Protocolo Experimental para la detección de Las cianobacterias En muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos

Resumen

La presencia de toxinas cianobacterianas en los embalses de agua dulce para consumo humano es una gran preocupación para las autoridades de gestión del agua. Para evaluar el riesgo de contaminación del agua, este artículo describe un protocolo para la detección en campo de cepas de cianobacterias en muestras líquidas y sólidas mediante el uso de un chip de microarray de anticuerpos.

Resumen

El calentamiento global y la eutrofización hacen algunos ecosistemas acuáticos se comportan como verdaderos biorreactores que desencadenan el crecimiento rápido y masivo de cianobacterias; esto tiene consecuencias económicas y de salud relevantes. Muchas cepas de cianobacterias son productores de toxina, y sólo unas pocas células son necesarias para inducir daño irreparable al medio ambiente. Por lo tanto, las autoridades de cuerpo de agua y las administraciones requieren sistemas de alerta temprana rápidos y eficaces que proporcionan datos fiables para apoyar sus decisiones preventivas o curativas. Este manuscrito informa de un protocolo experimental para la detección en el campo de las cepas de cianobacterias productoras de toxinas mediante el uso de un chip de microarray de anticuerpos con 17 anticuerpos (ABS) con resolución taxonómica (CYANOCHIP). Aquí, un inmunoensayo múltiplex fluorescente microarrays sandwich (FSMI) para el seguimiento simultáneo de 17 cepas de cianobacterias encuentra con frecuencia que florece en ecosistemas de agua dulce, algunos de ellos productores de toxina, se describe. Un microarray con multiPLE réplicas idénticas (hasta 24) de la CYANOCHIP se imprimen en un solo portaobjetos de microscopio para probar simultáneamente un número similar de muestras. Las muestras líquidas pueden ser probados ya sea por incubación directa con los anticuerpos (Abs) o después de la concentración de células por filtración a través de un filtro de 1 a 3 micras. Las muestras sólidas, tales como sedimentos y rocas molidas, se homogeneizan en primer lugar y se dispersaron por una de ultrasonidos de mano en un tampón de incubación. A continuación, se filtran (5-20 micras) para retirar el material grueso, y se incuba el filtrado con Abs. Inmunorreacciones se revelan por una incubación final con una mezcla de la Abs marcado con fluorescencia 17 y son leídas por un detector de fluorescencia portátil. Todo el proceso dura alrededor de 3 horas, la mayor parte corresponde a dos períodos de 1 h de incubación. La salida es una imagen, donde puntos brillantes corresponden a la detección positiva de los marcadores de cianobacterias.

Introducción

La detección y el seguimiento de los microorganismos en las comunidades microbianas naturales complejos son cruciales en muchos campos, incluyendo la biomedicina, la ecología del medio ambiente, y la astrobiología. Las cianobacterias son microorganismos procariotas bien conocidos por su capacidad para formar floraciones (proliferación excesiva de células) en agua dulce. Son ubicuos, y muchas especies son capaces de producir toxinas, lo que lleva no sólo a un riesgo potencial para la salud humana, sino también a un impacto ecológico. A este respecto, es esencial para desarrollar métodos rápidos y sensibles para la detección precoz de las cianobacterias

Protocolo

1. Preparación de los inmunógenos

1. Crecer cada cepa de cianobacterias en el medio de cultivo correspondiente en las condiciones descritas en la Tabla 1.
   NOTA: El medio de crecimiento y condiciones de cultivo para cada cepa cianobacterias se enumeran en la Tabla 1. Todas las cepas de cianobacterias, con la excepción de K17, pertenecen al grupo de Antonio Quesada de la Universidad Autónoma (Madrid, España). El anticuerpo contra rubescens Planktothrix se genera a partir de una muestra natural de la floración monoespecífico de esta cianobacteria de Vilasouto depósito (norte de España).
2. Cuantif....

Resultados

Este trabajo describe una prueba de inmunoensayo múltiplex para la identificación simultánea de las especies de cianobacterias de agua dulce más relevantes (Tabla 1) utilizando el microarray de anticuerpos CYANOCHIP. El microarray puede ser un formato 3 x 8 microarrays impresos en portaobjetos de microscopio. Cada micromatriz se compone de un conjunto de 17 anticuerpos impresos en un patrón de puntos por triplicado, sus anticuerpos pre-inmunes correspondientes y BSA como.......

