Producción, Cristalización y determinación de la estructura de C. difícil PPEP-1 a través de microsiembra y Zinc-SAD

Summary

Prolina-prolina endopeptidasa-1 (PPEP-1) es una metaloproteasa secretada y una prometedora diana farmacológica del patógeno humano Clostridium difficile. Aquí describimos todos los métodos necesarios para la producción y determinación de la estructura de esta proteína.

Abstract

Se necesitan nuevas terapias para tratar las infecciones por Clostridium difficile que son una amenaza importante para la salud humana. La metaloproteasa PPEP-1 de C. difficile es una diana para el desarrollo futuro de inhibidores que disminuyan la virulencia del patógeno. Para llevar a cabo la caracterización biofísica y estructural, así como el cribado de inhibidores, se necesitarán grandes cantidades de proteína pura y activa. Hemos desarrollado un protocolo para la producción y purificación eficiente de PPEP-1 mediante el uso de E. coli como huésped de expresión, produciendo cantidades suficientes y pureza de proteína para la cristalización y determinación de la estructura. Además, mediante el uso de microsiembra, los cristales de PPEP-1 altamente intercrecidos se pueden cultivar hasta obtener cristales bien ordenados adecuados para el análisis de difracción de rayos X. Los métodos también podrían utilizarse para producir otras proteínas recombinantes y para estudiar las estructuras de otras proteínas que producen cristales interclorados.

Introduction

Clostridium difficile es una de las principales causas de las infecciones diarrea asociada a antibióticos nosocomiales ^1. Esta bacteria anaerobia Gram-positiva se transmite a través de su forma de esporas a través de la vía fecal-oral. En la última década, la nueva '' epidemia '' o '' hypervirulent '' (por ejemplo, las cepas de BI / NAP1 / 027) produjo un aumento drástico de las nuevas infecciones y las tasas de mortalidad en América del Norte y Europa ^2. C. difficile enfermedad -asociado (CDAD) es una amenaza para la vida inflamación del colon con altas tasas de mortalidad ^3. Los síntomas varían desde diarrea ⁴ a ⁵ colitis pseudomembranosa y el megacolon tóxico menudo fatal ^6.

El tratamiento de la CDAD es difícil, ya que las cepas virulentas son resistentes a múltiples fármacos y la tasa de recurrencia es alto ^7. En la terapia de momento incluye el metronidazol antibióticos, fidaxomicina o vancomicina, o en repetitivamente los casos recurrentes de trasplante fecal microbiota. Se necesitan con urgencia ⁸ nuevas estrategias terapéuticas. Algunos avances se registra como el anticuerpo monoclonal terapéutico Bezlotoxumab, apuntando a la toxina de C. difficile B ^9, recientemente ha superado con éxito la fase III de ensayos clínicos y fue presentado para su aprobación por la FDA y EMA. Además, los nuevos antibióticos se están probando en el momento en diferentes etapas de los ensayos clínicos ^10.

Para desarrollar un tratamiento eficaz nuevas dianas terapéuticas deben ser identificados. El recientemente descubierto C. difficile proteasa endopeptidasa-1-prolina prolina (PPEP-1; CD2830 / Zmp1; EC 3.4.24.89) es un objetivo tan prometedor, ya que la falta de PPEP-1 en una cepa knock-out disminuye la virulencia de C . difficile in vivo ^11. PPEP-1 es una metaloproteasa secretada ^12,13 escindir dos adhesinas de C. difficile en su C-terminal ¹³ liberando así la bacter adherenteia del epitelio intestinal humano. Por lo tanto, está implicado en el mantenimiento del equilibrio entre el fenotipo sésiles y móviles de C. difficile. Para desarrollar inhibidores selectivos contra PPEP-1 y para entender la forma en que reconoce sus sustratos conocimiento íntimo de su estructura tridimensional es indispensable. Hemos resuelto la primera estructura cristalina de PPEP-1 sola y en complejo con un péptido sustrato ^14. PPEP-1 es la proteasa primera sabido que selectivamente escinde enlaces peptídicos entre dos residuos de prolina ^15. Se une el sustrato de una manera de doble retorcido y la estabiliza a través de una red alifático-aromático prolongado de residuos localizados en el S-bucle que cubre el sitio activo de la proteasa ^14. Este modo de unión al sustrato es aplicable sólo a PPEP-1 y no se encuentra en proteasas humanas hasta la fecha. Esto hace que sea un objetivo prometedor fármaco, y fuera de objetivo efectos de los inhibidores muy improbables.

