para hacer una solución de 10%. Pipeta lentamente para permitir que la solución viscosa para llenar punta de la pipeta. Caliente en 37 ° C baño de agua a disresolver. Almacenar el 10% de stock a 4 ° C.
      2. Diluir 10% stock a 0,01% (por ejemplo, mediante la realización de 2 diluciones 1:10 en serie: una solución diluida de 1 ml de 10% en 9 ml de 1x PBS para obtener una solución de 1%; 1 ml de solución al 1% en 9 ml de 1x PBS para hacer solución de 0,1%).
    10. Preparación de 10% y 1% de suero de burro
      1. Añadir 1 ml de suero de burro a 9 ml de PBS 1x para una solución de 10%. Añadir 0,5 ml de suero de burro a 49,5 ml de 1x PBS, pH 7,4 para una solución al 1%.
    11. Preparación de 1x PBS
      1. Diluir 10x PBS a 1x mediante la adición de 50 ml en 450 ml de H 2 O. Ajustar el pH de la solución a pH 7.4 utilizando un medidor de pH.
  2. El recubrimiento de las placas de cultivo
    1. Poli-L-ornitina Coating
      1. Escudo sólo el fondo de vidrio de diámetro 10 mm en el centro de todos los platos de 35 mm con 120 l de poli-L-ornitina utilizando una técnica estéril. Se incuba durante 1 hora a 37 ° C. Utilice un aspirador de vacío para aspirar el poli-Lornithine. Lavar los platos dos veces con H2O estéril
    2. Laminina Revestimiento (concentración madre de 1 mg / ml)
      1. Diluir 20 l laminina con 2 ml de H2O estéril (concentración final de 0,01 mg / ml).
      2. Escudo sólo el fondo de vidrio de diámetro 10 mm en el centro de todos los platos con 120 l de laminina diluida a 0,01 mg / ml utilizando una técnica estéril, y se incuba durante 1 h o O / N a 37 ° C antes de su uso.
  3. La disección del ratón
    NOTA: Los métodos en esta disección están diseñados para una exposición mínima de las células, ya que se transfieren a partir de sacos embrionarios a la incubadora de cultivo. La viabilidad de las células se conserva mediante la eliminación de sólo una parte del cerebro para la disección del cerebro medio. Aislamiento de las ganancias del cerebro medio más rápidamente sin la necesidad de diseccionar el cerebro entero para acceder a la región. Véase la Tabla de materiales para la cepa de ratón usada en este estudio.
    1. La eutanasia a un ratón embarazadas sincronizados en gestacional día 14 usando CO2.
    2. Pulverizar el abdomen del ratón sacrificado con 70% de etanol. Agarre la piel del abdomen inferior utilizando unas pinzas con 2 x 3 dientes y abrir la cavidad abdominal con tijeras quirúrgicas hoja roma. Hacer dos cortes que se mueven lateralmente y de forma proximal en cada lado. Plegar sobre la pared abdominal usando forceps para exponer la cavidad abdominal.
      NOTA: El útero está ahora expuesta. La exposición de la cavidad pleural y la creación de neumotórax también se asegura de que el animal no se recupera.
    3. Cortar en ambos extremos de la trompa uterina para separar el útero. Colocar en una placa de Petri en una campana estéril.
    4. Con unas pinzas de punta recta en cada mano abrir el saco embrionario y quitar el embrión. decapitar rápidamente apretando la cabeza en el cuello con las pinzas. Estabilizar la cabeza con las pinzas firmemente colocados en el hocico de modo que la superficie dorsal es accesible.
    5. Usando las pinzas almacenadas en otro hectáreand, pellizcar la capa de la piel y el cráneo justo antes de la cresta del mesencéfalo. Pelar la piel y el cráneo caudal a lo largo de la línea media. Colocar una pinza alrededor de la cresta con una punta entre la corteza y el mesencéfalo y el otro sobre el cerebelo.
    6. Pinch y eliminar todo el cerebro medio, dejando atrás el cerebro anterior en el lado rostral y el cerebelo en el lado caudal. Colocar en un plato Petri con HBSS fría bajo un microscopio de disección.
