Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

Natasa Strbo; Laura Romero; Maria Alcaide; Margaret Fischl

doi:10.3791/55038

Artículo de método

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

DOI:

10.3791/55038

⸱

6 de febrero de 2017

Natasa Strbo¹ , Laura Romero¹ , Maria Alcaide² , Margaret Fischl²

¹Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, ²Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

En este artículo

Resumen

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Describimos aquí un método de aislamiento para obtener linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos para el análisis de células T gamma delta intraepiteliales. Este protocolo puede ampliarse para la purificación de las células T gamma delta endocervicales mediante perlas magnéticas o mediante clasificación de células.

Resumen

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El tracto reproductivo (FRT) del sistema inmune de la mucosa femenina sirve como la primera línea de defensa. Un mejor conocimiento de la mucosa genital tanto, es esencial para la comprensión de la patogenicidad de diferentes patógenos, incluyendo el VIH. Gamma delta células (GD) T son el prototipo de células T "no convencionales" y representan un grupo relativamente pequeño subconjunto de células T definidas por su expresión de receptores de células T (TCR) heterodiméricas compuestas de cadenas gamma y delta. Esto los diferencia de las células T clásicos y mucho mejor conocidos CD4 ⁺ helper y células T citotóxicas CD8 ⁺ que están definidas por los TCR alfa-beta. GD células T a menudo muestran la localización específica de tejido y se enriquecen en el epitelio. células T GD orquestan la respuesta inmune en la inflamación, la vigilancia de tumores, enfermedades infecciosas, y la autoinmunidad.

A continuación, presentamos un método para aislar y analizar los linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos GD T reproducible. nos hacinco muestras endocervicales cytobrush utilizados de mujeres que participan en el Estudio de la Infección por VIH Interinstitucional de la Mujer (WIHS). El conocimiento acerca de GD células T interacciones durante las condiciones en las que hay un insulto a la mucosa vaginal se podría aplicar a cualquier estudio clínico en el que se dirige la vulnerabilidad de la mucosa, incluyendo el desarrollo de la adición microbicides.In vaginal, el conocimiento de las respuestas de células de la mucosa GD T tiene potencial para la aplicación de la terapia inmune basada en células T GD en el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Introducción

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Desarrollamos metodología de la utilización de muestras de cepillo endocervical para evaluar las células T intraepiteliales GD. El canal cervical está recubierto por una sola capa de epitelio columnar. Linfocitos intraepiteliales representan linfocitos de primera línea que residen dentro de la capa epitelial que rápidamente pueden iniciar la respuesta inmune al encontrarse con microbios patógenos ^{^7,} ^8. La comprensión de los eventos inmunológicos del compartimiento intraepitelial endocervical es importante para el diseño de estrategias eficaces para prevenir las infecciones, incluido el VIH.

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Protocolo

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Las actividades de estudio se llevaron a cabo en la Universidad de la Unidad de Investigación del VIH de Miami, en colaboración con Estudio de Mujeres Miami VIH Interagencial (WIHS) y el Centro de Miami para la Investigación del SIDA (CFAR) .Institutional Junta de Revisión (Universidad de Miami Miller School of Medicine) se obtuvo la aprobación previa a la contratación y los procedimientos de evaluación o estudio relacionado.

1. Recogida de muestras endocervicales Cepillo

NOTA: Los participantes se sometieron a un examen vaginal realizado por MD entrenado o ginecólogo y colección de los linfocitos intraepitelial....

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Resultados

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Recientemente, se analizaron las células T intraepiteliales GD endocervicales y que fueron los primeros en reportar sobre la pérdida de células T gamma delta endocervical en mujeres infectadas por el VIH ^{^9,} ^11. Aquí, se describe el protocolo para aislar y analizar el subconjunto de células T gamma delta endocervical. Como se muestra en la Figura 1, las células T GD pueden ser detectados fácilmente en las muestras.......

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Discusión

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Evaluación de la vulnerabilidad de la mucosa del tracto genital inferior femenino es un componente esencial de los estudios clínicos que abordaron riesgo de adquisición y transmisión del VIH. Típicamente FGT vulnerabilidad a la infección del VIH se evalúa midiendo moduladores inmunes solubles en las secreciones genitales (citoquinas, quimioquinas y péptidos antimicrobianos) ^{^12,} ^13. Sin embargo, estos biomarcadores son sólo indicativos de inflamación vaginal, se .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen asociación comercial o de otro tipo que puedan suponer un conflicto de intereses (por ejemplo, la propiedad de existencias de productos farmacéuticos, de consultoría, de miembros del Consejo Asesor, las patentes pertinentes, o financiación de la investigación).

Agradecimientos

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Agradecemos a los participantes en el estudio Miami WIHS por su disposición a participar en este trabajo. Los datos en este manuscrito fueron recogidos por el Estudio Interinstitucional VIH en Mujeres Miami (WIHS). Los contenidos de esta publicación son de la exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas y el Estudio de la Infección Interagencial del VIH de la Mujer (WIHS) [beca número U01 AI103397], Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud [número de ....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo
Cytobrush Plus GT	(CareFusion, San Diego, CA, EE. UU.
IMDM, Iscove's Modified Dulbecco's Medium	ThermoFisher Scientific 12440061
contador de células automatizado Beckman Coulter (el analizador de viabilidad celular de la serie Vi-CELL	Beckman Coulter	496178
DMSO, dimetilsulfóxido	Sigma Aldrich	D2650
FBS, Suero Fetal Bovino	Invitrogen, Gibco	26140-079
PBS	Invitrogen, Gibco	10010023
BSA	Sigma Aldrich	A-9647
LIVE/DEAD Kit de tinción de células muertas amarillas reparables	Life	Technologies,L349S9
1% paraformaldehído	Sigma Aldrich	D6148
Citómetro de flujo Fortessa	Becton Dickinson
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
ArC Amine Reactive Compensation Beads (Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.)	Life Technologies	A10346
anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit	Milteny Miltenyi Biotec Inc.	130-050-701
Columna		103-042-201
Separador		4124

, MS MACS

Referencias

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Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission.<....

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Muestra de cepillado endocervical Aislamiento mediante esferas magn ticas Clasificaci n celular activada por fluorescencia TCR Gamma Delta C lulas CD45 positivas C lulas CD3 positivas Expresi n de colorante de viabilidad Diagrama de dispersi n lateral directa

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