Para el desarrollo y la pantalla selectiva PPEP-1 inhibitors en el futuro se necesita una gran cantidad de proteína pura y monodispersa PPEP-1. Además, para determinar el modo de unión de los primeros inhibidores, estructuras co-cristalinas con PPEP-1 tendrá que ser determinado. En nuestras manos PPEP-1 produce constantemente cristales intergrown. Por lo tanto, hemos desarrollado un procedimiento de optimización para producir monocristales calidad de difracción de PPEP-1. En este protocolo se describe en detalle la solución de producción, purificación, cristalización y la estructura de PPEP-1 ^14. Utilizamos la expresión intracelular en Escherichia coli de una variante PPEP-1 carece de la secuencia señal de secreción, cromatografía de afinidad y cromatografía de exclusión de tamaño con la eliminación de la etiqueta de purificación, seguido por microsiembra ¹⁶ en una pantalla de la optimización y la determinación de la estructura a través de zinc única longitud de onda de dispersión anómala (zinc-SAD) ^17. Este protocolo puede ser adaptado para la determinación de la producción y la estructura de otras proteínas (por ejemplo, </ Em> metaloproteasas) y en particular para las proteínas que producen cristales entrecrecidos. A petición, el ADN del plásmido de la construcción (pET28a-NHis-rPPEP-1) y los datos de difracción se puede proporcionar con fines educativos.

Protocol

1. Clonación y Construir Diseño

1. Clon de la secuencia de codones optimizados (para E. coli) de C. difficile PPEP-1 sin el péptido señal [los aminoácidos 27-220, llamado de aquí en adelante recombinante PPEP-1 (rPPEP-1) ^11] en el vector pET28a usando Nde I y Xho I sitios de restricción (Figura 1) con un codón de parada en el (vector resultante pET28a-NHis-rPPEP-1) extremo 3 '. Esto produce una N-terminal 6xHis de etiquetado de proteínas (NHis-rPPEP-1) con un sitio de escisión de trombina que permite la eliminación de la etiqueta durante la purificación (Figura 1). El plásmido contiene un casete de resistencia a kanamicina para la selección. Los cebadores utilizados para la clonación se describen en otra parte ^14.

Figura 1: Representación esquemática de la construcción de pET28a-NHis-rPPEP-1 y SDS-PAGE análisis de expresión y todas las etapas de purificación. (A) Mapa del vector del NHis-rPPEP-1 se clonó en el vector pET28a usando Nde I / Xho que creé con PlasMapper. (B) Representación esquemática de la NHis-rPPEP-1 constructo (panel superior) y la construcción final después de trombina escisión de la etiqueta 6xHis con el GSHM-secuencia adicional resultante en el extremo N-terminal (panel inferior). El análisis por SDS-PAGE (C) de la expresión en BL21 (DE3) de la estrella a 37 ° C durante 4 horas y (D) de las muestras de todas las etapas de purificación (M: marcador de peso molecular). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Expresión y purificación de rPPEP-1

