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Artículo de método

Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas

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DOI:

10.3791/55028

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8 de enero de 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

En este artículo

Resumen

Aunque las células poliploides proliferativas son necesarias para analizar la inestabilidad cromosómica de las células poliploides, crear tales células a partir de células humanas no transformadas no es fácil. En el presente informe se describen procedimientos relativamente sencillos para establecer células tetraploides proliferativas libres de una población diploide a partir de fibroblastos humanos normales.

Resumen

Las células poliploides (en su mayoría tetraploides) se observan a menudo en lesiones preneoplásicas de tejidos humanos y se ha considerado que su inestabilidad cromosómica es responsable de la carcinogénesis en dichos tejidos. Aunque las células poliploides proliferativas son necesarias para analizar la inestabilidad cromosómica de las células poliploides, la creación de dichas células a partir de células humanas no transformadas es bastante difícil. La inducción de tetraploidía por agentes químicos generalmente resulta en una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides, y la mayoría de los estudios emplearon la clasificación o clonación de células activadas por fluorescencia al limitar la dilución para separar las células tetraploides de las diploides. Sin embargo, estos procedimientos requieren mucho tiempo y son laboriosos. El presente informe describe un protocolo relativamente sencillo para inducir células tetraploides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normales con una contaminación mínima por células diploides. En resumen, el protocolo se compone de los siguientes pasos: detención de células en mitosis por demecolcina (DC), recolección de células mitóticas después de sacudirlas, incubación de células recolectadas con DC durante 3 días adicionales e incubación de células en un medio libre de drogas (reanudan la proliferación como células tetraploides dentro de varios días). Dependiendo del tipo de célula, se puede omitir la recolección de células mitóticas por sacudida. Este protocolo proporciona un método simple y factible para establecer células tetraploides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normales. Las células tetraploides establecidas por este método podrían ser un modelo útil para estudiar la inestabilidad cromosómica y el potencial oncogénico de las células humanas poliploides.

Introducción

Polyploidy se ha observado no sólo en tejidos especializados de las especies de mamíferos, sino también en una variedad de condiciones patológicas, como el cáncer y las enfermedades degenerativas. Células poliploides (en su mayoría tetraploides) se observan a menudo en lesiones preneoplásicas de tejidos humanos, tales como esófago 1,2 o escamosas lesiones intraepiteliales de Barrett del cuello del útero 3,4, y se han considerado para ser la fuente de células aneuploides en los tejidos malignos 5 , 6. Aunque se sugiere que la conversión de tetraploide a las células aneuploides podría ser un evento crucial en las primeras etapas de la tumorigénesis, los mecanismos implicados en este proceso no se entienden completamente. Esto es en parte porque no hay un modelo in vitro ha estado disponible en las células humanas no transformadas pueden propagarse poliploides.

Algunos investigadores han inducido tetraploidia en las células epiteliales humanas no transformadas a través de la generación de células binucleadas por INHibiting citocinesis 7-9. En este método, sin embargo, las células diploides innecesarios deben ser eliminados por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 7,8 o de clonación por dilución limitante 9. Debido a que estos procedimientos son laboriosos y no es fácil de realizar, métodos más simples para establecer se desean células tetraploides no transformadas para la investigación en este campo.

En el presente informe, se describe un protocolo para establecer células tetraploides de proliferación de fibroblastos humanos normales o fibroblastos humanos telomerasa inmortalizado por procedimientos relativamente simples. Los procedimientos utilizan husillo demecolcina veneno (DC) para detener las células diploides en la mitosis, las células mitóticas y recogidos por sacudiéndose se trata adicionalmente con CC. células mitóticas diploides tratados con DC durante un tiempo prolongado se convierten en células G1 tetraploides, y estas células proliferan como células tetraploides después de la detención del crecimiento durante varios días siguientes a la retirada de drogas. Este protocolo proporcionaun método eficiente para la creación de un modelo útil para estudiar la relación entre la inestabilidad cromosómica y el potencial oncogénico de células humanas poliploides.

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Protocolo

1. Cultura de la célula

  1. Obtener las células para inducir tetraploidia. Hasta la fecha se ha confirmado que esta técnica se puede aplicar a las líneas celulares de fibroblastos humanos TIG-1, BJ, IMR-90 y inmortalizado-telomerasa TIG-1 (TIG-HT).
  2. Se cultivan las células en medio esencial mínimo con modificación α o cualquier otro medio de cultivo celular adecuado para el tipo de célula para ser estudiado suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) por incubación en un 5% (v / v) atmósfera de CO2 a 37 ° C. células de paso cada 3 o 4 días que no exceda subconfluent densidad.
    NOTA: El nivel de duplicación de la población (PDL) se debe calcular cada vez que en los pases para evaluar el crecimiento celular y la edad celular. PDL puede calcularse a partir del número de células se sembraron en un plato (N1) y el número de células cosechadas en la próxima pases (N2) utilizando la siguiente fórmula (X es el PDL inicial). PDL = X + (log N1 - N2 log) / log 2