    7. Repita el procedimiento para los embriones restantes.
    8. Bajo el microscopio de disección, dar la vuelta sobre el segmento de cerebro, de modo que el lado ventral es ahora accesible. En la actualidad hay 4 cuadrantes visibles. Eliminar todas las meninges y la vasculatura agarrando suavemente las meninges y tirando hacia arriba fuera del cerebro.
    9. El uso de fórceps para estabilizar el segmento de cerebro, mientras que la separación del cerebro medio. Coloque una de las pinzas de fórceps en el ventrículo aproximadamente en el centro del segmento. Hacer la primera dorsal pellizco, señalando into el plato, a continuación, a cada lado medial. Tomar los dos cuadrantes inferiores, mediante cortes laterales a ambos lados.
      NOTA: El tejido de interés se encuentra en la sección inferior ventral, que aparece denso. Esta región contiene tanto el VTA y la SNC.
    10. Recortar y desechar el tejido que es menos denso: esto incluye el colículo superior e inferior. Coloque el tejido diseccionado que contiene tanto el VTA y SNC en HBSS fresco en una zona separada de la placa de Petri.
      NOTA: En esta etapa del desarrollo del cerebro de ratón (E14), la región de interés en el cerebro medio ventral está separado por un ventrículo de la zona incerta y otros grupos de células del hipotálamo. La estructura más alargada del desarrollo de cerebro de ratón embrionario permite la distinción entre estas zonas, que se encuentran más cerca juntos en el cerebro de ratón adulto.
    11. Repita este procedimiento para todos los segmentos restantes del cerebro.
    12. Después de todos los segmentos del cerebro han sido disecados, el uso de fórceps y un bisturí No. 11 a trimestre eala sección del cerebro medio ch en trozos de aproximadamente el mismo tamaño.
  4. Disociar las células
    1. Tratamiento enzimático de células
      1. Utilice una punta de pipeta P1000 de gran calibre para asumir todos los segmentos del cerebro medio en cuartos en la HBSS y colocarlos en un tubo cónico de 15 ml. Deje que los segmentos se depositan en el fondo del tubo y eliminar HBSS que ha sido tomado con las piezas en cuartos.
      2. Añadir 500 l de solución de papaína al tubo y colocarlo en un baño de agua a 37 ° durante 15 minutos. Resuspender las células de los dedos chasquean el tubo después de 7,5 min.
      3. Con una punta de P1000 de gran calibre, pipetas sólo los segmentos del cerebro medio en una alícuota de 1 ml de solución de desoxirribonucleasa I (ADNasa). Permitir que los segmentos a depositan en el fondo del tubo.
      4. Con una punta de P1000 de gran calibre, transferir sólo los segmentos del cerebro medio a un tubo de 15 ml que contenía 1 ml de solución de parada fría para enjuagar. Deje que los segmentos se depositan en el fondo del tubo y repetir el aclarado ence más.
    2. La trituración mecánica de la célula de suspensión
      1. Reemplazar el último enjuague con 1 ml de solución de parada fresca y la pipeta hacia arriba y abajo 7x con una punta de pipeta P1000 para triturar las células. Evitar trituración excesivo para reducir la lisis celular.
      2. UNDERLAY la suspensión de células pipeteando lentamente 200 l de solución de BSA al 4% en la parte inferior del tubo. retirar con cuidado la punta de la pipeta para no perturbar la capa de suspensión celular. Después de centrifugación a 280 xg durante 6 min, aspirar el sobrenadante con P1000 y resuspender las células en 1 ml de medio de baño.
  5. Contar y placas las células
    1. Realizar el recuento de células usando un hemocitómetro. Se diluye la suspensión celular a 1000 células / l, con el medio de baño.
    2. El uso de un aspirador de vacío, aspirar la laminina de las placas revestidas, en grupos de un máximo de tres platos. Placa 120 l (1,2 x 10 5 células / placa (78,5 mm 2 )) De la suspensión celular sobre la superficie revestida de los platos inmediatamente después de la aspiración de cada lote. Esto evita que los platos se sequen y que forma una superficie irregular.
