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Artículo de método

En Vivo Investigación de Terapia de luz azul antimicrobianos para multirresistente Acinetobacter baumannii infecciones de quemaduras El uso de bioluminiscencia Imaging

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DOI:

10.3791/54997

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28 de abril de 2017

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1Wellman Center for Photomedicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Medical Oncology, Beijing Institute of Translational Medicine, Chinese Academy of Sciences, 3Cancer Center, Aviation General Hospital, Beijing, 4Infectious Disease Service, Brooke Army Medical Center

En este artículo

Resumen

Las infecciones causadas por cepas bacterianas multirresistentes (MDR) se han convertido en una grave amenaza para la salud pública, lo que requiere el desarrollo de terapias alternativas. Presentamos un protocolo para evaluar la efectividad de la terapia antimicrobiana con luz azul (aBL) para las infecciones por MDR Acinetobacter baumannii en quemaduras de ratón mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia.

Resumen

Queman las infecciones continúan siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. La creciente aparición de bacterias resistentes a múltiples fármacos (MDR) ha conducido al fracaso frecuente de los tratamientos tradicionales con antibióticos. Se necesitan urgentemente terapias alternativas para hacer frente a las bacterias resistentes a múltiples fármacos.

Un enfoque no antibiótico innovador, antimicrobiano luz azul (ABL), ha demostrado eficacia prometedora contra las infecciones resistentes a múltiples fármacos. El mecanismo de acción de ABL no está todavía bien entendido. Se plantea la hipótesis comúnmente que ocurre naturalmente cromóforos fotosensibilizadores endógenos en bacterias (por ejemplo, porfirinas libres de hierro, flavinas, etc.) son excitados por Abl, que a su vez produce citotóxicos especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de un proceso fotoquímico.

A diferencia de otro enfoque antimicrobiana basada en la luz, la terapia fotodinámica antimicrobiana (TFDa), terapia de ABL no requiere la participación de un photosensitiz exógenoer. Todo lo que necesita para tener efecto es la irradiación de luz azul; Por lo tanto, es simple y barato. Los receptores ABL son los fotosensibilizadores celulares endógenos en bacterias, en lugar del ADN. Por lo tanto, Abl se cree que es mucho menos genotóxico a las células huésped que la irradiación ultravioleta C (UVC), lo que provoca daños en el ADN directamente en las células huésped.

En este trabajo, se presenta un protocolo para evaluar la eficacia de la terapia de ABL para MDR Acinetobacter baumannii infecciones en un modelo de ratón de lesión por quemadura. Mediante el uso de una cepa bioluminiscente ingeniería, hemos sido capaces de controlar de forma no invasiva el grado de infección en tiempo real en animales vivos. Esta técnica es también una herramienta efectiva para el control de la distribución espacial de las infecciones en animales.

Introducción

Infecciones quemar, que se presentan con frecuencia debido a las lesiones cutáneas térmicas, siguen siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad 1. El tratamiento de las infecciones de quemaduras ha sido comprometida aún más por la creciente aparición de (MDR) cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos 2 debido a la utilización masiva de antibióticos. Una bacteria Gram-negativas MDR importantes es Acinetobacter baumannii, que es conocido por estar asociado con heridas de guerra recientes y es resistente a casi todos los antibióticos disponibles 3. La presencia de biofilms en los focos lesionada ha informado 4, 5 y se cree que agravar la tolerancia a los antibióticos y la defensa del huésped 6, 7, causando infecciones persistentes 8, 9. Por lo tanto, existe la vasopresinag necesita para el desarrollo de tratamientos alternativos. En la Estrategia Nacional de Lucha contra la recientemente anunciada bacterias resistentes a antibióticos, el desarrollo de terapias alternativas a los antibióticos ha sido señalado como una acción por parte del gobierno de los Estados Unidos 10.

enfoques antimicrobianos basados ​​en la luz, como se indica por el nombre, requieren irradiación de luz con o sin otros agentes. Estos enfoques incluyen la terapia antimicrobiana fotodinámica (TFDa), ultravioleta C (UVC) la irradiación, y la luz azul antimicrobiano (ABL). En estudios anteriores, que han demostrado eficacia prometedora en matar cepas bacterianas resistentes a múltiples fármacos 11, 12, 13. Entre los tres enfoques basados en la luz, abl ha atraído una atención creciente en los últimos años debido a sus propiedades antibacterianas intrínsecas sin el uso de fotosensibilizadores 14. en comparIson a TFDa, Abl sólo implica el uso de la luz, mientras que TFDa requiere una combinación de luz y un fotosensibilizador. Por lo tanto, ABL es simple y barato 14. En comparación con UVC, Abl se cree que es mucho menos citotóxico y genotóxico a las células huésped 15.