2. Inducción y Establecimiento de células tetraploides a partir de fibroblastos diploides

  1. Inducir tetraploidia sin que se mueva-off.
    NOTA: Algunas cepas de células (por ejemplo, TIG-1) puede llegar a ser casi completamente tetraploide por tratamiento continuo con demecolcina (DC) como sigue.
    1. células paso a una o dos 100 mm platos en el día antes del tratamiento para inducir la tetraploidía. Por lo general, preparar 5 x 10 5 a 1 x 10 6 células por placa para la inducción de células tetraploides.
    2. Tratar las células en crecimiento exponencial con un medio que contiene 0,1 mg / ml de CC durante 4 días.
    3. Reemplazar DC que contienen medio con medio libre de fármaco e incubar las células en un 5% (v / v) CO 2 atmósfera a 37 ° C. Las células normalmente reanudan la proliferación dentro de 1 semana.
  2. Inducir tetraploidia con batido-off.
    NOTA: La mayoría de las células se convierten en una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides como consecuencia de la sencilla tratamiento con DC descrito anteriormente (2,1). Por lo tanto, algunas modificaciones de la pPROCEDIMIENTO para eliminar son necesarias una población diploide de la siguiente manera (Figura 1).
    1. células de paso en varios matraces T75 el día antes del tratamiento para inducir tetraploidia. Por lo general, preparar al menos 5 x 10 6 células (1 x 10 6 células por frasco) para la inducción de células tetraploides.
    2. Tratar las células en crecimiento exponencial con un medio que contiene 0,1 mg / ml de CC durante 16 - 18 h para detener las células en la mitosis. El tiempo necesario para detener las células en la mitosis puede depender de las células diana y debe ser determinado por experimentos preliminares para obtener el mayor número de células mitóticas como sea posible. Por ejemplo, las células de crecimiento más lento deben ser tratados con DC por el tiempo más largo que las células que crecen más rápido.
      NOTA: Si las células se tratan durante demasiado tiempo en este paso, se les podrá realizar el deslizamiento mitótico y se adhieren a la superficie del plato, lo que hace imposible para recoger células mitóticas por el movimiento de compensación en el siguiente paso.
    3. Recoger las células mitóticas detenidos-DC por el método de agitación en off, en whICH células mitóticas ligeramente adheridas se recogieron por agitación suave de frascos y lavado con medio, seguido de centrifugación (300 xg, 5 min). Contar el número de células por un método apropiado en este paso.
    4. Resiembre células mitóticas recogidos en placas de cultivo de 60 mm y el tratamiento de las células con 0,1 mg / ml DC durante 3 días adicionales. Semillas más de 1 x 10 6 células mitóticas por placa, porque menos de 10% de las células puede sobrevivir a este tratamiento.
    5. Reemplazar DC que contienen medio con medio libre de drogas y esperar a que las células para reanudar la proliferación, que generalmente ocurre dentro de 1 semana.
  3. células Passage de manera similar a las células diploides originales.

3. Examen de la ploidía

NOTA: Este es un procedimiento bien establecido y un manual técnico debe ser referido a los procedimientos detallados y consejos técnicos.

  1. Cosecha células (5 x 10 5 - 1 x 10 6) por las células de incubación con una solución conque contiene 0,05% de tripsina y 0,02% de EDTA durante 10 minutos a 37 ° C, y neutralizar la tripsina por medio que contiene 10% de FBS.
  2. Centrifugar las células en medio y lavar por resuspensión en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguido de centrifugación (300 xg, 5 min).
  3. Preparar las células para el análisis de ADN por uno de los dos métodos siguientes
    1. Un método para el análisis de las células no fijadas 10
      NOTA: Este método se puede realizar usando un kit comercialmente disponible para el análisis del ciclo celular. Las muestras preparadas con este método deben ser analizadas inmediatamente, ya que las células no están fijadas en el procedimiento y se tiñeron los núcleos se dañe con el tiempo.
      1. Lavar las células con tampón citrato 40 mM que contenía sacarosa 250 mM. Posteriormente tratar las células con 250 l de 0,1% (v / v) de Nonidet P40 y 30 mg / ml de tripsina en tampón citrato 200 l de 40 mM que contiene sacarosa 250 mM durante 10 min a temperatura ambiente.
      2. Añadir 200 l de 0,5 mg / ml de tripsina inhibitor células y 0,1 mg / ml de RNasa A en tampón citrato 40 mM que contenía sacarosa 250 mM, y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
      3. Añadir 200 l de 0,4 mg / ml de yoduro de propidio (PI) en tampón citrato 40 mM que contenía sacarosa 250 mM, y se incuban las células durante 10 minutos a temperatura ambiente para teñir los núcleos celulares.
    2. Un método para el análisis de células fijadas
      1. Fijar las células con 80% de etanol en la suspensión de células en 1 ml de PBS, la adición de 4 ml de EtOH al 100%, gota a gota mientras que se mezcla la suspensión de células y dejándolo a temperatura ambiente durante 30 min. Las células en este fijador se pueden almacenar a -20 ° C durante varias semanas.
      2. Lavar las células mediante resuspensión en 5 ml de PBS, seguido de centrifugación (300 xg, 5 min). Tratar las células con 0,5 mg / ml de RNasa A y manchar con 50 mg / ml de yoduro de propidio (PI) (475 l de 0,5 mg / ml de RNasa A y 25 l de 1 mg / ml PI) durante 30 min a temperatura ambiente.
  4. Analizar el contenido de ADN de tque las células utilizando un citómetro de flujo con un láser de 488 nm y filtro de emisión del canal rojo (pase largo> 610 nm). Analizar una muestra de referencia preparada a partir de células diploides auténticos al mismo tiempo para evaluar la ploidía de las células diana.
    1. Alternativamente, añadir perlas de fluorescencia estándar para evaluar la relación de intensidad de fluorescencia de las células diploides frente a las perlas. Utilice la 'de altura de impulsos de anchura de impulso vs.' opción del citómetro de flujo para discriminar entre células tetraploides individuales y grupos de células diploides 11.

