Describimos aquí un método para identificar múltiples fosforilaciones de una proteína intrínsecamente desordenada mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), utilizando la proteína Tau como caso de estudio. La Tau recombinante se enriquece isotópicamente y se modifica in vitro mediante una quinasa antes de la adquisición y el análisis de datos.
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Artículo de método
Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas
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Resumen
Resumen
Los agregados de la proteína Tau neuronal se encuentran dentro de las neuronas de los pacientes con enfermedad de Alzheimer. El desarrollo de la enfermedad se acompaña de un aumento de la fosforilación anormal de Tau. En el curso de la investigación molecular de las funciones y disfunciones de Tau en la enfermedad, se utiliza la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) para identificar las múltiples fosforilaciones de Tau. Presentamos aquí protocolos detallados de producción recombinante de Tau en bacterias, con enriquecimiento isotópico para estudios de RMN. Se describen los pasos de purificación que aprovechan la estabilidad térmica y el alto punto isoeléctrico de Tau. El protocolo de fosforilación in vitro de Tau por ERK2 activado recombinante permite generar múltiples fosforilaciones. La muestra de proteína está lista para la adquisición de datos en el momento de la emisión de estos pasos. A continuación, se considera la configuración de parámetros para iniciar la grabación en el espectrómetro. Finalmente, se explica la estrategia para identificar los sitios de fosforilación de Tau modificada, basada en datos de RMN. Se discute el beneficio de esta metodología en comparación con otras técnicas utilizadas para identificar sitios de fosforilación, como la inmunodetección o la espectrometría de masas (MS).
Introducción
Uno de los principales retos de la atención sanitaria en el siglo 21 son enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA). Tau es una proteína asociada a los microtúbulos que estimula la formación de microtúbulos (MT). Tau está igualmente implicado en varias enfermedades neurodegenerativas, llamados tauopatías, de los cuales el más conocido es AD. En estos trastornos, auto-tau agregados en filamentos helicoidales emparejados (PHFs) y se encuentra modificada por muchos residuos de acuerdo con las modificaciones posteriores a la traducción (PTMs) como la fosforilación 1. La fosforilación de la proteína tau está implicada tanto ....
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Protocolo
1. Producción de 15 N, 13 C-Tau (Figura 1)
- Transformar pET15b-Tau T7 recombinante plásmido de expresión de 13,14 en BL21 (DE3) células bacterianas competentes de Escherichia coli 15.
NOTA: el ADNc que codifica para la más larga (441 residuos de aminoácidos) isoforma Tau se clona entre los sitios de restricción NcoI y XhoI en el plásmido pET15b.- Mezclar suavemente 50 l de BL21 competente (DE3), formando 1-5 x 10 7 colonias por g de ADN plásmido, con 100 ng de ADN plasmídico en un tubo de plástico 1,5 ml.
NOTA: codón de uso optimizado cepas bacte....
- Mezclar suavemente 50 l de BL21 competente (DE3), formando 1-5 x 10 7 colonias por g de ADN plásmido, con 100 ng de ADN plasmídico en un tubo de plástico 1,5 ml.
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Resultados
La figura 3A muestra un pico de absorción principal a 280 nm observados durante el gradiente de elución. Este pico corresponde a la proteína Tau purificada como se ve en el gel de acrilamida por encima del cromatograma. La Figura 3B muestra un pico de absorción bien separados a 280 nm y un pico de conductividad, asegurándose de que el desalado de la proteína es eficiente. La Figura 4 muestra la proteína gel de cambio observado por análisis de SDS-PAGE 16 característico de la fosf.......
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Discusión
Hemos utilizado la espectroscopía de RMN para caracterizar muestras de Tau enzimáticamente modificados. La expresión recombinante y la purificación se describe aquí para la proteína tau humana de longitud completa de manera similar se pueden utilizar para producir mutantes Tau o Tau dominios. Isotópicamente la proteína es necesaria enriquecido para espectroscopía de RMN, lo que exige de expresión recombinante. La identificación de sitios de fosforilación requiere la asignación de resonancia y una proteína doblemente mar.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Las instalaciones de RMN fueron financiadas por la Región Norte, el CNRS, el Instituto Pasteur de Lille, la Comunidad Europea (FEDER), el Ministerio de Investigación francés y la Universidad de Ciencias y Tecnologías de Lille. Agradecemos el apoyo de TGE RMN THC (FR-3050, Francia), FRABio (FR 3688, Francia) y las instalaciones centrales de RMN y RPE Health and Biology de Lille. Nuestra investigación está respaldada por subvenciones del LabEx (Laboratorio de Excelencia), DISTALZ (Desarrollo de Estrategias Innovadoras para un enfoque Transdisciplinario de la enfermedad de Alzheimer), EU ITN, TASPPI y ANR BinAlz.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| plásmido de expresión T7 recombinante pET15B | Novagen | 69257 | Mantener a -20 ° C |
| BL21(DE3) competente para la transformación E. coli bacterias | New England Biolabs | C2527I | Mantener a -80 ° C |
| Caldo LB esterilizado en autoclave, Lennox | DIFCO | 240210 | Medio de Crecimiento Bacteriano |
| MEM complementos vitamínicos 100x | Sigma | 58970C | Medio de Crecimiento Bacteriano Suplemento |
| 15N, 13C-ISOGRO medio completo | en polvo Sigma | 608297 | Suplemento de Medio de Crecimiento Bacteriano |
| 15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isótopo |
| 13C6-Glucosa | Sigma | 389374 | Isótopos |
| Inhibidor de la proteasa | Roche | 5056489001 | mantener a 4 & grados; C |
| 1 comprimido en 1 ml es una solución 40x que se puede mantener a -20 & grados; C | |||
| DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Mantener a -20 ° |
| Homogeneizador C (EmulsiFlex-C3) | de AVESTIN | se realiza a 4 & grados; C | |
| Pierce™ Marcador de proteína MW sin teñir | Pierce | 266109 | |
| quinasa MEK1 humana activa, GST Etiquetado Sigma | M8822 | Mantener a -80 ° C | |
| AKTÄ Sistema de cromatografía pura | GE Healthcare | FPLC HiTrap | |
| SP Sepharose FF (columna de 5 ml) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Columnas de cromatografía de intercambio catiónico |
| HiPrep 26/10 Desalinización | GE Healthcare | 17-5087-01 | Columna desalinizadora de proteínas |
| PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Columna desalinizadora de proteínas |
| Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Tampón de RMN deuterado |
| 5 mm Microtubo simétrico SHIGEMI D2O (juego de 5 tubos internos y externos) | Euriso-top | BMS-005B | RMN Shigemi Tubes |
| eVol kit-kit de inicio de jeringa electrónica | Cortecnet | 2910000 | Pipeteo |
| Bruker 900 MHz AvanceIII con cabezal criogénico de triple resonancia | Espectrómetro de RMN | Bruker | |
| Bruker 600 MHz Avance con cabezal de sonda criogénica de triple resonancia | Espectrómetro de RMN | Bruker | |
| TopSpin 3.1 | Bruker | Software de adquisición y procesamiento para experimentos de RMN | |
| Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard y D. G. Kneller) | Software de análisis de datos de RMN |
Referencias
- Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y. C., Quinlan, M., Wisniewski, H. M., Binder, L. I. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Hasegawa, M., Morishima-Kawashima, M., Takio, K., Suzuki, M., Titani, K., Ihara, Y.
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Reimpresiones y permisos
