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Artículo de método

Diferenciación in vitro de las células CD4 + humano FOXP3 + células T reguladoras (Induced iTregs) de T naive CD4 + células utilizando un protocolo de TGF-β que contienen

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DOI:

10.3791/55015

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30 de diciembre de 2016

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe la generación reproducible y el fenotipo de las células T reguladoras inducidas por el hombre (iTregs) a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro. Diferentes protocolos de inducción FOXP3 permiten el estudio de los fenotipos iTreg específicos obtenidos con los protocolos respectivos.

Resumen

Las células T reguladoras (Tregs) son una parte integral de la tolerancia periférica, suprimiendo las reacciones inmunitarias contra las autoestructuras y, por lo tanto, previniendo enfermedades autoinmunes. Se están llevando a cabo enfoques clínicos para transferir Tregs de forma adoptiva, o para agotar las Tregs en el cáncer, con primeros resultados prometedores.

Debido a que el número de Tregs naturales (nTregs) es muy limitado, puede ser ventajoso estudiar ciertas características de las Treg utilizando Tregs inducidas in vitro (iTregs). Hasta la fecha, el mejor marcador proteico para delinear Tregs es el factor de transcripción FOXP3. A pesar de la importancia de las Tregs, incluidas las funciones no redundantes de las Tregs inducidas periféricamente, los protocolos para generar iTregs son actualmente controvertidos, particularmente para las células humanas. Por lo tanto, este protocolo describe la diferenciación in vitro de iTregs CD4 + FOXP3+ humanos a partir de células T humanas vírgenes utilizando una variedad de factores inductores de Treg (TGF-β más IL-2 solamente, o su combinación con ácido retinoico, rapamicina o butirato) en paralelo. También se describe el fenotipado de estas células mediante citometría de flujo y qRT-PCR.

Estos protocolos dan como resultado la expresión reproducible de FOXP3 y otros genes característicos de Treg y permiten el estudio de los mecanismos generales de regulación de FOXP3, así como los efectos específicos del protocolo para delinear el impacto de ciertos factores. iTregs se puede utilizar para estudiar varios aspectos fenotípicos, así como los mecanismos moleculares de la inducción de Treg. Los estudios moleculares detallados se ven facilitados por el número relativamente grande de células que se pueden obtener.

Una limitación para la aplicación de iTregs es la relativa inestabilidad de la expresión de FOXP3 en estas células en comparación con nTregs. Las iTregs generadas por estos protocolos también se pueden utilizar para ensayos funcionales, como el estudio de su función supresora, en la que las iTregs inducidas por TGF-β más ácido retinoico y rapamicina muestran una actividad supresora superior. Sin embargo, la capacidad de supresión de iTregs puede diferir de la de nTregs y el uso de controles adecuados es crucial.

Introducción

Células T reguladoras CD4 + CD25 + FOXP3 + (Tregs) suprimen otras células inmunes y son mediadores críticos de la tolerancia periférica, la autoinmunidad y la prevención de la inflamación excesiva 1. La importancia de las células T reguladoras se ejemplifica por la enfermedad humana y el síndrome ligada al cromosoma X immunodysregulation poliendocrinopatía enteropatía (IPEX), en el que la pérdida de células T reguladoras debido a mutaciones en el `master' factor de transcripción caja forkhead P3 Treg (FOXP3) conduce a la enfermedad autoinmune sistémica grave, letal a una edad temprana. Sin embargo, las células T reguladoras actuar como una espada de doble filo en el sistema inmunológico, ya que también pueden obstaculizar la inmunidad antitumoral en ciertas configuraciones 2. La manipulación terapéutica del número y función de Treg es, por tanto, objeto de numerosas investigaciones clínicas. En el cáncer, agotamiento de las células T reguladoras puede ser deseable y algo de éxito de los enfoques clínicos alienta además a la investigación 3. En las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, además de los efectos terapéuticos de células T reguladoras en sevemodelos de enfermedad del ratón ral, los últimos primeros ensayos en el hombre de la transferencia adoptiva de Treg para prevenir la enfermedad injerto contra -host (EICH) 4 - 7 y para evaluar la seguridad en el tratamiento de la diabetes tipo 1 8 mostró resultados muy prometedores.

De origen natural Treg (nTregs) comprenden tTregs del timo derivados y pTregs periférica inducida, con funciones esenciales no redundantes en el mantenimiento de salud 9 - 11. Sin embargo, los números nTreg son limitados, fomentando el enfoque complementario de inducir Tregs (iTregs) in vitro a partir precursores de células T ingenuas 12. Aún así la estabilidad de iTregs, presumiblemente debido a la falta de la desmetilación en la llamada región desmetilado Treg-específico (TSDR) en el locus del gen FOXP3 13, sigue siendo una preocupación y varios estudios indican que in vivo inducida por células T reguladoras son más estables 14.