El objetivo de este protocolo es investigar la eficacia de ABL para el tratamiento de infecciones de quemaduras causadas por A. baumannii multirresistente en un modelo de ratón. Utilizamos bacterias patógenas bioluminiscentes para desarrollar nuevos modelos de ratón de las infecciones de quemaduras que permiten la monitorización no invasiva de la carga bacteriana en tiempo real. En comparación con el método tradicional de toma de muestras de fluidos corporales / tejidos y la posterior siembra y recuento de colonias 16, esta técnica proporciona resultados precisos. El proceso de muestreo de tejido podría introducir otra fuente de error experimental. Puesto que la intensidad de la luminiscencia bacteriana es linealmente proporcional a la corresponding bacteriana CFU 17, podemos medir directamente la supervivencia de las bacterias después de una cierta dosis de irradiación de luz. Mediante la supervisión de la carga bacteriana en animales vivos recibir el tratamiento con luz en tiempo real, la cinética de la destrucción bacteriana se pueden caracterizar utilizando un número significativamente reducido de ratones.

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Protocolo

1. Preparación de cultivo bacteriano

  1. Añadir 7,5 ml de infusión cerebro corazón (BHI) medio a un tubo de centrífuga de 50 ml. Seed células A. baumannii en el medio BHI y luego Incubar el cultivo A. baumannii en una incubadora orbital (37 ° C) durante 18 h.
  2. Centrifugar el cultivo de células a 3.500 xg durante 5 min, eliminar el sobrenadante, y se lavan los gránulos en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  3. Vuelva a suspender los pellets de bacterias en PBS fresco y la pipeta a fondo la suspensión.
  4. Recoger 100 l de la suspensión bacteriana y hacer una dilución 1:10 utilizando fresco PBS.
  5. La transferencia de la dilución a un 1,5 ml cubeta semi-micro y medir la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 600 nm (OD 600 nm).
  6. Calcular la OD 600 nm de la suspensión original (sin diluir) en PBS de acuerdo con el valor nm OD 600 medido de la dilución y el factor de dilución (10).
  7. Ajuste ºe suspensión original en PBS a OD 600 nm = 0,6 (correspondiente a una densidad celular de 10 8 UFC / ml).

2. Modelo de ratón de la infección causada por la quemadura bioluminiscente A. baumannii

  1. BALB / c ratones Uso de adultos hembra de 7-8 semanas y un peso de 17-19 g. Permitir a los ratones para aclimatarse a las condiciones del laboratorio durante al menos 3 días antes del inicio del experimento. Mantener los ratones en un ciclo de 12 h de luz / oscuridad bajo una temperatura ambiente de 21 ℃ y darles comida y agua ad libitum.
  2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Ligeramente tocar el palpebra de cada ratón con un hisopo de algodón; una ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad de la anestesia apropiada. Cubrir los ojos del ratón con ungüento veterinario para evitar que los ojos de la sequedad durante la anestesia.
  3. Shave los ratones en la parte posterior para exponer la piel tanto como sea posible mediante el uso de un 50-cuchilla cortadora de cabello.
  4. Coloque la tapa de un 35 mm placa de Petri debajo de los abdómenes de los ratones para mantener la espalda en una posición relativamente horizontal.
  5. hervir agua en un vaso de precipitados de 250 ml (80% lleno) utilizando un x 10" , 220 VAC placa de cocción 10" . Sumergir un bloque de latón (1 cm sección transversal x 1 cm) en el vaso de precipitados hasta que se alcanza el equilibrio térmico con el agua. equilibración térmica por lo general toma <5 min y se indica mediante el re-ebullición del agua en el vaso de precipitados.
  6. Antes de la creación de la lesión por quemadura, administrar analgésicos de anticipación (una inyección subcutánea de 0,1 mg de buprenorfina / kg) para el alivio del dolor.
  7. Diez minutos después de que los analgésicos de anticipación, presionar suavemente el bloque de latón calentado a la zona afeitada en la parte posterior de los ratones durante 7 s para inducir heridas de quemaduras.
    NOTA: Para evitar la lesión térmica al personal de trabajo, el desgaste guantes térmicos resistentes al realizar el procedimiento de grabación.
  8. Administrar 0,5 ml de solución salina estéril a través de subcutaneous inyección para prevenir la deshidratación.
  9. Cinco minutos después de la inducción de la lesión térmica, inocular 50 l de suspensión bacteriana que contenía 5 x 10 6 CFU en PBS sobre las quemaduras de ratón utilizando una pipeta. Al mover un bastoncillo de algodón estéril en un movimiento en zigzag en la piel, frotis de las alícuotas sobre las quemaduras para distribuir las células bacterianas en la zona quemada lo más uniformemente posible.
  10. Inmediatamente después de la inoculación bacteriana, realizar imágenes de bioluminiscencia para las quemaduras infectadas, como se describe en la Sección 4.
  11. Coloque los ratones en un lecho quirúrgico calentado-agua (37 ° C, zona de recuperación) hasta que los ratones se han recuperado completamente de la anestesia. Casa los ratones con un número máximo de 5 por jaula en un nivel de bioseguridad 2-habitación animal.
  12. Administrar analgésicos (inyección subcutánea de 0,1 mg de buprenorfina / kg) dos veces al día durante los tres primeros días después de la lesión por quemadura.