    3. Después de 1 h, se añade cuidadosamente 3 ml de medio de cultivo a una zona no cabeza de serie de la placa de cultivo para minimizar la interrupción de las células.
    4. Realizar una media de cambio de medio completo en placas de cultivo celular a intervalos de 3 semanas durante 3 d.

Las neuronas cultivadas 2. La captura-dopaminérgicos para la secuenciación de ARN

NOTA: Una visión general del protocolo de células-cosecha y de una sola célula ARN-secuenciación se da en la Figura 1.

  1. Pasos a realizar antes del día del experimento
    1. Tubo capilar de vidrio de borosilicato Clean por sonicación en 100% de etanol durante 15 min y luego de nuevo en H2O destilada durante 15 min. Escurrir el tubo y hornear durante la noche en un horno a 200 ° C para inactivar la RNasa.
    2. Utilice recién abiertopuntas de pipeta libres de RNasa para preparar una solución madre de tampón 10X de reacción mediante la mezcla de 19 l de 10x tampón de lisis del kit de secuenciación con 1 l de la solución de inhibidor de RNasa (20 l de volumen total) en un tubo de microcentrífuga. Centrifugar la mezcla usando brevemente un micro-centrífuga y mantener en hielo.
    3. Añadir 2 l del tampón de reacción 10x a cada uno de los tubos de 0,2 ml de PCR individuales (utilizados para recoger las neuronas cosechadas). Etiquetar los tubos con etiquetas apropiadas que identifican las neuronas para ser cosechadas y almacenar congeladas a 4 ° C.
  2. Pasos para realizar en el día del experimento
    1. La fabricación de las pipetas de cosecha.
      1. Tire micropipetas de diámetro a gran punta (entre 2 - 8 micras) del tubo capilar al horno con un extractor de microelectrodos y el filamento de calentamiento con revestimiento de vidrio de un microforge. Ajuste el extractor para formar micropipetas con rosca larga. Use un microforge equipado con un retículo de ocular calibrado y un ob alta potenciasubjetivo para romper la punta de la micropipeta al tamaño deseado de propina (10 - 20 micras).
      2. Sujetar la micropipeta en el soporte de la pipeta microforge y montar el soporte en el microforge. Llevar la punta de la micropipeta en el foco sobre el filamento de calentamiento con revestimiento de vidrio usando el manipulador mecánico de la microforge y el interruptor de la corriente al filamento para calentarlo. Toque la punta de la pipeta para el filamento caliente. Desconectar la corriente cuando la punta de la pipeta se ha fundido con el diámetro apropiado.
        NOTA. Interrumpir la corriente hará que el filamento se desplace repentinamente hacia abajo y se desprenden de la punta de pipeta, produciendo una pipeta grande, con punta abierta con el diámetro deseado.
      3. Almacenar las micropipetas completados en una caja cerrada hasta que se necesite.
    2. La recolección de las neuronas.
      NOTA. Neuronas cultivadas se recogieron después de una versión modificada de un protocolo previamente publicado 6.
      1. minuciosamente clean todas las superficies de la sala de pilas de recolección que entran en contacto con los platos y las culturas que utilizan tubos de recogida de líquido desinfectante y agua seguido de un enjuague con agua. Limpie las superficies desinfectadas con etanol al 80% y luego una RNasa-inhibidor con infusión de limpiar.
      2. Llenar dos contenedores aislados con hielo, uno con hielo (agua) regular y otra con hielo seco. Coloque los tubos de recogida de 0,2 ml PCR llenaron previamente con 2 l de 10x tampón de reacción en el hielo regular.
      3. Retire la placa de cultivo que contiene las neuronas de la incubadora, drenar el medio de cultivo de la antena, enjuague con 2 ml de PBS de Dulbecco libre de RNasa (DPBS) y reemplazar con 1 ml de DPBS para la cosecha.
      4. Identificar, neuronas TH-positivas fluorescentes en los cultivos primarios del cerebro medio que utilizan un invertida, microscopio de epifluorescencia equipado con un objetivo de 40X fase, una lámpara de Hg, y un conjunto de filtro de GFP.