Hasta la fecha, FOXP3 sigue siendo la mejor proteína MArker para Tregs pero no es absolutamente específico porque las células CD4 + CD25- T convencionales humanos transitoriamente expresan niveles intermedios de FOXP3 tras la activación 15,16. Aunque se han hecho progresos significativos en el esclarecimiento de la regulación de la expresión de FOXP3, aún queda mucho por descubrir en cuanto a la inducción, la estabilidad y la función de FOXP3 en particular en las células humanas. A pesar de las diferencias a nTregs, in vitro inducida FOXP3 + células T CD4 + se pueden utilizar como un sistema modelo para estudiar los mecanismos moleculares de inducción FOXP3 y como punto de partida para desarrollar protocolos en el futuro que permiten la generación de iTregs que son más similares en el vivo generada células T reguladoras, que podría ser aplicable para las estrategias de transferencia adoptiva en el futuro.

No existe un protocolo `standard' oro para inducir iTregs humanos y los protocolos actuales se han desarrollado sobre la base de condiciones que imitan Treg que inducen in vivo: la interleucina 2 (IL-2) Y la señalización de factor de crecimiento transformante β (TGF-β) son cruciales para la inducción FOXP3 in vivo 17, y el ácido trans-retinoico (ATRA) - que se produce in vivo por las células dendríticas asociados al intestino - se utiliza con frecuencia para mejorar la inducción FOXP3 in vitro 18-21. Hemos desarrollado protocolos de Treg inductores humanos adicionales utilizando butirato 22, un ácido graso de cadena corta derivado de la microbiota intestinal que recientemente ha presentado un incremento murino Treg inducción 23,24. También establecimos recientemente un nuevo protocolo para la generación de iTregs con función supresora superior en vitro mediante el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina 22, siendo este último un objetivo de mamíferos clínicamente aprobado de la rapamicina (mTOR) inhibidor que es conocido por promover FOXP3 de mantenimiento durante la expansión de Treg humanos 25,26.

Este método describe la reproducible enla generación in vitro de las células CD4 + humanas FOXP3 + iTregs utilizando un conjunto de condiciones diferentes, y su posterior fenotipificación mediante citometría de flujo y la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) para revelar patrones específicos del protocolo de expresión de FOXP3 y otras firmas de moléculas Treg tales como CD25, CTLA-4, EOS, así como la represión de IFN-γ y expresión SATB1 22. Las poblaciones celulares generadas se pueden utilizar para ensayos funcionales respecto a la actividad de supresión o para estudios moleculares, ya sea en relación con los reguladores generales FOXP3 o para estudiar los efectos específicos a ciertos compuestos, tales como butirato o rapamicina. Una mayor comprensión de los mecanismos moleculares que impulsan la diferenciación de Treg es altamente relevante para futuras estrategias terapéuticas en autoinmunidad o cáncer para apuntar específicamente a las moléculas que participan en la generación y la función de Treg.

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Protocolo

Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) fueron recién aisladas de capas leucocitarias de donantes sanos anonimizados comprados en el Hospital Universitario Karolinska, Suecia. permiso ético para los experimentos se obtuvo de la Junta Regional de Revisión Ética en Estocolmo (reģionālā etikprövningsnämnden i Stockholm), Suecia (número de registro: 2013/1458/31/1).