3. antimicrobiana terapia de luz azul para A. & #160; La infección baumannii en ratones

  1. Iniciar la terapia abl a las 24 h después de la inoculación bacteriana.
  2. Utilice un diodo emisor de luz (LED) con un pico de emisión a 415 nm para la irradiación ABL. Montar el LED en un disipador de calor para evitar efectos térmicos en la zona irradiada en ratones 18. Fijar el LED a una varilla de soporte óptico con conectores de clip para permitir que el LED para moverse hacia arriba y hacia abajo.
  3. Encienda el medidor de potencia / energía y pulse el botón para seleccionar la longitud de onda de 415 nm. Restablecer el medidor de potencia / energía para restar el fondo (luz ambiente).
  4. Coloque el medidor de potencia / energía justo debajo del LED. Llevar gafas de luz azul-protectores. Encender la luz LED y ajustar la distancia entre la abertura de LED (una lente que converge la luz del LED) y el sensor de luz (2 cm de diámetro) del medidor de potencia / energía de modo que el punto de luz cubre toda el área de el sensor de luz.
  5. Con cuidado sintonizar el conductor y el LED se registra la lectura de la Potenciar / metro de energía. Calcular la irradiancia de acuerdo a la lectura: Irradiación = Lectura (W) / Área (cm 2). Ajustar la irradiancia del LED a 100 mW / cm2 sintonizando el controlador de LED.
  6. Apagar el LED. Medir la distancia entre la abertura de LED y el sensor de luz del medidor de potencia / energía.
  7. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Una ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad de la anestesia apropiada.
  8. Aleatoriamente dividir a los ratones en un grupo tratado-ABL (n = 10) y un grupo no tratado de control (n = 10).
  9. Para el grupo tratado-Abl, cubrir los ojos de ratones con papel de aluminio para evitar la sobreexposición a la luz. Colocar las quemaduras de ratón directamente bajo el LED, con la tapa de una placa de Petri de 35 mm por debajo de la abdomen ratón para mantener la espalda en una posición horizontal.
  10. Cambiar el medidor de potencia / energía mencionado en el paso 3.5 con un ratón en una plaza de Petri dish. Ajustar la altura del ratón de nuevo a una posición donde la distancia entre la abertura de LED y la superficie de la quemadura ratón es igual a la existente entre la abertura de LED y el nivel del sensor de luz del medidor de potencia / energía (como se explica en el paso 3.5).
  11. Irradiar las quemaduras infectadas con una irradiancia de 100 mW / cm2. Entregar ABL en dosis de 72 J / cm 2 hasta una dosis total de 360 J / cm 2 se alcanza (por ejemplo, 0, 72, 144, 216, 288 y 360 J / cm 2). Después de cada dosis de luz, realizar imágenes de bioluminiscencia para los ratones, como se discute en la Sección 4.
  12. Para el grupo de control no tratado, realizar imágenes de bioluminiscencia de las quemaduras de ratón, como se discute en la Sección 4, usando los mismos intervalos de tiempo tal como se utiliza para el grupo tratado-ABL.
  13. Antes de la recuperación de los ratones, colocar los ratones en el lecho quirúrgico calentado agua para evitar la pérdida de calor y la hipotermia. Observar la actividad y el reflejo palpebral de los ratones hasta su recuperación. Despúes THrecuperación e de los ratones, casa de ellos 2-3 por jaula.
  14. Después de la terapia Abl, realizar imágenes de bioluminiscencia, como se discute en la Sección 4, diariamente durante los 3 primeros días y luego en días alternos para supervisar el temporal bio-carga de las infecciones en ratones.