      5. Coloque la pipeta sobre el soma celular utilizando a mi motorizado o manualcromanipulator. Aspirar la neurona en la micropipeta de vidrio usando una succión suave aplicado por la boca a través del tubo de plástico conectado al puerto lateral del soporte micropipeta. Retire inmediatamente la micropipeta que contiene la célula de la solución de baño.
      6. Coloque la punta de pipeta dentro de un tampón de reacción que contiene 0,2 ml colección tubo de PCR, y romper la punta contra el lado del tubo, cerca del fondo. Expulsar el líquido restante (0,5 a 1,5 l) de la punta rota de la micropipeta mediante la colocación de una aguja G jeringa estéril 21 en la parte posterior de la micropipeta y la aplicación de una presión hacia fuera.
      7. Se centrifuga el tubo de recogida durante 5 s utilizando un ordenador de sobremesa de microcentrífuga y congelarlo en hielo seco. Almacenar los tubos de recogida que contienen las células individuales a -80 ° C. Normalmente, 5 células se recogen por plato durante un período de 1 h a temperatura ambiente.

3. Una sola célula RNA-Seq Biblioteca Generación

  1. Generación de la primera cadena de ADNc
    NOTA: Para los siguientes pasos utilizan reactivos del kit de secuenciación comercial.
    1. Llevar los reactivos siguientes en el hielo en el gabinete de PCR. Preparar una primera mezcla maestra hebra plus 10% mediante la combinación de los siguientes reactivos a temperatura ambiente en un armario de PCR: 2 l de 5x tampón de primera hebra, 0,25 l DTT (100 mM), 1 l de mezcla de dNTP (10 mM), 1 l de oligonucleótido ( 12 m), 0,25 l de RNasa inhibidor, y 1 l de transcriptasa inversa (100 unidades). Esta es la inversa de la transcriptasa mezcla maestra (5,5 l de volumen total por reacción).
    2. Tomar las muestras de la -80ºC en hielo seco y llevar al gabinete de PCR. Agregue lo siguiente a la muestra de células individuales: 1 l 3 'del cebador 1 y 1 l cuantificó picos de ARN. Deje que las muestras en un bloque refrigerador en un preset termociclador con tapa caliente a 72 ° C.
    3. Incubar los tubos en el termociclador durante 3 min a 72 ° C, y luego poner las muestras en un estante de refrigerador PCR.Añadir 5,5 l de la mezcla maestra (de la etapa 3.1.1) a cada tubo de reacción y se mezcla pipeteando suavemente. Girar los tubos de 0,2 l durante 5 s y se incuba en un termociclador de la siguiente manera: 42 ° C durante 90 min, 70 ° C durante 10 min. Mantener a 4 ° C.
  2. Purificación de Amplified Primera cadena de ADNc.
    NOTA: El cDNA amplificado por PCR se purifica mediante inmovilización sobre perlas magnéticas. Utilice un dispositivo de separación magnética para tubos de 0,2 mL.
    1. Alícuota de las perlas magnéticas en tubos de 1,5 mL. Antes de cada uso, trae alícuotas de perlas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos y mezclar bien para dispersar. perlas magnéticas vórtice hasta que esté bien mezclado.
    2. Añadir 25 l de perlas magnéticas a cada muestra. Mezclar con la pipeta todo el volumen arriba y abajo al menos 10 veces para mezclar bien. Se incuba a temperatura ambiente durante 8 minutos a que se unen a las perlas de ADNc.
  3. Preparación de PCR Master Mix
    1. Preparar la mezcla maestra ds-cDNA de amplificación por PCR para todas las reacciones con una adicional 10% mediante la mezcla de tampón de 5 l 10x PCR, 2 l de la mezcla dNTP (10 mM), cebador 2 (12 mM), 2 l 50x mezcla 2 de la polimerasa, y 39 l 2 l PCR nucleasa de agua libre (50 l volumen total / reacción).
  4. La amplificación de la primera cadena de
    1. Colocar las muestras y las perlas magnéticas en el dispositivo de separación magnética ≥5 minutos, hasta que el líquido aparezca completamente claro, y no hay granos que quedan en el sobrenadante.