1. Expresión de NHis-rPPEP-1
   1. Maquillaje y autoclave LB (caldo lysogeny) medio (10 g / L de triptona, 5 g / L de extracto de levadura, 10 g / L NaCl, Adjust a pH 7,5 con NaOH). Suplemento con sulfato de kanamicina (50 mg / ml) justo antes de su uso (medio LB / Kan).
   2. Inocular un cultivo de una noche 200 ml de recién transformado E. coli en medio LB / Kan. Crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a 220 rpm.
   3. A la mañana siguiente, comprobar el OD ₆₀₀ (densidad óptica a la longitud de onda de 600 nm) del cultivo durante la noche. Inocular 2,8 l de dos matraces que contienen de 1 l de LB / Kan medio de cada uno con el cultivo de una noche a un OD ₆₀₀ de 0,1. Suplemento con tres gotas de emulsión acuosa de silicona para evitar la formación excesiva de espuma. Se cultivan las células a 37 ° C con agitación a 180 rpm hasta que la DO ₆₀₀ alcanza 0,6.
   4. Tomar una muestra pre-inducción para el análisis de SDS-PAGE (equivalente a 1 ml de un cultivo a una DO ₆₀₀ = 1); añadir IPTG a 0,5 mM de concentración final para inducir la expresión de NHis-rPPEP-1. Seguir creciendo a 37 ° C / 180 rpm durante 4 horas.
   5. Determinar el OD ₆₀₀ en un 10x dilución y tomar una muestra de la cosecha (equivalente a 1 ml de un cultivo a una DO ₆₀₀ = 1).
   6. Recoger las células por centrifugación durante 20 min a 7.000 xg y 4 ° C. Para eliminar los sedimentos celulares Resuspender medio LB residuales de 1 l de cultivo en 40 ml de tampón TBS (solución salina tamponada con Tris: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM) y la transferencia a un tubo de centrífuga de 50 ml. Recoger las células por centrifugación durante 10 minutos a 10.000 x g y 4 ° C y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Analizar la expresión (lisados totales y fracciones solubles) por medio de SDS-PAGE ^18.
2. Purificación de no etiquetado rPPEP-1
   1. Tomar 50 muestras l de cada etapa de purificación para el análisis SDS-PAGE. Resuspender el sedimento celular de 1 l de cultivo en tampón TBS suplementado con 10 mg / ml DNaseI. Usar 5 ml de TBS / ADNasa I por g de células.
      1. Lisan las células por sonicación en hielo / agua usando 30% de amplitud durante 15 minutos (2 impulsos por segundo con pausa de 2 segundos). Eliminar los residuos por centrifugation durante 10 min a 10.000 xg y 4 ° C y la transferencia de sobrenadante a un tubo de ultracentrífuga. lisado claro en una ultracentrífuga durante 30 minutos a 165.000 x g y 4 ° C.
   2. Trabajar a 4-6 ° C. El uso de un sistema de bomba peristáltica o cromatografía equilibrar 2 ml de resina de níquel-ácido nitrilotriacético (NiNTA) en una columna de vidrio con tampón TBS suplementado con 10 mM de imidazol pH 7,5. Como alternativa, utilice el flujo por gravedad.
      1. Ajuste el lisado aclarado con 1 M imidazol pH 7,5 a una concentración final de 10 mM. Aplicar el lisado a la columna y lavar por etapas con tampón TBS suplementado con 10 mM e imidazol 30 mM, respectivamente, hasta que la absorción UV a 280 nm ha llegado a la línea de base.
      2. Eluir la proteína con tampón TBS más imidazol 250 mM. Re-equilibrar la columna de TBS suplementado con imidazol 10 mM y almacenar durante la noche.
   3. Determinar la concentración de proteína, ya sea a 280 nm utilizando el coefi extinciónciente de 25.900 ^{M-1 cm-1} o por cualquier otro método (por ejemplo, método de Bradford ^19). Añadir 2 unidades de trombina por mg de proteína y dializar la solución de proteína durante la noche a 4 ° C contra un volumen 50x de TBS (50x del volumen de elución NiNTA).
      NOTA: Tome el blanco correcto para la determinación de la concentración de proteína, como imidazol absorbe fuertemente a 280 nm.
   4. Pasar la solución de proteína sobre la resina NiNTA equilibrada para eliminar la proteína sin escindir. A continuación, se aplica el mismo volumen de TBS suplementado con imidazol 10 mM a la columna para recuperar toda la proteína escindida. Para limpiar la columna, eluir todas las proteínas restantes con imidazol 250 mM. Analizar las muestras a través de SDS-PAGE (Figura 1).
   5. Se concentra la solución de proteína a 4 ml en intervalos de 10 min a 4.000 xg y 4 ° C utilizando una unidad de ultrafiltración centrífuga. Mezclar la proteína concentrando después de cada intervalo para prevenir la precipitación y agregación. En este paso ocasionalLy alguna precipitación se observa para rPPEP-1 a pesar del procedimiento de mezcla.
      1. Aplicar la proteína concentrada a una columna de cromatografía de exclusión molecular, equilibrada previamente (en tampón TBS) a 4-6 ° C. La elución de la columna con tampón TBS, recoger fracciones de 1 ml y 5 sujetos l de cada fracción de segundo análisis de SDS-PAGE. rPPEP-1 eluye en un solo pico que corresponde a un monómero (Figura 2). De vez en cuando un pico menor en el peso molecular más grande se observa (pico frente), que corresponde a un dímero de la proteína. El rendimiento debe ser alrededor de 50 mg de proteína pura por litro de cultivo. Analizar todas las muestras a través de SDS-PAGE al ¹⁸ (Figura 2).

Figura 2: cromatografía de exclusión Representante y SDS-PAGE análisis de rPPEP-1. cromatograma de exclusión por tamaños (A280; la absorbancia a 280 nm) de rPPEP-1 sin etiqueta purificada usando un 16/600) columna (en Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 200 mM a 6 ° C. Basado en el volumen de elución, rPPEP-1 migra como era de esperar para una proteína de 22 kDa, sugiriendo que es predominantemente monomérica. Rara vez un pico menor fronting parece que corresponde a un dímero. (Recuadro) análisis SDS-PAGE de las fracciones de cromatografía de exclusión molecular (M; marcador de peso molecular). se aplica Cada segunda fracción. Las bandas débiles por debajo de la principal banda de rPPEP-1 corresponden a de vez en cuando se producen impurezas menores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. La cristalización y la optimización del uso de Crystal microsiembra

NOTA: rPPEP-1 cristaliza a partir de las condiciones que producen constantemente cristales altamente intergrown no adecuados para el análisis de difracción de rayos X (Figura 3). Por lo tanto, una estrategia de optimización (Figura 4) fue desarrollado para obtener cristales de alta calidad (Figura 5).