4. La bioluminiscencia Imaging de infecciones en ratones

  1. Image los ratones utilizando un sistema de imagen bajo luz que incluye una cámara de intensificación de carga acoplada dispositivo, un controlador de la cámara, una cámara de muestra, y un procesador de imagen 19.
  2. Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de un cóctel de ketamina-xilazina (100 mg / kg - 20 mg / kg). Ligeramente tocar el palpebral de los ratones con un hisopo de algodón; una ausencia del reflejo palpebral sugiere una profundidad de la anestesia apropiada.
  3. Iniciar el software de imágenes en vivo. En el panel de control que aparece, haga clic en Inicializar. Esperar hasta que el color de la caja de la temperatura se vuelve verde, lo que indica que la temperatura de la etapaen la cámara de muestra ha llegado a 37 ° C.
  4. Coloque los ratones de la etapa (37 ° C) en la cámara de muestra del dispositivo de formación de imágenes, con las quemaduras infectadas directamente debajo de la cámara.
    NOTA: La bioluminiscencia de las bacterias podría disminuir cuando las quemaduras se secan. Por lo tanto, se recomienda para hidratar las quemaduras de ratón con PBS antes de la formación de imágenes.
  5. En el panel de control, ponga una marca de verificación junto a "luminiscencia". Seleccione "Exposición automática" para que el tiempo de exposición para la imagen será optimizada por el software de imágenes en vivo basado en la intensidad de la bioluminiscencia.
  6. Seleccionar "C" de la lista desplegable "Campo de visión". Seleccionar la opción "Búsqueda de rango medio" para permitir que el software determine la distancia focal. Ponga una marca de verificación junto a Overlay.
  7. Haga clic en "Adquirir" para capturar la imagen. En el cuadro "Editar imagen Etiqueta", haga clic en "OK"; aparecerá una "Ventana de imagen" y "Toll paleta".
  8. Establecer los parámetros de Auto ROI para auto-selección.
  9. Cuantificar la intensidad bioluminiscencia como unidades relativas de luminiscencia (RLU) y mostrar la bioluminiscencia en una escala de color falso que van desde rosa (más intensa) a azul (menos intensa) 19, 20.
  10. Calcular la fracción de supervivencia de las bacterias en quemaduras de ratón en diferentes puntos de tiempo sobre la base de análisis de intensidad bioluminiscencia. La fracción de supervivencia de las bacterias en un punto de tiempo dado = la intensidad de bioluminiscencia medido en ese punto de tiempo / la intensidad de bioluminiscencia medido justo antes de la exposición ABL 17.

5. La eutanasia de los ratones

  1. Los criterios de valoración del experimento son los siguientes: (a) resolución de la infección como se evidencia por la pérdida de la bioluminiscencia como se determina por formación de imágenes; (B) aparición de infecciones sistemáticas como se indica por la propagación de la bioluminiscencia fuera del quemado sonun; (C) pérdida de peso corporal ≥15% en comparación con los ratones normales emparejados por edad, o el sufrimiento de dolor y angustia, como se indica por la falta de capacidad de respuesta a la estimulación manual, inmovilidad, la incapacidad de comer o beber. Durante el estudio, si nos encontramos con una situación en la que no estamos seguros de si un ratón se ha alcanzado plenamente la condición de moribundo, como se indica por nuestra definición, y / o no estamos seguros si tenemos que practicar la eutanasia, nos pondremos en contacto con un personal veterinario CCM para un plan de acción; (D) de lo contrario los ratones se sacrificaron 30 días después del comienzo del estudio.
  2. Reubicar los ratones en jaulas cerradas específicamente para la eutanasia y la eutanasia a los ratones mediante la entrega de dióxido de carbono (CO 2) de gas comprimido en las jaulas.
    1. Abrir el CO 2 tanque o válvula reguladora para iniciar el flujo de gas. Verificar que el regulador lee la psi correcta (libras por pulgada cuadrada) en base a las instrucciones publicadas por la unidad, y ajustar el regulator a la psi correcta según sea necesario, típicamente no más de 5 psi.
    2. Llenar lentamente. La velocidad de flujo debe desplazar a no más de 30% del volumen de la cámara / jaula por min (para una jaula típica ratón, ~ 2 L / min; para una jaula de ratas, ~ 7,5 L / min).
    3. Espere aproximadamente 3-5 min para que el animal deje de moverse o respirar; los ojos deben estar fijas y dilatadas. Desactive CO 2 tanque o válvula de regulación para detener el flujo de CO 2.
    4. Asegúrese de que el corazón no late al sentir el pecho entre el pulgar y el índice. Asegúrese de que no hay un reflejo de parpadeo al tocar el globo ocular.
      1. Si hay un latido del corazón o reflejo de parpadeo, repetir el proceso de la eutanasia o utilizar tijeras para abrir la cavidad torácica para crear un neumotórax (el animal debe ser no sensible a una pizca dedo del pie antes de realizar este procedimiento).