    2. Mantener las muestras en el dispositivo de separación, una pipeta el sobrenadante y desechar. Girar las muestras durante 5 s para recoger el líquido desde el lado del tubo. Colocar las muestras en el dispositivo de separación magnética durante 30 s, a continuación, retire todo el resto de sobrenadante con una pipeta P10.
    3. Añadir 50 l de la mezcla maestra de PCR a cada tubo que contiene el ADN unido a las perlas de la etapa anterior. Se coloca el tubo en un ciclador térmico precalentado (95 ° C) con una tapa calentada. Iniciar el ciclo térmico utilizando la siguiente program: 95 ° C durante 1 min, 26 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 65 ° C durante 30 s, 68 ° C durante 6 min. A continuación, 72 ° C 10 min. Mantener a 4 ° C.
      NOTA: Consulte el manual de usuario de secuenciación para más detalles y para optimizar los ajustes de muestra.
  5. La purificación del ADNc de hebra doble amplificado
    1. Añadir 90 l de cuentas para cada muestra. Mezclar con la pipeta todo el volumen arriba y abajo al menos 10 veces para mezclar bien. Se incuba a temperatura ambiente durante 8 minutos a que se unen a las perlas de ADNc. Colocar las muestras más cuentas en el dispositivo de separación magnética para ≥5 minutos, hasta que el líquido aparezca completamente claro, y no hay granos que quedan en el sobrenadante.
    2. Mientras que las muestras están en el dispositivo de separación magnética, eliminar el sobrenadante y desechar. Mantener las muestras en el dispositivo de separación magnética. Añadir 140 l de recién hecho etanol 85% a cada muestra sin perturbar las perlas. Espere 30 s. Pipetear el sobrenadante. ADNc permanecerá ligado a la beads durante el proceso de lavado.
    3. Repetir el lavado con etanol una vez más.
    4. Brevemente girar las muestras para recoger el líquido desde el lado del tubo. Colocar las muestras en el dispositivo de separación magnética durante 30 s, a continuación, retire todo el etanol restante con una pipeta. Colocar las muestras a temperatura ambiente durante 2 a 2,5 min hasta que el pellet es seco y ya no brillante (es decir, antes de que aparezca una grieta).
      NOTA: Secar el precipitado a que sea de solo seco. El sedimento se verá mate sin brillo. Si la pastilla no está seca, el etanol se mantendrá en los pocillos de muestra, lo que reducirá la tasa de recuperación de ADNc amplificado y el rendimiento. Si el sedimento es demasiado seco, habrá grietas en el pellet. Se necesita más tiempo de 2 minutos para rehidratar y puede reducir la recuperación de cDNA amplificado y el rendimiento.
    5. Una vez que los granos están secos, añadir 22,5 l de tampón de elución para cubrir el sedimento de perlas. Retirar las muestras desde el dispositivo de separación magnética y mezclar bien para resuspender las perlas. EnCubate a TA durante 10 min para rehidratar.
    6. Girar las muestras durante 5 s para recoger el líquido desde el lado del tubo. Colocar las muestras en el dispositivo de separación magnética para ≥1 minutos, hasta que la solución está completamente claro.
      NOTA: Una pequeña población de perlas puede no sedimentar contra el imán durante la incubación. Pipetear estas perlas unpelleted arriba y hacia abajo para volver a suspender con el sobrenadante y, a continuación pipetear ellos hacia el imán en el que el resto de las perlas ya han sedimentado (sin perturbar el sedimento existente).
    7. Continuar la incubación hasta que no los granos permanecen en el sobrenadante. Transferir el sobrenadante transparente que contiene cDNA purificado de cada tubo a un tubo de baja adhesión libre de nucleasa. Etiqueta de cada tubo con la información de la muestra y se almacena a -20 ° C. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C indefinidamente.
  6. Medición de la concentración de ADN y los fragmentos de tamaño
    1. Llevar a cabo un control de calidad mediante la cuantificación de un 1 l coliquot del ADNc en un fluorómetro. Evaluar 1 l (3 ng) de ds-cDNA utilizando un sistema de electroforesis (como se describe en 1).