1. La selección inicial de rPPEP-1 utilizando pantallas comerciales
   NOTA: Realizar ensayos de cristalización en el formato de caída que se sienta usando pantallas disponibles en el mercado estándar y un robot de cristalización.
   1. Se concentra la proteína purificada a 12 mg / ml usando un dispositivo de ultrafiltración centrífuga en intervalos de 5 minutos a 4000 xg y 4 ° C. Mezclar la proteína concentrando después de cada intervalo para prevenir la precipitación y agregación. Determinar la concentración de proteína, ya sea a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción de 25.900 M ^-1 cm ^-1 o por cualquier otro método (por ejemplo, método de Bradford). Equilibrar la proteína a 20 ° C. Despejar todas las partículas y el polvo mediante centrifugación durante 10 minutos a 16.000 x g y 20 ° C.
   2. O bien utilizar placas de cristalización ya precargadas SEaled y se almacenó a 4 ° C o llenar los pozos de depósito de las placas con 70 l de todas las condiciones de cristalización. Permitir que todos los platos de cristalización a 20 ° C. Trabajar con rapidez, ya que los volúmenes pequeños se secan rápidamente. Utilizar una cámara de humedad alrededor del muelle del robot, si es posible.
      NOTA: Utilice las siguientes pantallas como un procedimiento estándar: SaltRx, Índice, PEG / Ion, Crystal, mago, PACT ++, JCSG ++.
   3. Configurar la pantalla con la pipeta y el depósito de proteínas en subwells 2-4. volumen de la gota es de 300 nl y las relaciones (proteína: reservorio) son 200: 100 (subwell 2), 150: 150 (subwell 3) y 100: 200 (subwell 4) (en nl). Cerrar inmediatamente la placa y el lugar en una cámara a 20 ° C.
   4. Inspeccionar bandejas inmediatamente después de la puesta a punto, y luego inspeccionar todos los días durante la primera semana, seguido de la inspección semanal.
2. Co-cristalización de rPPEP-1 con ligandos
   1. Para la co-cristalización de los complejos péptido-1-rPPEP sustrato mezclar rPPEP-1a 24 mg / ml en una proporción de 1: 1 (v / v) con un exceso molar de 7 veces de la solución de péptido (Ac-EVNPPVPD-NH ₂₎ polvo liofilizado solubilizado en tampón TBS), que dará una concentración final de 12 / ml de proteína r-PPEP-1 mg y un exceso molar de 7 veces de péptido sobre PPEP-1. Incubar durante 30 min a 20 ° C y se libera de todas las partículas y el polvo por centrifugación durante 10 min a 16.000 xg y 20 ° C. Proceder con la cristalización utilizando el procedimiento microsiembra que se describe para la proteína no unida r-PPEP-1.

Figura 3: cristales representativos de pantallas iniciales. cristales intercrecida de rPPEP-1 a 12 mg / ml cultivan en condiciones. (A) Pantalla de Cristal I / 38 (citrato de sodio 1,4 M tribásico deshidratar, HEPES 0,1 M pH de sodio 7,5; 200 nl: 100 nl). / 52 (DIB fosfato 2,4 M de amonio (B) Pantalla SaltRxASIC, 0,1 M Tris pH 8,5; 100 nl: 200 nl) y (C) (200 nl: 100 nl). (D) pantalla SaltRx / 96 (60% v / v Tacsimate pH 7,0, 0,1 M BIS-TRIS propano pH 7,0; 200 nl: 100 nl). La barra de escala = 0,2 mm. relaciones de volumen son siempre proteínas: depósito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Procedimiento para la optimización del rPPEP-1 cristalización. cristales iniciales de rPPEP-1 a 12 mg / ml de baja calidad de difracción y con múltiples celosías (intergrown) se reproducen en una pantalla de optimización 24-condición. Una vez más, sólo se observaron cristales intergrown en condiciones que contienen fosfato dibásico de amonio 2,55 M. Un lote de semillas se preparó a partir de un único cristal intergrown y se diluyó 1: 1000 en el mismo Condition (microsiembra). Se añadió un volumen de 0,5 l de stock de semillas diluido en las gotas claras restantes y monocristales creció en casi todas las condiciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Optimización de cristal usando microsiembra
   NOTA: cristales altamente intercrecida de rPPEP-1 aparecen después de dos días en una condición que contiene dibásico 2,4 M fosfato de amonio, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,5 (pantalla SaltRx, condición E4, los tres subwells) (Figura 3). Un procedimiento de optimización utilizando un tamiz de malla alrededor de la condición inicial combinado con microsiembra se aplicó (Figura 4).
   1. Preparar una pantalla de rejilla (Figura 4) que comprende 24 condiciones con 1,8 - 2,55 m de fosfato dibásico de amonio (en pasos de 0,15 M) y 0,1 M Tris-HCl pH 7,5-9,0 (en pasos de 0,5 unidades de pH) desde approprisoluciones comió acciones (4 M de fosfato de amonio y 1 tampones Tris).
      NOTA: Utilice el applet de la bandeja Marca (http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx) para calcular los volúmenes y el esquema de pipeteo para obtener 2 ml de cada condición que permite realizar 10 pantallas de optimización. El fosfato de amonio 4 M de solución madre es difícil de preparar. Calentar la solución durante la agitación para disolver completamente el polvo en agua.
   2. Pipetear 200 l de cada solución de pantalla de rejilla en los pocillos de una placa de 24 pocillos y se equilibre a 20 ° C.
   3. Configuración manual de la placa de cristalización. El volumen de la gota es 3 l y las relaciones (proteína: de depósito) son 2: 1, 1,5: 1,5 y 1: 2 (en l). Aquí, utilizar una pipeta de desplazamiento positivo para evitar la formación de burbujas de aire. Cerrar inmediatamente la placa y el lugar en una cámara a 20 ° C. Evitar la formación de burbujas de aire.
      NOTA: Después de uno a cuatro días cristales altamente intergrown aparecen en las cuatro condiciones que contienen pho 2,55 M de amoniodibásico sphate y 0,1 M Tris-HCl pH 7,5 a 9,0 (Figura 4). No se forman cristales en las 20 condiciones restantes con concentraciones de fosfato de amonio por debajo de 2,55 M. El procedimiento de microsiembra se utiliza para obtener cristales simples de rPPEP-1 en estas condiciones.
   4. Preparar una microseed de stock de cosecha de un solo cristal intergrown de una de las dos condiciones con fosfato dibásico de 2,55 M de amonio y 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 o 8,5. Los cristales pueden estar unidos a la superficie de plástico. deformación cuidado del plástico que rodea con una aguja de acupuntura ayuda a desprender los cristales.
      1. Transferencia de 50 l de la respectiva licor madre en un tubo de 1,5 ml que contienen una pequeña perla de cristal pulido (cuentas-de-semillas). El uso de un bucle de nylon montado transferir el cristal en 1 l de la solución madre colocadas en un portaobjetos de cubierta de vidrio.
      2. Transferir el líquido que contiene el cristal en el tubo y agitar a alta velocidad durante 30 seg. Hacer una mezcla 1:1000 dilución de la población de semillas en un nuevo tubo de 1,5 ml que contiene la misma condición recién preparada y agitar a fondo durante 5 segundos.
         NOTA: Las existencias de semillas pueden ser almacenadas a -80 ° C para su uso posterior.
   5. Retire el sello de la placa que cubre las 20 condiciones con gotas claras y pipeta de 0,5 l de la reserva de semillas (dilución 1: 1.000) en los pocillos. Sellar la placa y el lugar en una cámara a 20 ° C. Monocristales de la calidad de difracción de alta aparecen en 2-7 días (Figura 5).

