Prolina-prolina endopeptidasa-1 (PPEP-1) es una metaloproteasa secretada y una prometedora diana farmacológica del patógeno humano Clostridium difficile. Aquí describimos todos los métodos necesarios para la producción y determinación de la estructura de esta proteína.
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Artículo de método
Producción, Cristalización y determinación de la estructura de
En este artículo
Resumen
Resumen
Se necesitan nuevas terapias para tratar las infecciones por Clostridium difficile que son una amenaza importante para la salud humana. La metaloproteasa PPEP-1 de C. difficile es una diana para el desarrollo futuro de inhibidores que disminuyan la virulencia del patógeno. Para llevar a cabo la caracterización biofísica y estructural, así como el cribado de inhibidores, se necesitarán grandes cantidades de proteína pura y activa. Hemos desarrollado un protocolo para la producción y purificación eficiente de PPEP-1 mediante el uso de E. coli como huésped de expresión, produciendo cantidades suficientes y pureza de proteína para la cristalización y determinación de la estructura. Además, mediante el uso de microsiembra, los cristales de PPEP-1 altamente intercrecidos se pueden cultivar hasta obtener cristales bien ordenados adecuados para el análisis de difracción de rayos X. Los métodos también podrían utilizarse para producir otras proteínas recombinantes y para estudiar las estructuras de otras proteínas que producen cristales interclorados.
Introducción
Clostridium difficile es una de las principales causas de las infecciones diarrea asociada a antibióticos nosocomiales 1. Esta bacteria anaerobia Gram-positiva se transmite a través de su forma de esporas a través de la vía fecal-oral. En la última década, la nueva '' epidemia '' o '' hypervirulent '' (por ejemplo, las cepas de BI / NAP1 / 027) produjo un aumento drástico de las nuevas infecciones y las tasas de mortalidad en América del Norte y Europa 2. C. difficile enfermedad -asociado (CDAD) es una amenaza para la vida inflamación del colon con altas tasas de mortalidad 3.....
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Protocolo
1. Clonación y Construir Diseño
- Clon de la secuencia de codones optimizados (para E. coli) de C. difficile PPEP-1 sin el péptido señal [los aminoácidos 27-220, llamado de aquí en adelante recombinante PPEP-1 (rPPEP-1) 11] en el vector pET28a usando Nde I y Xho I sitios de restricción (Figura 1) con un codón de parada en el (vector resultante pET28a-NHis-rPPEP-1) extremo 3 '. Esto produce una N-terminal 6xHis de etiquetado de proteínas (NHis-rPPEP-1) con un sitio de escisión de trombina que permite la eliminación de la etiqueta durante la purificación (Figura 1). El plásmid....
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Resultados
rPPEP-1 se sobreexpresa en varias cepas de E. coli, con el rendimiento más alto en E. coli BL21 (DE3) Star (Figura 1C). Después de la primera etapa de cromatografía de afinidad NiNTA la etiqueta 6xHis se puede escindir con éxito de la mayoría de la proteína y en el segundo paso NiNTA proteína no digerida se puede separar completamente de la proteína trombina digerido (Figura 1D). En una columna S200 16/600 rPPEP-1 sin etiqueta migra com.......
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Discusión
La cristalografía de rayos X sigue siendo el método más rápido y más preciso para determinar las estructuras tridimensionales de resolución casi atómica de proteínas 28. Sin embargo, requiere el crecimiento de cristales únicos bien ordenadas. Estos a menudo son difíciles de conseguir y el estado cristalino es artificial. Sin embargo, una comparación de las estructuras de proteínas determinadas por cristalografía de rayos X con los determinados por otros métodos, especialmente NMR, muestra generalmente una muy.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos al personal de la X06DA línea de luz en la fuente de luz suiza, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suiza por su apoyo durante la recolección de datos de sincrotrón. Estamos muy agradecidos a Monika Gompert por su excelente apoyo técnico. El proyecto fue apoyado por la Universidad de Colonia y conceder INST 216 / 682-1 Fugg del Consejo de Investigación Alemán. Una beca de doctorado de la Escuela Internacional de Posgrado en Salud y Enfermedad Desarrollo de CP se reconoce. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de la Comunidad Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención nº 283570 (B....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Genes / Vectores / cepas celulares | |||