  7. La fragmentación de ADN
    NOTA: Utilice un kit de preparación de las muestras de ADN.
    1. Añadir 20 l de cDNA (35 ng en total) para un tubo. Añadir 25 l de ADN Tagment (TD) de tampón al tubo que contiene el cDNA.
    2. Añadir 5 l de tde1 (Tagment enzima ADN) al tubo. Pipetear arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Utilice una punta nueva para cada muestra. Centrifugar a 280 xg, a 20 ° C durante 1 min.
    3. Colocar las muestras en un termociclador con una tapa calentada y dejar que funcione a: 55 ° C, 5,5 min. Rápidamente añadir 50 l solución QG (kit de extracción de gel). Pipetear arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar. Continuar directamente al siguiente paso.
  8. La purificación del ADN fragmentado
    1. Añadir 170 l de perlas, la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para mezclar. Deje reposar durante 10 minutos. Poner los tubos en el imán. Deje que los tubos se sientan en el imán durante 10 minutos.Mientras que las muestras están en el dispositivo de separación magnética, una pipeta el sobrenadante y desechar.
    2. Deje el tubo en el imán y añadir 200 l de 85% de etanol. Deje reposar durante 30 s, a continuación, eliminar el etanol. Repetir el lavado con etanol. Girar el tubo de 1.000 xg a temperatura ambiente.
    3. Poner de nuevo el tubo en el imán. Pipeta de descuento en cualquier etanol residual. Deje secar las muestras a temperatura ambiente durante 15 min.
    4. Añadir 21 l de tampón de elución del kit de extracción de gel. Deje reposar el tubo fuera del imán, la pipeta hacia arriba y abajo 10 veces para mezclar. Deje reposar el tubo a temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Devolver el tubo para el imán de 5 min. Pipetear 20 l de solución (ADN purificado) en un nuevo tubo.
  9. Tagging y PCR La amplificación del DNA fragmentado
    NOTA: En este paso, el ADN purificado se amplifica a través de un programa de PCR de ciclo limitado. La etapa de PCR también añade índice 1 (i7) y el índice 2 (i5), así como adaptadores comunes (P5 y P7) (requerido para la generación de clúster y secuenciación). Consulte el ADN samplia guía de preparación para obtener más detalles.
    1. En un nuevo tubo de añadir 5 l de índice 2 cebadores (tapa blanca). Usando una nueva punta de pipeta añadir 5 l de índice 1 imprimación (tapa naranja). Añadir 15 l de PCR mezcla maestra a cada tubo.
    2. Añadir 5 l de PCR cóctel de imprimación a cada tubo. Añadir 20 l de ADN purificado al tubo. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 3 - 5 veces.
    3. Realizar PCR utilizando el programa siguiente en un termociclador: 72 ° C durante 3 min, 98 ° C durante 30 s, 5 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 63 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 3 min. Se mantiene a 10 ° C. Procederá inmediatamente a la PCR de limpieza o almacenar la muestra a 4 ° C durante un máximo de 2 d.
  10. Purificación de ADN amplificado fragmentos
    1. Llevar las cuentas a RT. Preparar fresca de etanol al 85%. Tomar muestras de máquina de PCR y centrifugar brevemente.
    2. Añadir 30 l de perlas al tubo. Suavemente pipeta de mezcla para arriba y hacia abajo 10 veces. Deje que el tubo de reposar a temperatura ambiente durante 5 min. lugar back en el imán durante 5 min. Con el tubo en el imán utilizar una pipeta para descartar el sobrenadante.
    3. Añadir 200 l de 85% de etanol a cada tubo. Pipeta de etanol después de 30 s. Repetir el lavado con etanol al 85%. Pipeta de etanol después de 30 s.
    4. Con los tubos todavía en el imán y las tapas abiertas, permitir que las perlas se sequen al aire durante 15 minutos. Retire los tubos del imán.
    5. Añadir 32,5 l de tampón de elución. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar fuera el imán durante 10 - 15 min.