1. T aislamiento de células de la sangre periférica

  1. Aislamiento de PBMC
    1. Pre-lay 15 ml de medio de centrifugación de densidad (como Ficoll) solución en tubos de 50 ml (5 tubos por capa leucocitaria). Pre-caliente a temperatura ambiente.
    2. Llenar la capa leucocitaria con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (temperatura ambiente) a 180 ml. Si se utiliza sangre fresca, diluir la sangre con un volumen igual de PBS.
    3. tubo de inclinación hacia un lado y medio de centrifugación de densidad lentamente superposición con ~ 35 ml de sangre diluida por tubo. Añadir la sangre con mucho cuidado, sin ningún tipo de mezcla de la centrifugación de densidad medfase ium y la capa de sangre.
    4. Centrifugar 20 minutos a 1150 xg a temperatura ambiente sin freno. Operar la centrífuga sin freno y, si es posible con una baja a la aceleración medio para evitar la mezcla de las capas.
    5. Sacar el anillo blanco que contenía las PBMC entre el medio de densidad de centrifugación y la fase de plasma. La transferencia a un nuevo tubo de 50 ml (1 vez con 5 ml pipeta y 2 veces con 2 ml de pipeta de plástico-Pasteur). Tomar tan poco como sea posible de plasma y mediana densidad de centrifugación. No toque el sedimento de eritrocitos rojo.
    6. Lavar las PBMC. Dividir las PBMC en tubos de 50 ml (4 tubos por capa leucocitaria). Llenar cada 50 ml con PBS.
    7. Centrifugar 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
    8. Retirar y desechar el sobrenadante, las células en la piscina 1 tubo con 10 ml de suero de ternera fetal RPMI / 10% (FCS) al medio y volver a suspender bien. Si son grupos de células presentes, células de la cepa a través de un filtro de células de 40 micras.
    9. Transferir las células en el matraz de cultivo celular T175 para el anuncioherent células. Enjuague tubos con 40 ml de medio y se combinan con las células (50 ml total). Si es necesario, retirar una alícuota para análisis de citometría de flujo (véase el paso 1.4). Por lo general, las células T CD4 + comprenden de aproximadamente 30 a 40% de las células en la puerta de linfocitos, y las células T vírgenes comprenden de aproximadamente 30 a 60% de las células T CD4 +, dependiendo del donante.
    10. Se incuban las células en la colocación de matraz durante 45 a 90 min a 37 ° C / 5% de CO 2. Este paso se agotan los monocitos por adherencia plástica. No es obligatorio, pero aumentará el rendimiento de las células T porcentual por cantidad de PBMC en los siguientes pasos.
    11. Resuspender las células (en los 50 ml de medio en el matraz) y enjuague capa de células en el fondo del matraz bien. Distribuir las células por igual en dos tubos de 50 ml (los tubos anteriores se pueden volver a utilizar para el mismo donante). Enjuague matraz con 50 ml de medio fresco RPMI / 10% FCS, y la transfiere en partes iguales en los mismos 2 tubos.
      NOTA: Las CMSP se pueden almacenar durante la noche a 4 ° C con tubos que pone enel lado, o, idealmente, utilizar directamente para el aislamiento de células T.
  2. nTreg El aislamiento por clasificación de células activadas-Magnética
    1. Preparar tampón de aislamiento: 0,5% (w / v) de albúmina de suero humano y EDTA 2 mM en PBS. Siempre mantenga tampón a 4 ° C. Alternativamente a la albúmina humana, el uso de albúmina bovina.
    2. Volver a suspender las PBMC y contar con un contador de células automático o manual en presencia de azul de tripano (no cuentan pequeñas plaquetas). Si se observan grupos de células, células de la cepa a través de un filtro de células de 40 micras.
    3. PBMCs centrifugar a 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Resuspender las células (con pipeta 1 ml) en 90 l de tampón de aislamiento por 10 7 PBMCs para obtener una suspensión de células individuales. Mantener las células en los originales tubos de 50 ml (2 tubos por capa leucocitaria).
    5. Añadir 2 l perlas CD25 por 10 7 células, mezclar e incubar durante 15 minutos a 4 ° C.
    6. Rellenar con PBS a 30 ml. Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 46; C.
    7. Preparar columnas LS (2 por capa leucocitaria): se equilibran con 3 ml de tampón de aislamiento, y descartan fluya a través. Los tubos pueden ser reutilizados para enjuagar más columnas.
    8. Resuspender las células en 3 ml de tampón de aislamiento por tubo (con 1 ml de la pipeta). La transferencia de células a LS columna, y recogen el flujo a través de nuevos tubos de 15 ml.
    9. Enjuagar los tubos de 50 ml con 2 ml de tampón de aislamiento de cada uno. Transferencia de disolución tampón de enjuague a las columnas.
    10. Lavar 2x columna con 3 ml de tampón de aislamiento de cada uno. Siempre espere hasta que la columna se detuvo goteo, antes de añadir cualquier nuevo líquido. fluya a través de la tienda a 4 ° C para las etapas posteriores.
    11. Retirar la columna del imán. Eluir 2x con 3 ml de tampón de aislamiento por columna en 15 ml de tubo.
      NOTA: El eluato de 2 columnas por donante se puede combinar. No moje la columna en el líquido.
    12. Preparar y equilibrar las nuevas columnas LS (1 columna por la capa leucocitaria). Transferir el eluato de 1.2.11 a la columna. El flujo a través se puede descartar. Después de eluato tiene passed través de la columna, enjuague tubo y lavar 3x columna con 3 ml de tampón de aislamiento.
      NOTA: La segunda columna es crucialmente necesario para aumentar la pureza.
    13. Retirar la columna del imán. Eluir CD25 ++ 2x "nTregs" con 3 ml de tampón de aislamiento.
    14. Centrifugar a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
