Establecimiento de células tetraploides proliferativa de fibroblastos humanos no transformadas

Resumen

Aunque las células poliploides proliferativas son necesarias para analizar la inestabilidad cromosómica de las células poliploides, crear tales células a partir de células humanas no transformadas no es fácil. En el presente informe se describen procedimientos relativamente sencillos para establecer células tetraploides proliferativas libres de una población diploide a partir de fibroblastos humanos normales.

Resumen

Las células poliploides (en su mayoría tetraploides) se observan a menudo en lesiones preneoplásicas de tejidos humanos y se ha considerado que su inestabilidad cromosómica es responsable de la carcinogénesis en dichos tejidos. Aunque las células poliploides proliferativas son necesarias para analizar la inestabilidad cromosómica de las células poliploides, la creación de dichas células a partir de células humanas no transformadas es bastante difícil. La inducción de tetraploidía por agentes químicos generalmente resulta en una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides, y la mayoría de los estudios emplearon la clasificación o clonación de células activadas por fluorescencia al limitar la dilución para separar las células tetraploides de las diploides. Sin embargo, estos procedimientos requieren mucho tiempo y son laboriosos. El presente informe describe un protocolo relativamente sencillo para inducir células tetraploides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normales con una contaminación mínima por células diploides. En resumen, el protocolo se compone de los siguientes pasos: detención de células en mitosis por demecolcina (DC), recolección de células mitóticas después de sacudirlas, incubación de células recolectadas con DC durante 3 días adicionales e incubación de células en un medio libre de drogas (reanudan la proliferación como células tetraploides dentro de varios días). Dependiendo del tipo de célula, se puede omitir la recolección de células mitóticas por sacudida. Este protocolo proporciona un método simple y factible para establecer células tetraploides proliferativas a partir de fibroblastos humanos normales. Las células tetraploides establecidas por este método podrían ser un modelo útil para estudiar la inestabilidad cromosómica y el potencial oncogénico de las células humanas poliploides.

Introducción

Polyploidy se ha observado no sólo en tejidos especializados de las especies de mamíferos, sino también en una variedad de condiciones patológicas, como el cáncer y las enfermedades degenerativas. Células poliploides (en su mayoría tetraploides) se observan a menudo en lesiones preneoplásicas de tejidos humanos, tales como esófago ^1,2 o escamosas lesiones intraepiteliales de Barrett del cuello del útero ^3,4, y se han considerado para ser la fuente de células aneuploides en los tejidos malignos ^{5 , 6.} Aunque se sugiere que la conversión de tetraploide a las células aneuploides podría ser un evento crucial en las primeras etapas de la t....

Protocolo

1. Cultura de la célula

1. Obtener las células para inducir tetraploidia. Hasta la fecha se ha confirmado que esta técnica se puede aplicar a las líneas celulares de fibroblastos humanos TIG-1, BJ, IMR-90 y inmortalizado-telomerasa TIG-1 (TIG-HT).
2. Se cultivan las células en medio esencial mínimo con modificación α o cualquier otro medio de cultivo celular adecuado para el tipo de célula para ser estudiado suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) por incubación en un 5% (v / v) atmósfera de _CO2 a 37 ° C. células de paso cada 3 o 4 días que no exceda subconfluent densidad.
   NOTA: El nivel de duplic....

Resultados

En nuestra experiencia, las células TIG-1 se pueden hacer casi completamente tetraploide con un tratamiento continuo sencilla con 0,1 mg / ml de CC durante 4 días (Figura 2 A). Por el contrario, otras cepas de fibroblastos, tales como BJ o IMR-90, y las células TIG-HT, se convirtieron en una mezcla de diploides y poblaciones tetraploides siguiendo el mismo tratamiento, y el aislamiento de las células mitóticas por el método de agitación en off es necesario durante el cur.......

Discusión

Un problema importante en la inducción de tetraploidía a partir de células diploides por agentes químicos, ya sea por los inhibidores de citocinesis o por inhibidores del huso, es que las células se vuelven a menudo una mezcla de poblaciones diploides y tetraploides, y las células tetraploides deben separarse de las células diploides. Los métodos más comunes para el aislamiento de una población tetraploide libre de células diploides utilizan FACS o la clonación por dilución limitante. Sin embargo, estos procedimientos s.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MEM-y alfa;	Sigma-Aldrich	M8042-500ML
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML
Solución de Demecolcina (10 μ g/mL en HBSS)	Sigma-Aldrich	D1925-10ML
BD CycleTES Plus Kits de reactivos de ADN	BD Biosciences	#340242	Para el examen de la ploidía del ADN por citometría de flujo
Cromosoma humano multicolor Sonda FISH 24XCyte	MetaSystems	#D-0125-060-DI	necesita un conjunto de filtros especializado y software para el análisis mFISH
Sistema de imágenes Isis con mFISH  software	Es necesario el kit de sonda especializado	MetaSystems

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