    6. Devolver los tubos al imán durante 2 minutos, o hasta que el sobrenadante se haya resuelto. transferir cuidadosamente 30 l del sobrenadante a un nuevo tubo.
  11. Medición de la concentración de ADN y el fragmento Tamaño
    1. Llevar a cabo una comprobación de control de calidad mediante la cuantificación de la concentración de ADN de 1 l de la cDNA en un fluorómetro. Determinar el tamaño de los fragmentos de ADN por electroforesis. Evaluar 1 l (3 ng) de ADNc-.
  12. secuenciación
    1. Llevar las bibliotecas de ARN-Seq sola celda a una instalación de secuenciación. Generar 100 pb secuenciación lee en un secuenciador siguiendo un protocolo previamente publicado 4.
      NOTA: Cada biblioteca secuenciación genera> 20000000 única cartografía lee.

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Resultados

Aquí se presenta un protocolo para el cultivo de las neuronas del cerebro medio ventral de un ratón que expresa eGFP impulsado por una secuencia de promotor de la tirosina hidroxilasa, la cosecha de las neuronas fluorescentes individuales de los cultivos, y la medición de su transcriptoma de ARN usando ARN-seq (Figura 1). Los datos mostraron que 100% de las células TH-eGFP-positivos que fueron cosechados y secuenciados eran neuronas dopaminérgicas, en base a la presencia...

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Discusión

Aquí aislamos células individuales a partir de una población heterogénea utilizando una etiqueta fluorescente, a continuación, estudiar cada celda con una sola célula de ARN-ss. Nos informan de que el 100% de las células TH-EGFP en vivo que cosecharon y se secuenció eran neuronas dopaminérgicas de hecho, en base a la presencia de los siguientes tres transcripciones de genes relacionados con el DA, TH, DDC y SLC6A3. Todas las células TH-EGFP positivas expresaron estos tres genes según la evaluación de RNA-Seq. Esto es co...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (DA017279, AG033954, DA037743), la Fundación Michael J. Fox y la Iniciativa de Innovación de Caltech que financia el Laboratorio de Genética y Genómica Millard y Muriel Jacobs en el Instituto de Tecnología de California. Agradecemos a Brian Williams por optimizar el protocolo de biblioteca RNA-Seq y por brindar asistencia. Agradecemos a Henry Amrhein por su entrenamiento computacional. Agradecemos a Barbara J. Wold por el uso de su equipo y espacio de laboratorio. Agradecemos a Igor Antoshechkin por la secuenciación de la biblioteca y por la gestión de las instalaciones.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CorporaciónBioquímica Papain Worthington  
Solución salina balanceada por Hanks (HBSS), 1xGibco 14175-095
Suero EquinoDonante Thermo Scientific SH30074.03
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma A7030-50G
Medium: Medio neurobasalGibco 21103-049
Medios de cultivo que contienen una forma estabilizada de L-glutamina, L-alanil-L-glutamina: GlutaMAXGibco 35050-061Concentración final de 0,5 mM.
Ácido L-ascórbicoSigma A7506
B27Gibco 17504-04450x solución madre, 1x concentración final.
Platos con fondo de vidrio de 35 mmMatTek   P35GC-1.5-10-C
Poly-L-OrnithineSigma P4957
LamininSigma L2020Almacenado a -20 ° C en 20 y micro; L alícuotas
Desoxirribonucleasa I (DNasa)Sigma DN25
Puntas de pipeta azules P1000Sorenson Bioscience Inc. 10130
Placa de Petri poco profunda de 10 mmVWR 25384-324
37 y deg; C Baño
37 ° C, incubadora
16% de paraformaldehído (PFA)Ciencias de la Microscopía Electrónica 15710
Tritón X-100Sigma  X100-500ML
Suero de burroEquitech  SD-0100HISolución madre al 100%, concentración final al 1%.