    15. Lavar las células con 15 ml de medio de cultivo de células T, se centrifuga a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante por completo.
    16. Resuspender las células en 0,5 ml de medio de cultivo de células T, suplementado con 100 UI / ml de IL-2, cada uno. La transferencia de células a placas de 24 pocillos. tubo de enjuague con 0,5 ml de medio (+ 100 UI / ml de IL-2) y se combinan en una placa de 24 pocillos.
    17. Contar nTregs (como en el paso 1.2.2). El rendimiento es generalmente cerca de 1-4 x 10 6 células T reguladoras por capa leucocitaria. Ajuste la densidad de células T reguladoras a 1-2 x 10 6 células / ml con medio de cultivo celular T + 100 UI / ml de IL-2.
    18. Se incuban las células T reguladoras a 37 ° C / 5% de CO2 hasta su uso.
  3. T indiferenciadas CD4 + de aislamiento de células mediante clasificación de células activadas-Magnética
    NOTA: Tome el flujo a través del paso 1.2.8-1.2.10 para proceder con el aislamiento de células. Alternativamente, si no se aislaron nTregs, proceder directamente a partir de PBMCs.
    1. Combinar 2 tubos por los donantes de PBMC-agotado Treg en 50 ml tubo. Rellenar con PBS a 50 ml a temperatura ambiente.
    2. PBMCs centrifugar a 200 g durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Retirar y desechar el sobrenadante. Resuspender las células en 50 ml de PBS.
    3. Repita el paso 1.3.2 dos veces.
      NOTA: Los lavados con PBS son cruciales para la eliminación de las plaquetas, que no puedan ser eliminadas con el siguiente kit de aislamiento negativo. Las plaquetas permanecen en el sobrenadante a esta centrifugación a baja velocidad. agotamiento de plaquetas se puede controlar en los pasos individuales en un portaobjetos de microscopio. Los pasos tienen que ser realizadas con PBS y centrifugados a temperatura ambiente.
    4. Volver a suspender las PBMC en 50 ml de PBS. Recuento de células como en el paso 1.2.2.
    5. PBMCs centrifugar a 450 g durante 10 min a 4 ° C. Desechar células sobrenadante y resuspender en tampón de aislamiento 40 l (4 ° C) por 10 7 células.
    6. Añadir 10 l de T naive CD4 + de la célula de coctel Biotina-Anticuerpo II por 10 7 células.
    7. Mezclar e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
    8. Lavar las células mediante la adición de 40 ml de PBS (4 ° C), y se centrifuga a 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en 80 l de tampón de aislamiento por 10 7 células.
    9. Añadir 20 l de microperlas anti-biotina por 10 7 células. Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a 4 ° C.
    10. Llenar hasta 50 ml con PBS frío y centrifugar 450 xg durante 10 min a 4 ° C.
    11. Preparar columnas LS (se equilibran con 3 ml de tampón de aislamiento). Para evitar la sobrecarga de la columna, utilizar una columna de como máximo 250 x 10 6 PBMCs, o menos si PBMCs contienen muchas células rojas de la sangre.
    12. Aspirar el sobrenadante y resuspender cells en tampón 3 ml de aislamiento. La transferencia de células a la columna LS. Recoger el flujo a través, que contiene las células T CD4 + vírgenes, en tubos de 15 ml.
    13. Enjuague el tubo con tampón de aislamiento 2 ml. Transferir a la columna.
    14. 3x Lavar la columna con 3 ml de tampón de aislamiento. Siempre espere hasta que la columna se detiene el goteo, antes de añadir cualquier nuevo líquido.
    15. Tome el flujo a través (células T CD4 + no tratados previamente) y centrifugar 450 xg durante 10 min a 4 ° C. Las columnas pueden ser descartados.
    16. Aspirar el sobrenadante por completo. Lavar las células con 15 ml de medio, de centrifugación 450 xg durante 10 min a temperatura ambiente y eliminar el sobrenadante por completo.
      NOTA: tampón de aislamiento contiene EDTA, que quela iones de calcio y por lo tanto afecta la activación de células T. Antes de que los ensayos de estimulación, quitar el tampón de aislamiento completamente y lavar las células dos veces con 15 ml de medio.
    17. Resuspender las células en medio de cultivo de células T a 2-3 x 10 6 células por ml. células de descanso en su caso frasco or bien durante la noche en la incubadora. Si se utilizan células directamente para los ensayos de estimulación, ellos lavar una vez más con medio.
  4. Control de pureza de tinción
    1. Tome ~ 50.000 células (Tnaïve; nTreg; PBMCs) cada una, en 20 l.
      NOTA: Si tanto Tnaïve y el panel nTreg deben ser manchado, tomar 2 muestras cada una.
    2. Preparar 2x premezcla concentrada de anticuerpo (en PBS) de acuerdo con el instrumento, por ejemplo: El panel Tnaïve: CD4-PerCP 1: 5; CD45RA-FITC 01:10, CD45RO-PE 1: 5, CD8-eFlour450 1: 8. Para el panel de Treg, reemplace CD45RO-PE con CD25-PE, 1:10.
      NOTA: Sólo ciertos anticuerpos CD25, que reconocen diferentes epítopos que los CD25-microperlas, se puede utilizar para teñir nTregs aisladas con microperlas CD25.
    3. Añadir 20 l de premezcla de anticuerpos a 20 células mu l. También hay que preparar coloraciones individuales para cada fluorocromo (utilizando una muestra que contiene células positivas, por ejemplo, PBMC) y una muestra sin teñir, por citometría de flujo settings y compensación.
    4. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    5. Llenar cada muestra con 200 l de PBS y centrifugar 450 g durante 5-10 minutos.
    6. Recoger células en células activadas por fluorescencia (FACS) tampón (= tampón de aislamiento sin EDTA) y analizar por citometría de flujo. La pureza de las células T CD4 + vírgenes suele ser> 95% (véase la Figura 2).