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Resultados

La cepa de A. baumannii que usamos es un aislado clínico MDR, como se informó anteriormente 12, 17. La cepa bacteriana se hizo bioluminiscente por la transfección de luxCDABE ópera 11. La Figura 1A muestra las sucesivas imágenes de luminiscencia bacterianas de un ratón representativo queman infectado con 5 x 10 6 A. baumannii y se expusieron a una sola...

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Discusión

Abl es un nuevo método para el tratamiento de infecciones. Desde su mecanismo de acción es completamente diferente a la de la quimioterapia, es más de un fisioterapia. El agente que media el efecto antimicrobiano es la irradiación con luz azul (400-470 nm). Con el desarrollo de los LEDs azules, ganamos acceso a un enfoque basado en la luz antimicrobiano eficaz y sencilla para las infecciones resistentes a múltiples fármacos.

En este protocolo, hemos descrito el desarrollo de un modelo de rat...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado en parte por el Centro para la Integración de la Medicina y la Tecnología Innovadora (CIMIT) bajo el Acuerdo Cooperativo de Actividad de Adquisición de Investigación Médica del Ejército de EE. UU. (CIMIT No. 14-1894 a TD) y los Institutos Nacionales de Salud (1R21AI109172 a TD). YW fue apoyado por una Beca de Investigación Estudiantil de ASLMS (BS. S02.15). Estamos agradecidos a Tayyaba Hasan, PhD en el Centro Wellman por su co-mentoría para YW.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IVIS PerkinElmer Inc, Waltham, MAIVIS Lumina Series IIIImágenes preclínicas in vivo
diodo emisor de luz LEDVieLight Inc, Toronto, Canadá 415 nmFuente de luz para iluminación Medidor de
potencia/energíaThorlabs, Inc., Newton, NJPM100D Detectorde irradiancia de luz
Mouse Charles River Laboratories, Wilmington, MABALB/c7-8 semanas de edad, 17-19 g de peso
Acinetobacter baumannii  Brooke Centro Médico del Ejército, Fort Sam Houston, TXAislamiento clínicoCepa luminiscente diseñada
Jeringas de insulinaFisher Scientific14-826-79BD Lo-Dose U-100 Jeringas de insulina
Cloruro de sodio FisherScientific721016con cloruro de sodio al 0,9 %,
1x soluciónFisher ScientificBP24384 Un tampón de fosfato estándar utilizado en muchos procedimientos biomoleculares
Infusión cerebro-corazónFisher ScientificB11059Medio de cultivo bacteriano
Falcon 15 mL Tubos de centrífuga cónicosFisher Scientific14-959-70CPara centrífuga de suspensión bacteriana
Agitadores orbitales incubados de sobremesaLaboratory Supply Network, Inc, Atkinson, NH Incu-Shaker MiniPara el cultivo de bacterias
Bucles de inoculaciónFisher Scientific22-363-605   Para untar inoclum bacteriano en la superficie quemada de ratones
Puntas de pipeta Fisher Scientific Redi-Tip, 1-200 y micro; LFisher Scientific02-707-502Puntas de pipeta
Thermo Scientific  Centrífuga Sorvall Legend X1Fisher Scientific75-004-220suspensión bacteriana
Bloque de latónSmall Parts, Inc., Miami, FL10 mm por 10 mm Para la creación de quemaduras en ratones
Extreme Dragon PBI/Kevlar Guantes de alta temperaturaSuperior Glove Works Ltd, Cheektowaga, NYPBI83514 Guantes resistentes al calor
Platos GreinerSigma-Aldrich Co. LLCP5112-740EA35 mm ×
Placa calefactora digital Corning deCole-Parmer Instrument Company, LLCUX-84301-6510" x 10", 220 VCA, para agua hirviendo 
Cama quirúrgica calentada por agua de línea delgada para ratones/ratasE-Z SystemsEZ-211Previene la pérdida de calor y la hipotermia durante la cirugía
Pomada veterinariaS& K Pharma, GmbHKerato Biciron 5%,ungüento oftalmológico Augensalbe para prevenir la sequedad ocular
inyectables solución salina tamponada Para separación de 10 mm

Referencias

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