Figura 5: cristales representativos de optimización de la pantalla. Cristales individuales de rPPEP-1 a 12 mg / ml se sembró con 1: 1000 dilución de semillas cultivadas en las condiciones siguientes: (A) fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 7,5; 1,5 l: 1,5 l; (B) Fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 7,5; 2 l: 1 l; (C) fosfato dibásico de 2,25 M de amonio, 0,1 M Tris pH 8; 2 l: 1 l; (D) fosfato dibásico de amonio 2.1 M, 0.1 M Tris pH 8; 1 l: 2 l. (E) de cristal montado en bucle de nylon 0,1 a 0,2 micras, que se cultiva en fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 8 (2 l: 1 l) y crio-protegida en fosfato dibásico 2,1 M de amonio, 0,1 M Tris pH 8, 20% de glicerol. La barra de escala = 0,2 mm en (AD). ración de volumen son siempre proteínas: depósito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Cristal de montaje y de Recogida de Datos

NOTA: Para obtener la mejor calidad de los cristales de datos de difracción se debe montar en el pico de su calidad y tamaño. Los cristales se pueden almacenar en nitrógeno líquido hasta que are sometido a análisis de difracción de rayos X a 100 K. Por lo tanto, la condición de la que se originan se debe ajustar para crio-condiciones. cristales rPPEP-1 pueden ser por adición de 20% de glicerol o 30% de sacarosa (sustitución de agua en la condición por la crio-protector) protegido crio.