2. La inducción de Treg Cultura

  1. Preparación de estímulo de los medios y las placas
    1. Preparar y medio de cultivo celular T pre-calentamiento: medio hematopoyético-libre de suero suplementado con 2 mM L-alanil-L-glutamina.
    2. Preparar citoquinas, anticuerpos estimulación y concentraciones madre de compuesto.
      1. Preparar IL-2 solución madre: 400.000 UI / ml en ácido acético-filtrada estéril (con filtro resistente al ácido) 100 mM (167 mg / ml si la actividad del lote utilizado es 2.400 UI por 1 g; confirmar con el proveedor de). Alícuota de unión esterilizada tubos de 0,5 ml baja en proteínas, sellar con Parafilm, se congela en hielo seco y almacenar a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo o -20 ° C durante un máximo de 3 meses.
      2. Prepare el TGF-β1 solución madre (10 mg vial, sin soporte): Polvo Centrífuga TGF-β1 (1.000 xg 3 min), añadir 100 l de HCl 4 mM (esterilizada por filtración con filtro resistente al ácido) para preparar la solución madre con 100 g / ml, permitir que se disuelva completamente; vórtice. Alícuota de 5 l cada uno para esterilizar unión a tubos de 0,5 ml baja en proteínas, sellan con Parafilm, se congelan en hielo seco y almacenar a -80 ° C durante un máximo de 6 meses.
      3. Preparar ATRA solución madre: Disuelva el polvo a 20 mg / ml (66,6 mM) en DMSO. Preparar una solución madre de 10 mM por dilución adicional en alícuotas de DMSO y almacenar, protegido de la luz, a -80 ° C hasta por 1 año. ATRA es sensible a la luz, el calor y el aire.
      4. Preparar la solución de rapamicina existencia: 1 mg / ml (1,11 mM) en DMSO, almacenar en alícuotas a -80 ° C durantehasta 1 año.
      5. Preparar una solución de sodio butirato de almacén: M (ml 0,1 mg /) stock 0,908 en H estéril ultrapura 2 O y filtro estéril. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
    3. Preparar 4x premezclas concentradas (50 l por pocillo) en medio de cultivo de células T como en la Tabla 1.
    4. El día anterior, placas de capa con anticuerpo anti-CD3. Escudo deseado número de pozos de la placa de U 96 pocillos con 5 mg / ml de anticuerpo anti-CD3 en PBS, 65 l / pocillo. Envolver la placa con papel de aluminio y se incuba durante la noche a 4 ° C.
      NOTA: No utilice los pozos de margen de placas de 96 pocillos. pozos más grandes pueden ser utilizados, pero los pocillos en forma de U facilitar el uso de los mismos números de células por área a través de experimentos. Si se necesitan más células, aunar la cantidad necesaria de pozos después del cultivo. Por lo general, después de 4-6 días de expansión, 2 pozos cada una de las muestras son suficientes para el análisis de citometría de flujo y análisis de ARN.
      1. En el día de la siembra, poco antes de chapado, quitar Antisolución CD3 de los pozos. Llenar los pocillos con 200 l / pocillo de PBS. Retirar PBS. Repetir el lavado con 200 l / pocillo de PBS. Retirar PBS por completo y utilizar placas inmediatamente.
    5. Preparar placas (no usar pozos de margen):
      1. Para cada pocillo, se añaden 50 l de 4x anti-CD28 / IL-2 de premezcla (a excepción de células "no estimuladas", añadir T medio de cultivo celular), 50 l de 4x TGF-β1 premezcla (para todos los iTregs) o cultivo de células T 50 l medio para la "única estimulación" falso control, 50 l 4x ATRA, ATRA / rapamicina o premezcla butirato (en su caso) o medio
      2. Llenar todos los pocillos vacíos, incluyendo los pozos de margen, con 200 l de PBS. Placas pre-calentamiento a 37 ° C / 5% de CO 2.
  2. Preparar las células T vírgenes para la siembra
    1. Después de las células en reposo, traslado al tubo de 15 ml, enjuague frasco / pozos con pre-calentado medio de cultivo de las células T y la piscina al tubo. Llenar el tubo de 15 ml con medio de cultivo celular T.
    2. centrifugar las células a 450 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    3. Retire medio y tomar las células en medio fresco, pre-calentado T de cultivo celular a una densidad de 2,2-2,6 x 10 6 / ml. Recuento de células como en el paso 1.2.2 y ajustar la densidad, si es necesario.
    4. Añadir células a las placas de estimulación preparados (véase 2.1), 50 células l / pocillo (110,000-130,000 células / pocillo). Cada pocillo debe contener ahora un volumen total de 200 l.
    5. Envolver las placas en papel de aluminio para proteger ATRA de la luz; incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante períodos de tiempo deseados.
  3. Supervisar Treg inducción Cultura
    1. Supervisar las culturas Treg por microscopía de luz (40X). Desde aproximadamente el día 2 a 3, pequeños grupos de células en proliferación deben ser visibles, que se funden en grupos más grandes en puntos de tiempo posteriores. Cultivos desarrollados con rapamicina generalmente crecen menos. Véase también la figura 3.
    2. En los puntos de tiempo deseados, tomar muestras de ARN de correoXtraction o citometría de flujo fenotipificación (ver abajo). Para posteriores del tiempo con la proliferación celular, 1 así cada uno es suficiente, de lo contrario tomar de 1 x 10 5 -1 x 10 6 células cada una de ARN y 3 x 10 5 -1 x 10 6 células por citometría de flujo.
  4. La evaluación de FOXP3 Estabilidad
    1. Para evaluar la estabilidad del fenotipo iTreg como se describió previamente 22,27, lavar iTregs dos veces con medio de cultivo de células T, y iTregs de cultivo adicionales en medio de cultivo de células T, ya sea sin o con anti-CD3 y anti-CD28 re-estimulación como se describe en 2.1 y 2.2 . Añadir citoquinas, tales como 50 UI / ml de IL-2, para estudiar su influencia sobre la estabilidad de FOXP3.
    2. En los puntos de tiempo deseados, tomar muestras para la extracción de RNA, citometría de flujo fenotipificación (ver más abajo), y el análisis de metilación como se describe TSDR 22,28.