4. El examen de recuentos cromosómicos y análisis de cariotipo

NOTA: Todos estos son procedimientos bien establecidos y un manual técnico o los protocolos del fabricante deben ser referidos a los procedimientos detallados y consejos técnicos.

  1. Tratar las células en crecimiento exponencial con 0,1 mg / ml de CC durante 4 h para detener las células en metafase.
  2. Preparar en otro portaobjetos cromosómicos.
    1. células de la cosecha (por lo menos 5 x 10 5 células) por tratamiento con tripsina y suspender en un medio que contenía FBS.
    2. Centrifugar las células en un medio (300 xg, 5 min) y se trata con una solución hipotónica (5 ml de KCl 0,075 M) a 37 ° C durante 10 minutos.
    3. Fijar y suspender las células en el fijador de Carnoy (metanol: ácido acético = 3: 1).
    4. Extender las células sobre un portaobjetos de vidrio por dejar caer un pequeño volumen (25 - 35 l) de la suspensión celular. Los pasos adicionales tales como la exposición a vapor caliente pueden ser necesarias para mejorar la difusión de los cromosomas.
  3. Las células de la mancha de recuentos cromosómicos o análisis de cariotipo o de fluorescencia multicolor de hibridación in situ (mFISH).
    1. recuentos cromosómicos.
      1. las células se tiñen con solución de Giemsa al 5% (o 5 mg PI / ml que contenía 0,5 mg / ml de RNasa A para microscopía de fluorescencia) para 15 a 20 min.
      2. fotografiar digitalmente al menos 50 células en metafase.
      3. Contar el número de cromosomas por célula utilizando un análisis de imágenes software después de la separación manual de los cromosomas y tocar la superposición usando un software de edición de fotos. Aunque el número de cromosomas se puede marcar de forma manual, se recomienda la puntuación computarizada.
    2. análisis del cariotipo
      NOTA: Este análisis debe ser realizado por un técnico capacitado o una empresa profesional.
      1. Células de tinción de acuerdo con una técnica de bandeo G estándar 12.
      2. Analizar los cromosomas para hacer karyograms estándar 12.
    3. mFISH
      NOTA: Este paso es opcional y debe realizarse si es necesario.
      1. Las células de la mancha utilizando sondas FISH multicolor para los cromosomas humanos de acuerdo con el protocolo del fabricante 13.
      2. Analizar los cromosomas utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros adecuados y un software para el análisis mFISH 13.

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Resultados

En nuestra experiencia, las células TIG-1 se pueden hacer casi completamente tetraploide con un tratamiento continuo sencilla con 0,1 mg / ml de CC durante 4 días (Figura 2 A). Por el contrario, otras cepas de fibroblastos, tales como BJ o IMR-90, y las células TIG-HT, se convirtieron en una mezcla de diploides y poblaciones tetraploides siguiendo el mismo tratamiento, y el aislamiento de las células mitóticas por el método de agitación en off es necesario durante el cur...

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Discusión

Un problema importante en la inducción de tetraploidía a partir de células diploides por agentes químicos, ya sea por los inhibidores de citocinesis o por inhibidores del huso, es que las células se vuelven a menudo una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides, y las células tetraploides deben separarse de las células diploides. Los métodos más comunes para el aislamiento de una población tetraploide libre de células diploides utilizan FACS o la clonación por dilución limitante. Sin embargo, estos procedimientos s...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a la Sra. Matsumoto por la asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MEM-y alfa;Sigma-AldrichM8042-500ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Solución de Demecolcina (10 μ g/mL en HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus Kits de reactivos de ADNBD Biosciences#340242Para el examen de la ploidía del ADN por citometría de flujo
Cromosoma humano multicolor Sonda FISH 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DInecesita un conjunto de filtros especializado y software para el análisis mFISH
Sistema de imágenes Isis con mFISH  software Es necesario el kit de sonda especializadoMetaSystems
Se de

Referencias

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