| pET28a | Merck-Millipore | 69864 | Trombina escindible N-terminal His-tag |
| E. coli cepa BL21 (DE3) Star | ThermoFisher Scientific | C601003 | codón deficiente en RNasa |
| H (para E. coli) de PPEP-1 (CD630_28300) | Geneart (Thermo Fisher Scientific) | personalizados | 27-220 |
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| >QuímicosExtracto de | |||
| levadura | cualquiera | ||
| Triptona | cualquiera | ||
| Antiespumante B | Sigma-Aldrich | A5757 | emulsión acuosa de silicona |
| Agar | cualquier | ||
| Kanamicina | cualquier | ||
| IPTG | AppliChem | A1008 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1087 | Grado tampón |
| NaCl | cualquier | Grado tampón | |
| DNaseI | AppliChem | A3778 | |
| Imidazol | AppliChem | A1073 | Grado tampón |
| Trombina | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Fosfato de amonio dibásico | Sigma-Aldrich | 215996 | |
| Glicerol 100% | cualquier | grado puro | |
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Líquido nitrógeno | cualquiera | para el almacenamiento y el enfriamiento criogénico de cristales | |
| Nombre | Empresa | >Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo (general) | |||
| Agitar | incubadora cualquiera | que proporcione temperaturas de 20 ° C - 37 ° C | |
| Cristalería | : cualquier | matraz Erlenmeyer con deflector (50 ml - 2,8 L) | |
| Centrífuga para grandes volúmenes de cultivo | cualquier | centrífuga para volúmenes de procesamiento de hasta 12 L | |
| Sonicator Vibra-Cell VCX500 | Sonics | SO-VCX500 | o cualquier otro sonicador / disruptor de células |
| Ultracentrífuga | cualquier | centrífuga que proporciona velocidades de hasta 150.000 x g | |
| Resina NiNTA Superflow | Qiagen | ||
| Empty Glass Econo-Column | Bio-Rad | 7371007 o cualquier otra columna de vidrio o plástico vacía | |
| Exclusión de tamaño columna de cromatografía HiLoad Superdex 200 16/600 | GE Healthcare | 28989335 | |
| Sistema de cromatografía Ä KTA Purificador | GE Healthcare | 28406264 | o cualquier otro sistema de cromatografía |
| Tubos de diálisis Spectra/Por 3 | Spectrum Labs | 132724 | |
| Cierres de tubos de diálisis | Spectrum Labs | 132738 | |
| Unidades de ultrafiltración (concentradores) 10.000 NWCO | cualquier | ||
| espectrofotómetro UV-Vis | cualquier | ||
| < strong>Nombre | Compañía | Número de catálogo | Comentarios |
| Equipo (cristalografía) | |||
| bajo volumen 0.1-10 µ l | cualquier | ||
| pipeta de desplazamiento positivo Microman M10 | Gilson | F148501 | |
| Robot de cristalización | cualquier | ||
| placa de cristalización de 96 pocillos TTP IQ con tres pocillos de proteínas | TTP | 4150-05810 | o cualquier otra placa de cristalización de 96 pocillos |
| Placa CombiClover Junior de 24 pocillos | Jena Bioscience | EB-CJR | |
| Cinta de sellado transparente | Hampton Research | HR3-511 | |
| Diapositivas de cubierta de vidrio siliconado | Hampton Research | HR3-225 | |
| Pantallas de cristalización comerciales: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal | Hampton Research | diversas | |
| pantallas de cristalización comerciales: Wizard, PACT++, JCSG++ | Jena Bioscience | diverso | |
| JBS Beads-for-Seeds | Jena Bioscience | CO-501 | |
| CrystalCap SPINE HT (bucles de nylon) | Hampton Research | diversos | tamaños de bucle 0,025 mm - 0,5 mm |
| CrystalCap Vial | Hampton Research | HR4-904 | |
| Espuma criogénica Dewar 800 ml | Hampton Research | HR4-673 | |
| Espuma criogénica Dewar 2 L | Hampton Research | HR4-675 | |
| Abrazadera de vial, recta | Hampton Research | HR4-670 | |
| CrystalWand magnético, recto | Hampton Research | HR4-729 | |
| CryoCane 6 Soporte para vial | Hampton Research | HR4-711 | |
| CryoSleeve | Hampton Research | HR4-708 | |
| CryoCane Codificador de color - White | Hampton Research | HR4-713 | |
| Bisturí | cualquiera | ||
| Micropinza | cualquiera | para la manipulación de la cinta de sellado. etc. | |
| Aguja de acupuntura | cualquier | p. ej. de una farmacia | |
| Microscopio estereoscópico | cualquiera | para la inspección de placas de cristalización y montaje de cristales, aumento de hasta 160X |
Referencias
- Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin Microbiol Infect. 18 (Suppl 6), 5-12 (2012).
- O'Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epid....
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Reimpresiones y permisos