3. Análisis fenotípico de iTregs de QRT-PCR

  1. Preparación deLas muestras
    1. En los puntos de tiempo deseados, tomar de 1 x 10 5 a 1 x 10 6 células por muestra para la extracción de RNA. La transferencia de células a un tubo de 1,5 ml RNasa libre, y se centrifuga a 500 g durante 5 min.
    2. Si es necesario, extraer parte del sobrenadante y congelar para el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o análisis similar. Extraer el sobrenadante restante completamente a partir de células. Proceder directamente a la extracción de RNA o congelar sedimento de células en hielo seco y almacenar a -20 ° C a -80 ° C durante un máximo de 2 semanas.
    3. Extracto de ARN y realizar QRT-PCR para FOXP3 y un gen de mantenimiento (tales como RPL13A) de acuerdo con protocolos estándar. Además, medir la expresión de otros genes de la firma Treg (por ejemplo `Treg up' genes IL2RA, CTLA4, IKZF4, y` Treg abajo' genes IFNg, SATB1).

4. El análisis fenotípico por citometría de flujo

NOTA: Este protocolo está optimizado para la tincióning en formato de placa de 96U con 3 x 10 5 -1 x 10 6 células. Si hay menos células por pocillo, comenzar con varios pozos y piscina como se describe a continuación.