1. montaje de cristal
   NOTA: Todas las etapas de manipulación de cristal deben llevarse a cabo bajo el microscopio estereoscópico.
   1. Elige el tamaño óptimo de bucle de nylon para la longitud máxima de los cristales elegidos. La típica eje más largo de cristales rPPEP-1 es de aproximadamente 100-200 micras (Figura 5). Preparar un portaobjetos de cubierta y la crio-condición apropiada (por ejemplo dibásico de amonio 2,1 M de fosfato, Tris 0,1 M, pH 8,0, glicerol al 20%).
      1. Llenar los termos de espuma con nitrógeno líquido, cargar la pinza vial con un vial y pre-enfriarlo en el termo de espuma de 800 ml llena de nitrógeno líquido. Colocar una manga crio y un soporte de caña de crio marcado con un identificador adecuadoDewar en espuma de 2 litros llena de nitrógeno líquido. Cargar la varita magnética con un lazo de nylon montado.
         NOTA: Use ropa protectora (eyeshield / gafas, guantes) cuando se trabaja con nitrógeno líquido. objetos calientes sumerge en nitrógeno líquido puede producir derrames.
   2. Cortar y abrir la cinta de sellado con un bisturí afilado y quitarlo con los fórceps. Pipeta de 1 l de la crio-condición en la diapositiva de la cubierta (o, alternativamente, en un pozo vacío en el mismo plato) y retirar el cristal de la caída de la pesca con el lazo de nylon montadas (Figura 5). cristales unidos pueden separarse fácilmente del suelo mediante la deformación del plástico que rodea con una aguja de acupuntura.
      1. transferir rápidamente el cristal de la gota de la crio-estado y dejar reposar y estabilizar durante 1 segundo. Pescar el cristal a cabo lo más rápidamente posible y de inmersión congelación en nitrógeno líquido.
      2. Cuando el nitrógeno líquido alrededor del circuito montado deja de ebullición, colocar el bucle en el vial.Colocar el vial en el soporte de la caña de crio y cuando está cargado con 6 viales colocar un manguito crio alrededor del soporte. Guarde los cristales en un tanque lleno de nitrógeno líquido hasta su uso.
2. Recopilación de datos
   NOTA: La recolección de datos puede llevarse a cabo en el difractómetro casa, si está disponible, o en una línea de luz de sincrotrón. Para los datos rPPEP-1 se recogieron en la línea de luz X06DA de la fuente luminosa suizo, Paul-Scherrer-Institute, Villigen, Suiza usando un detector de recuento de fotones híbrido. Los datos originales y todos los archivos que se utilizan en la determinación de la estructura pueden ser disponibles bajo petición.
   1. Configurar la longitud de onda del haz a 1.282 Å (9667 keV), que es la energía característica de rayos x borde de absorción (pico) del elemento de zinc. rPPEP-1 es una metaloproteasa que contiene un solo zinc por molécula en el sitio activo.
   2. Recoger los datos a 100 K en el modo inverso del haz en 10 ° cuñas para un total de 270 ° en cada directionorte. El tiempo de exposición es de 0,1 segundos con 0,1 ° de rotación por imagen. Establecer la transmisión al 14% (0,14).
   3. Para recoger un conjunto de datos de alta resolución nativa de un segundo cristal procedente de la misma condición de cristalización configurar la longitud de onda del haz a 1,00 Å (12.398 keV). Recoger datos a 100 K. El tiempo de exposición es de 0,1 segundos con 0,1 ° de rotación por imagen. Establecer la transmisión al 70% (0,7).

5. Determinación de la estructura a través de Zinc-SAD

NOTA: Con el fin de determinar la estructura de rPPEP-1 a través de zinc-SAD se necesita algún conocimiento básico cristalográfica, así como los paquetes de software XDS ^20, Phenix ²¹ y el programa Coot ^22. Para la visualización de las estructuras se necesita el programa PyMOL ²³ o ²⁴ de la quimera. Los datos recogidos en la longitud de onda correspondiente al pico en el borde de absorción del elemento de zinc se pueden utilizar para una sola longitud de onda disp anómalaersion (SAD) ²⁵ para obtener información de fase que puede ser extendido para todos los átomos de la proteína.

1. Procesamiento de datos
   1. Procesar los dos conjuntos de datos de pico (normales e inversas) utilizando el software XDS (alternativamente iMosflm o HKL3000) en el grupo espacial P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ (grupo espacial 19) que separan los ayudantes del Friedel (datos anómalos). Los parámetros de la celda unidad debe estar alrededor de a, b, c (a) = 43.17, 71.68, 117.70 y α = β = γ (°) = 90. Esto da dos HKL-files (archivos de reflexión).
   2. Inspeccionar el CORRECT.LP archivo. Utilizar los datos hasta la resolución en la que el CC _media es de al menos 50%. Escalar juntos ambos conjuntos de datos / archivos reflexión (HKL-archivos) utilizando XSCALE. Inspeccionar el XSCALE.LP archivo. Compruebe hasta dónde se extiende la señal anómala (SigAno) y tenga en cuenta la resolución con una correlación anómala (anomal Corr) de alrededor de 30%, que es de 2 A en el caso de los datos utilizados aquí recogidos a 1,67 Å. Este es elresolución de corte de la señal anómala utilizado en Phenix AUTOSOL.
   3. Convertir el (reducido) HKL-archivo en un archivo de formato reflexión CCP4 (con nombre, por ejemplo, peak_anom.mtz) mediante la creación de un subconjunto XDSCONV _libre R de 5% y el mantenimiento de los datos anómalos (FRIEDEL'S_LAW = FALSO). Compruebe el MTZ-archivo para mantener la coherencia con el programa mtzdmp la inspección de los parámetros de la unidad de celda, el grupo espacial y la existencia del subconjunto R _libre (etiqueta FreeRflag) y los datos anómalos (etiquetas DANO / SIGDANO). Prepara también un MTZ-archivo adicional con XDSCONV sin necesidad de extraer los datos anómalos (FRIEDEL'S_LAW = TRUE; llamado, por ejemplo, peak_native.mtz) para el refinamiento en una etapa posterior.
2. Solución subestructura (determinación de fase)
   1. Ejecutar Phenix AUTOSOL utilizando el archivo de peak_anom.mtz reflexión. Seleccionar pico SAD / MAD como tipo de datos y elegir 2 sitios de zinc (ya que hay dos moléculas por unidad asimétrica). Elegir entre el expe más exactalos valores mentales para el theotetical los valores de f '/ f' '(parámetros determinados en un análisis de fluorescencia a la línea de luz) o f' = -8,245 y f '' = 3.887. También cargar el archivo FASTA que contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína cristalizada.
   2. Establecer el límite de resolución a la resolución con una correlación anómala (anomal Corr) de aproximadamente el 30% (determinada en 5.1.2), en este caso 2 a y seleccione la opción "modelo autobuild". El uso de las fases de los dos sitios de zinc que se encuentran por Phenix HySS (parte de la tubería Phenix AUTOSOL) las fases de la proteína entera podría ser deducido y el modelo construido (por Phenix RESUELVEN) en la densidad de electrones. El mejor modelo es llamado "overall_best.pdb".
3. La construcción de modelos, el refinamiento y la validación
   1. Seleccionar la opción "modelo autobuild" para construir la mayor parte del modelo de rPPEP-1 de forma automática. Inspeccionar la densidad electrónica en el 1,0 σ nivel de contorno utilizando el program Coot (Figura 6). Debe ser conectivo y que rodea a los átomos del modelo. Lo ideal sería que también algunas moléculas de agua deben ser incorporados en el modelo (con una resolución mejor que 2,5 Å). agua a granel (espacio entre las moléculas) no debe contener densidad.
   2. Comprobar si todo el modelo es (todos los aminoácidos incorporados en la densidad de electrones) completos. Si no es así, construir manualmente utilizando las herramientas proporcionadas por la focha. Refinar la estructura mediante la ejecución de rondas de reiteración de Phenix Refinar con 5 refinamiento redondea cada uno usando el archivo de modelo overall_best.pdb, el archivo peak_native.mtz reflexión y el archivo de secuencias FASTA; y la creación manual de modelo en la focha.
   3. Validar la calidad del modelo estructural con las respectivas herramientas de Coot.