Tijeras quirúrgicas de patrón estándarFine Science Tools14000-14
Pinzas - 2x3 dientesFine Science Tools11022-14
Pinzas - Dumont #55Fine Science Tools11295-51
Pinzas - Dumont #5Fine Science Tools11252-23
10x PBS, pH 7.4Gibco 70011-044
Dulbecco Solución tamponada con fosfato (DPBS) 1xGibco14190-144500 mL
21 G AgujaBD PrecisionGlide Aguja305167100 agujas
Extractor de micropipetasSutter Instrumentmodelo P-87
Micromanipulador Instrumento Sutter  Kit de secuenciación MP-285
: Kit de ARN ultra bajo SMARTer para secuenciación de Illumina Clontech634936100 rnxs, incl. Kit Advantage2PCR
oligonucleótido (12 y micro; M): Oligonucleótido SMARTer IIA (12 y micro; M)Del kit SMARTer 
Transcriptasa inversa (100 unidades)TranscriptasaSMARTcribe Del kit SMARTer 
Imprimación 13' Cartilla CDSIIa Del SMARTer Kit
Primer 2IS ImprimaciónDel SMARTer Kit
50x 2 mezcla de polimerasa50x Mezcla de polimerasaDel SMARTer Kit
10x TampónPCR 10x Advantage 2Del SMARTer Kit
Picos de ARNThermoFisher4456740
Rack de enfriamientoPCR IsoFreeze Rack de enfriamiento de PCR
Kit de preparación de muestras de ADN (Illumina/Nextera) NexterFC-121-103024 Muestras
Mezcla maestraPCR Nextera Mezcla maestra de PCR (NPM)Del kit Nextera 
Cóctel de cebadores PCR (PPC) Cóctel de cebadores PCR Nextera (PPC) Del kit Nextera
FluorómetroEl Qubit ThermoFisherQ33216
HS DNA BioAnalyzer kitAgilent5067-4626110 rxns
Sistema de electroforesis Bioanalizador Agilent 2100.G2938C
Perlas magnéticas: Agencourt AMPure Beckman CoulterA638805 mL
Toallita de ARNasa: Toallitas de ARNasa ZapAmbionAM9786Tamaño 100
Hojas Qubit ds HS Kit de ensayoSondas moleculares Q32854500 ensayos
Kit de extracción de gel: Qiaquick Kit de extracción de gel Qiagen 28704
Tubo capilarde vidrio (Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm de diámetro exterior)
MicroforgeNarishige (o equivalente) 
SecuenciadorIllumina HiSeq instrumento
GENSAT tirosina hidroxilasa-eGFP cepa de ratón Número de inventario MMRRC: 000292-UNCStock Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat / Centro Regional de Investigación de Ratón Mutante
LS003126de aguade 5% de humedad, inversa PCR Advantage 2 de de de

Referencias

  1. Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
  2. Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing. Genome Res. 24 (3), 496-510 (2014).
  3. Kim, D. H., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic changes in lncRNA expression during reprogramming. Cell Stem Cell. 16 (1), 88-101 (2015).
  4. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30 (8), 777-782 (2012).
  5. Gertz, J., et al. Transposase mediated construction of RNA-seq libraries. Genome Res. 22 (1), 134-141 (2012).
  6. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  7. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat Protoc. , 562-578 (2012).
  8. Srinivasan, R., et al. Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons. The Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  11. Kim, J., Henley, B. M., Kim, C. H., Lester, H. A., Yang, C. Incubator embedded cell culture imaging system (EmSight) based on Fourier ptychographic microscopy. Biomed Opt Express. (8), 3097-3110 (2016).
  12. Lammel, S., et al. Diversity of transgenic mouse models for selective targeting of midbrain dopamine neurons. Neuron. 85 (2), 429-438 (2015).
  13. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  14. Dryanovski, D. I., et al. Calcium entry and alpha-synuclein inclusions elevate dendritic mitochondrial oxidant stress in dopaminergic neurons. J Neurosci. 33 (24), 10154-10164 (2013).
  15. Kimm, T., Khaliq, Z. M., Bean, B. P. Differential Regulation of Action Potential Shape and Burst-Frequency Firing by BK and Kv2 Channels in Substantia Nigra Dopaminergic Neurons. J Neurosci. 35 (50), 16404-16417 (2015).

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