  1. Reestimulación de células (Opcional)
    1. Si se desea la tinción de citocinas intracelulares, las células de pulso con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) / ionomicina en presencia de un inhibidor de transporte de proteínas.
      NOTA: Este procedimiento no influye en la expresión de FOXP3 en cultivos iTreg descritos anteriormente, pero otros marcadores puede cambiar - por ejemplo, CD4 es downregulated.
    2. Preparar 10x Brefeldina A / PMA / ionomicina premezcla (20 l por pocillo) en medio de cultivo de células T: Brefeldina una solución madre 1: 100, ionomicina (Stock 5 g / l) 1: 1300, PMA (Stock 12,35 g / l, pre -dilute 1: 1235) 1: 100 agotadas previamente diluido.
    3. 4 horas antes de la tinción, añadir 20 l Brefeldina A / PMA / ionomicina 10x mezcla por pocillo para obtener concentraciones finales de 1: 1000 Brefeldina A, 0,5 μM (375 ng / ml) Ionomicina, 10 ng / ml de PMA.
    4. Incubar durante 4 horas a 37 ° C / 5% de CO 2
  2. tinción de la superficie
    NOTA: El panel sugiere aquí es una sugerencia; otros paneles pueden ser utilizados en función de los antígenos de interés y la configuración del instrumento.
    1. PBS enfriar en hielo. Preparar tampón FACS (PBS con albúmina de suero humano al 0,5%, HSA) y enfriar en hielo. BSA o FBS se pueden utilizar como una alternativa a la HSA.
    2. células re-placa en placa de tinción: suspender las células con una pipeta y transferir las células a una nueva placa de 96U, dejando así libre alrededor de uno cada pocillo (para evitar efectos colaterales en el procedimiento de tinción más adelante). Si están presentes en el pozo original menos el número de células deseadas, eliminar parte del sobrenadante antes de la resuspensión, y la piscina varios pozos en una tinción también.
    3. Centrifugar la placa 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Eliminar el sobrenadante. Derrama sobrenadante en caja de desechos, deje el plato bocaabajo e inmediatamente (sin vuelta atrás de la placa) toque la placa una vez sobre papel absorbente. A continuación, gire inmediatamente de nuevo la placa. placa de vórtice para volver a suspender las células en el líquido residual.
    5. Añadir 25 l de premezcla tinción de la superficie (CD25-PE 1:20, CD4-PerCP 1: 5 en tampón FACS) y resuspender.
      NOTA: También se incluyen coloraciones individuales para cada uno de los fluorocromos utilizados con muestras que contienen células positivas para el antígeno respectivo; e incluir una muestra sin teñir. Estos serán necesarios para la configuración de compensación de instrumentos. Como alternativa, utilizar bolas de compensación.
    6. Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
    7. Añadir 200 l de PBS, la placa centrífuga 400 xg durante 10 min a 4 ° C y retirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    8. Repita el paso 4.2.7 dos veces.
  3. La tinción de viabilidad
    NOTA: tinción de viabilidad es indispensable, ya que después de la fijación / permeabilización de las células muertas no pueden ser excluidos por suficientementeFSC / SSC y puede dar lugar a señales inespecíficas. Un colorante viabilidad fijable tiene que ser utilizado.
    1. Resuspender las células en 130 l viabilidad mancha de premezcla (viabilidad corregible tinte eFlour780 1: 1.400 en PBS) y las células inmediatamente resuspender con la pipeta multicanal.
      NOTA: También incluye un solo tinción para el tinte de viabilidad que contiene células muertas, por ejemplo, células T no estimuladas cultivadas durante varios días o matar las células mediante la aplicación de calor como por las instrucciones del fabricante. Estos serán necesarios para la compensación.
    2. Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
    3. placa Centrifugar a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante como en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    4. Rellenar con 200 l de tampón FACS. Repita el paso 4.3.3.
    5. Rellenar con 200 l de PBS. Repita el paso 4.3.3.
  4. La tinción intracelular con FOXP3 tinción de autonomía ajustado
    1. Para cada pocillo, se preparan: tampón / Perm 150 l Fix (diluir Fix / Perm concentrate 1: 4 con diluyente); 850 permeabilización de amortiguación l 1x (diluida 10x tampón de permeabilización 1:10 con ultra pura H 2 O).
    2. Después de agitación con vórtex, volver a suspender las células en tampón / Perm 150 l Fix e inmediatamente volver a suspender con pipeta. Es importante para volver a suspender inmediatamente para evitar la fijación de grupos de células.
      Precaución: La fijación tampón contiene paraformaldehído y debe manejarse y desecharse de forma apropiada.
    3. Incubar 30 min a 4 ° C en la oscuridad.
    4. Añadir 100 l de PBS frío. Centrifugar a 850 xg durante 10 min a 4 ° C.
      NOTA: A partir de este paso en adelante, la velocidad de centrifugación se incrementa para evitar la pérdida de las células. Tras la fijación, las células se vuelven invisibles y se debe tener cuidado para eliminar los sobrenadantes como se describe en el paso 4.2.4 e inmediatamente después de la centrifugación ha terminado para minimizar la pérdida de las células.
    5. Aspirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
      NOTA: La tinción puede ser pausado en este paso; eneste caso, se lavan las células dos veces con 200 l de PBS; a continuación, tomar hasta en 250 l de PBS y se almacena a 4 ° C, protegido de la luz. Las células se pueden almacenar durante algunos días, y luego proceder con la permeabilización. Sin embargo, los resultados óptimos se logran cuando continuó directamente a la permeabilización.
    6. Después de agitación con vórtex, se añaden 200 l de tampón de permeabilización. Centrifugar a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    7. Añadir 200 permeabilización de amortiguación l para volver a suspender.
      NOTA: A continuación, las muestras se pueden dividir en tinción intracelular y la muestra de control de isotipo (quitarle la mitad de cada muestra). Si el número de células son limitantes, una muestra agrupada isotipo se puede preparar (quitarle 10-20 l de cada muestra y piscina). También, se pueden tomar muestras de fluorescencia-menos-uno los controles (FMO).
    8. Centrifugar a 850 xg durante 10 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante como se describe en el paso 4.2.4. placa de vórtice.
    9. Resuspender pellet en44 l de tampón de permeabilización más 1 l de suero de ratón normal (premezclado) para bloquear la unión no específica.
      NOTA: Esto se aplica si los anticuerpos usados ​​en el siguiente paso son de isotipo murino. Si se utilizan otros anticuerpos, tales como derivados de rata,, incluya el suero apropiado para bloquear (por ejemplo, suero de rata).
    10. Se incuba a 4 ° C durante 15 min en la oscuridad.
    11. Añadir anticuerpos:
      NOTA: Investigar las concentraciones de anticuerpos específicos para los Lotes. Si no se hace en el paso 4.2 con anticuerpos contra antígenos de la superficie (por ejemplo, CD4) con los respectivos fluorocromos, también incluir coloraciones individuales para cada uno de los fluorocromos utilizados con muestras que contienen células positivas para la compensación.
      1. Añadir 15 l de premezcla de anticuerpos a las muestras (excepto para las tinciones individuales, sin teñir muestras, muestras de control de isotipo y controles FMO): Piensos compuestos por muestra: 0,7 l (0,35 mg) anti-interferón gamma (IFN-γ) FITC (si es aplicable después de la re-estimulación ),2.3 l (0,115 g) CTLA-4 Brilliant Violet 421, 2 l (0,05 mg) Anti-FOXP3-APC, 10 l de PBS.
      2. Para isotipo muestras de control, añadir 15 l de premezcla de anticuerpos de isotipo, usando las mismas cantidades de anticuerpos como para los anticuerpos utilizados en 4.4.11.1: Piensos compuestos por muestra: 0,7 l (0,35 mg) FITC control de isotipo IgG1 de ratón K (si procede), 0,58 l (0,115 g) IgG2a-BV421 ratón isotipo, 0,5 l (0,05 mg) de control de isotipo IgG1 de ratón K APC, 13,2 l de PBS.
      3. Para los controles FMO, añadir anticuerpos como en 4.4.11.1, en sustitución de un anticuerpo cada uno con PBS.
    12. Se incuba a 4 ° C durante 30 min en la oscuridad.
    13. Añadir 200 l de tampón de permeabilización. Centrífuga, eliminar el sobrenadante y agitar como en el paso 4.4.8. Repita una vez.
    14. Resuspender las células en tampón FACS frío (volumen de acuerdo con el instrumento utilizado) y adquirir, a ser posible inmediatamente, en el citómetro de flujo.