Figura 6: mapa de densidad electrónica experimental y el modelo de rPPEP-1 después de laPhenix Autosol ejecutar. la densidad de electrones en azul en un nivel de 1,0 σ contorno que se muestra en la Focha programa. En este mapa inicial de la densidad electrónica está muy bien resuelto y el modelo a construir en la densidad de electrones. El zoom en muestra los residuos His142 y Glu189, así como una molécula de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Estructura Determinación de alta resolución a través de la sustitución molecular

NOTA: Con el fin de obtener una alta resolución de información estructural sobre rPPEP-1 nativo de un conjunto de datos se recoge. A continuación, se emplea un procedimiento de reemplazo molecular utilizando el software de ^26,27 Phaser (dentro del paquete de software de Phenix) usando la estructura determinada a través de zinc-SAD como modelo. Este procedimiento también se puede utilizar más tarde, cuando la solución de estructuras de rPPEP-1 complejados con moléculas pequeñas.

1. Para obtener una estructura cristalina con una resolución más alta (en este caso hasta 1,4 Å) procesar el conjunto de datos nativo usando el software XDS (alternativamente iMosflm o HKL3000) en el grupo espacial P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ (grupo espacial 19). Los parámetros de celda unidad deben estar cerca de a, b, c (a) = 43.17, 71.77, 117.80 y α = β = γ (°) = 90. Esto da una HKL-files (archivos de reflexión).
2. Inspeccionar el CORRECT.LP archivo. Utilizar los datos hasta la resolución en la que el CC _media es de al menos 50%. Convertir el archivo de HKL en un archivo de reflexión CCP4-formato (con nombre, por ejemplo, native.mtz) utilizando XDSCONV la creación de un subconjunto _libre R de 5%. Compruebe el MTZ-archivo para mantener la coherencia con el programa mtzdmp la inspección de los parámetros de la celda unidad, el grupo espacial y la existencia del subconjunto R _libre (etiqueta FreeRflag).
3. Preparar el archivo PDB contiene el modelo de overall_best.pdb determinado anteriormente y eliminar todas las moléculas de agua y todos los ligandos (es decir,. el átomo de zinc). También cargar el archivo FASTA que contiene la secuencia de aminoácidos de la proteína cristalizada. Phaser ejecutar en Phenix utilizando el archivo de native.mtz reflexión. Búsqueda de dos moléculas por unidad asimétrica.
4. Después exitosa resolución de la estructura (TFZ puntuación mayor que 8; aquí 10.2) inspeccionar el modelo (llamado native_phaser.1.pdb) y el mapa de densidad de electrones en la focha. Construir y refinar la estructura mediante la ejecución de rondas de reiteración de Phenix Refinar con 5 refinamiento rondas cada uno usando el archivo de modelo native_phaser.1.pdb, el archivo de la reflexión native.mtz y el archivo de secuencia FASTA; y la creación manual de modelo en la focha.
5. Validar la calidad del modelo estructural con las respectivas herramientas de Coot.