Discusión

Aquí, un inmunoensayo de tipo sándwich fluorescente multiplex usando el CYANOCHIP, una micromatriz 17-anticuerpo para la detección y la identificación de una amplia gama de géneros de cianobacterias, se describe ^22. Estas cianobacterias representan los géneros bentónicas y planctónicas más frecuente en hábitats de agua dulce, algunos de ellos productores de toxinas que son. Recientemente, el formato de inmunoensayo sándwich fluorescente se ha utilizado para identificar microorganismos y .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Filtros de diámetro de poro de 0,22 mm	Millipore	GSWP04700	Para la preparación de inmunógenos
Microcentrífuga Eppendorf  5424R	Fisher Scientific		Para la preparación de inmunógenos
Tampón de fosfato salino (PBS) pH 7,4 (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011036	50 mM fosfato de potasio, 150 mM NaCl, pH 7,4
Procesador ultrasónico UP50H	Hielscher		Para la preparación de inmunógenos
Adyuvante completo de Freund	Sigma-Aldrich	F5881	Inmunopotenciador
Incompleto Adyuvante de Freud	Sigma-Aldrich	F5506	Para inyecciones de refuerzo
Kit de purificación de anticuerpos de proteína A	Sigma-Aldrich	PURE1A	Para el aislamiento de IgG
Dispositivos de filtrado centrífugo MWCO< 100 kDa	Millipore	UFC510096-96K	Para el aislamiento de tubos de
diálisis IgG, benzoilados	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	Para el aislamiento de columnas IgG
Illustra Microspin G-50	GE-HealthCare	GE27-5330-02	Para el aislamiento del
reactivo IgG Bradford	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	Para cuantificar la concentración de anticuerpos
Kit de ensayo de proteínas MicroBCA	Thermo Scientific	23235	Para cuantificar la concentración de anticuerpos
Tampón de matriz de proteínas 2x	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Tampón de impresión; 30 - 40% glicerol en 1x PBS con 0.01% Tween
20 Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Detergente no iónico
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  para impresión; reactivo de bloqueo
Microplaca de 384 pocillos	Genetix	X6004	Para la impresión de anticuerpos
Matriz robótica para portaobjetos múltiples	MicroGrid II Matriz TAS de Digilab		Para la impresión de anticuerpos
Portaobjetos de vidrio con sustrato epoxi	Arrayit corporation	VEPO25C	Soporte sólido para la impresión
de anticuerpos Alexa Fluor-647 Éster de succinimidil	Sondas moleculares	A20006	Fluorocromo
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Disolvente de fluorocromo
Heidolph Titramax agitador de plataforma vibratoria	Fisher Scientific		Para el etiquetado de anticuerpos
Columnas Illustra Microspin G-50	Cuidado de la salud	27-5330-01	Para la purificación de anticuerpos marcados
Tubo marrón de 0,5 ml con sello seguro	Sarstedt	72,704,001	Para almacenamiento de anticuerpos marcados
Espectrofotómetro Nanodrop 1000	Thermo Scientific		Para cuantificar la concentración de anticuerpos y la eficiencia de marcaje
3 µ m tamaño de poro policarbonato filtro de 47 mm de diámetro	Millipore	TMTP04700	Para concentrar células
1 M solución de clorhidrato de Trizma pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	Para la preparación de TBSTRR; para bloquear portaobjetos
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Para la preparación TBSTRR
20 y micro; m filtros de nylon	Millipore	NY2004700	Para la preparación de extractos medioambientales
10 - 12 mm Portafiltros	Millipore	SX0001300	Para la preparación de extractos medioambientales
Cóctel de inhibidores de proteasas	Sigma-Aldrich	P8340	Para el almacenamiento de extractos ambientales
1 M solución de clorhidrato de Trizma pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	Para bloquear portaobjetos
Heidolph Duomax 1030 agitador de plataforma oscilante	VWR		Para bloquear portaobjetos; para procesos de incubación
Microcentrífuga de miniarrays VWR Galaxy	VWR	C1403-VWR	Para secar portaobjetos
Casete de hibridación de microarrays Multi-Well	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette para 24 ensayos por portaobjetos
Escáner de microarrays GenePix 4100A	Escáner de Molecular Devices		para fluorescencia
Software GenePix Pro	Software de Molecular Devices		para análisis y cuantificación de imágenes