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Resultados

La Figura 1 muestra un esquema de la configuración experimental. La Figura 2 muestra una tinción de control de pureza representativo de las células T CD4 + vírgenes magnéticamente aisladas y nTregs.

FIGURA 3A muestra la citometría de flujo gating estrategia y la Figura 3B muestra representativa FOXP3 y CD25 citometría de flujo coloraciones en el día...

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Discusión

El protocolo descrito permite la inducción robusto de CD4 humano + FOXP3 + iTregs de células T CD4 + vírgenes humanos. Incluye un nuevo protocolo que describimos hace poco, el uso de una combinación de TGF-β, ATRA y rapamicina, para la inducción de iTregs con superiores función supresora in vitro 22. En comparación con otros protocolos publicados, otra ventaja es la inducción de diferentes poblaciones iTreg en paralelo por diferentes protocolos, lo que permite la comparación directa de los...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nina Nagel es agradecida por su asistencia técnica durante el rodaje del vídeo y la preparación experimental. Agradecemos a Eva-Maria Weiss por su ayuda con el protocolo de tinción intracelular FOXP3 y a Elisabeth Suri-Payer y Nina Oberle por establecer el protocolo de aislamiento nTreg. Matilda Eriksson y Peri Noori son reconocidas por la gestión del laboratorio.

Financiación: A.S. fue apoyado por una beca intraeuropea Marie Curie dentro del 7º Programa Marco de la Comunidad Europea, la Fundación Dr. Åke Olsson y las fundaciones de investigación KI; A.S. y J.T. fueron apoyados por una beca CERIC (Centro de Excelencia para la Investigación en Inflamación y Enfermedades Cardiovasculares), J.T. fue apoyado por Vetenskapsrådet Medicina y Salud (Dnr 2011-3264), Fundación Torsten Söderberg, FP7 STATegra, AFA Insurance y Consejo del Condado de Estocolmo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Ácido retinoico totalmente transSigma AldrichR2625-50MG   
anit-humano clon de Foxp3-APC 236A/E7eBioscience17-4777-42
microperlas CD25 antihumanasMiltenyi Biotec130-092-983
antihumano CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
anticuerpo CD28 antihumano, LEAF Purificado Biolegend302914
anticuerpo CD3 antihumano, purificado por LEAF Biolegend317315
antihumano CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
antihumano CD45RO clon de PE UCHL1BD Biosciences555493
clon antihumano CD4-PerCP SK3; mIgG1BD Biosciences345770
antihumano CD8-eFluor 450 (clon OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
CTLA-4 (CD152), clon BNI3, mIgG2ak, violeta brillante 421BD Biosciences562743
clon 4S de IFN-g FITC antihumano. B3; mIgG1keBioscience11-7319-81 
Solución que contiene Brefeldina A: GolgiPlugBD Biosciences555029
kit de síntesis de ADNc: SuperScript VILO (transcriptasa inversa) Kit de síntesis de ADNcInvitrogen11754-250
Medio de centrifugación de densidad: Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99.7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS, Invitrogen10082-147
Tinte de viabilidad fijable inactivado por calor, eFluor 780   eBioscience65-0865-14 o 65-0865-18 
Foxp3 Juego de tampones de tincióneBioscience00-5523-00Atención: contiene paraformaldehído. También se puede comprar en kit combinado con anticuerpo; 77-5774-40 Set de tinción anti-humano Foxp3 Clon APC: 236A/E7 Set
GlutaMAX (200 mM L-alanil-L-glutamina)Invitrogen35050-061
humano ingenuo kit de aislamiento de células T CD4Miltenyi Biotec130-094-131
Albúmina sérica humana 50 g/LBaxter1501057
Ionomicina de Streptomyces conglobatus >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LS-columnsMiltenyi Biotec130-042-401
ratón IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
ratón IgG1 K Isotype Control FITC 50 μ geBioscience11-4714-81 
ratón IgG2a control de isotipo, violeta brillante 421, clon MOPC-173BD Biosciences563464
Pasteur pipeta de plástico, empaquetado individualmenteSarstedt86.1172.001   
PMA Forbol 12-miristato 13-acetatoSigma AldrichP1585-1MG 
RapamicinaEMD (Merck)553210-100UG
IL-2 humano recombinante, CFR& D202-IL-050/CF
TGF-beta 1 humano recombinante, CFRnD240-B-010/CF
Kit de aislamiento de ARN: RNAqueous-Micro Kit AmbionAM1931   
RPMI 1640 Medio Invitrogen72400-054 
Butirato de sodioSigma AldrichB5887-250MG 
Medio de cultivo de células T: medio X-Vivo 15, con gentamicina + fenolLonza04-418Q
Ensayo de expresión génica TaqMan, FOXP3 (mejor cobertura) Applied Biosystems4331182; ID del ensayo: Hs01085834_m1Precaución: contiene paraformaldehído
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Mejor Cobertura)Applied Biosystems4351370; ID del ensayo: Hs04194366_g1   Atención: contiene paraformaldehído
Mezcla maestra de expresión génica TaqMan4369514Biosystems aplicados
II

Referencias

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