Results

rPPEP-1 se sobreexpresa en varias cepas de E. coli, con el rendimiento más alto en E. coli BL21 (DE3) Star (Figura 1C). Después de la primera etapa de cromatografía de afinidad NiNTA la etiqueta 6xHis se puede escindir con éxito de la mayoría de la proteína y en el segundo paso NiNTA proteína no digerida se puede separar completamente de la proteína trombina digerido (Figura 1D). En una columna S200 16/600 rPPEP-1 sin etiqueta migra com...

Discussion

La cristalografía de rayos X sigue siendo el método más rápido y más preciso para determinar las estructuras tridimensionales de resolución casi atómica de proteínas ^28. Sin embargo, requiere el crecimiento de cristales únicos bien ordenadas. Estos a menudo son difíciles de conseguir y el estado cristalino es artificial. Sin embargo, una comparación de las estructuras de proteínas determinadas por cristalografía de rayos X con los determinados por otros métodos, especialmente NMR, muestra generalmente una muy...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genes / Vectores / cepas celulares
pET28a	Merck-Millipore	69864	Trombina escindible N-terminal His-tag
E. coli cepa BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	codón deficiente en RNasa
H (para E. coli) de PPEP-1 (CD630_28300)	Geneart (Thermo Fisher Scientific)	personalizados	27-220
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
>QuímicosExtracto de
levadura	cualquiera
Triptona	cualquiera
Antiespumante B	Sigma-Aldrich	A5757	emulsión acuosa de silicona
Agar	cualquier
Kanamicina	cualquier
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	Grado tampón
NaCl	cualquier		Grado tampón
DNaseI	AppliChem	A3778
Imidazol	AppliChem	A1073	Grado tampón
Trombina	Sigma-Aldrich	T4648
Fosfato de amonio dibásico	Sigma-Aldrich	215996
Glicerol 100%	cualquier		grado puro
Sacarosa	Sigma-Aldrich	84097
Líquido nitrógeno	cualquiera		para el almacenamiento y el enfriamiento criogénico de cristales
Nombre	Empresa	>Número de catálogo	Comentarios
Equipo (general)
Agitar	incubadora cualquiera		que proporcione temperaturas de 20 ° C - 37 ° C
Cristalería	: cualquier		matraz Erlenmeyer con deflector (50 ml - 2,8 L)
Centrífuga para grandes volúmenes de cultivo	cualquier		centrífuga para volúmenes de procesamiento de hasta 12 L
Sonicator Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	o cualquier otro sonicador / disruptor de células
Ultracentrífuga	cualquier		centrífuga que proporciona velocidades de hasta 150.000 x g
Resina NiNTA Superflow	Qiagen
Empty Glass Econo-Column	Bio-Rad		7371007 o cualquier otra columna de vidrio o plástico vacía
Exclusión de tamaño columna de cromatografía HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
Sistema de cromatografía Ä KTA Purificador	GE Healthcare	28406264	o cualquier otro sistema de cromatografía
Tubos de diálisis Spectra/Por 3	Spectrum Labs	132724
Cierres de tubos de diálisis	Spectrum Labs	132738
Unidades de ultrafiltración (concentradores) 10.000 NWCO	cualquier
espectrofotómetro UV-Vis	cualquier
< strong>Nombre	Compañía	Número de catálogo	Comentarios
Equipo (cristalografía)
bajo volumen 0.1-10 µ l	cualquier
pipeta de desplazamiento positivo Microman M10	Gilson	F148501
Robot de cristalización	cualquier
placa de cristalización de 96 pocillos TTP IQ con tres pocillos de proteínas	TTP	4150-05810	o cualquier otra placa de cristalización de 96 pocillos
Placa CombiClover Junior de 24 pocillos	Jena Bioscience	EB-CJR
Cinta de sellado transparente	Hampton Research	HR3-511
Diapositivas de cubierta de vidrio siliconado	Hampton Research	HR3-225
Pantallas de cristalización comerciales: SaltRx, Index, PEG/Ion, Crystal	Hampton Research	diversas
pantallas de cristalización comerciales: Wizard, PACT++, JCSG++	Jena Bioscience	diverso
JBS Beads-for-Seeds	Jena Bioscience	CO-501
CrystalCap SPINE HT (bucles de nylon)	Hampton Research	diversos	tamaños de bucle 0,025 mm - 0,5 mm
CrystalCap Vial	Hampton Research	HR4-904
Espuma criogénica Dewar 800 ml	Hampton Research	HR4-673
Espuma criogénica Dewar 2 L	Hampton Research	HR4-675
Abrazadera de vial, recta	Hampton Research	HR4-670
CrystalWand magnético, recto	Hampton Research	HR4-729
CryoCane 6 Soporte para vial	Hampton Research	HR4-711
CryoSleeve	Hampton Research	HR4-708
CryoCane Codificador de color - White	Hampton Research	HR4-713
Bisturí	cualquiera
Micropinza	cualquiera		para la manipulación de la cinta de sellado. etc.
Aguja de acupuntura	cualquier		p. ej. de una farmacia
Microscopio estereoscópico	cualquiera		para la inspección de placas de cristalización y montaje de cristales, aumento de hasta 160X