Artículo de método

In Situ Detección y cuantificación de la célula de las nanopartículas de óxido de Metal usando análisis de microsonda Nuclear

DOI:

10.3791/55041

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3 de febrero de 2018

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1Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), Université de Bordeaux, 2Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), CNRS, 3Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), CNRS, 4Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), Université de Bordeaux

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Se describe un procedimiento para la detección de elementos químicos presentes in situ en células humanas, así como su cuantificación en vitro . El método es adecuado para cualquier tipo de células y es particularmente útil para los análisis químicos cuantitativos en las células siguiendo en vitro exposición de nanopartículas de óxido de metal.

Resumen

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Micro-analítico técnicas basadas en la proyección de imagen de elementos químicos permiten la localización y cuantificación de la composición química a nivel celular. Ofrecen nuevas posibilidades para la caracterización de los sistemas vivos y son especialmente apropiados para detectar, localizar y cuantificar la presencia de nanopartículas de óxido de metal tanto en muestras biológicas y el medio ambiente. De hecho, estas técnicas todas necesidades relevantes en términos de sensibilidad (i) (de 1 hasta 10 μg.g-1 de masa seca), (ii) micrómetro gama resolución espacial y elemento (iii) detección. Dadas estas características, la proyección de imagen de elemento químico microhaz puede poderosamente complementar rutina técnicas de imagen tales como óptica y microscopía de fluorescencia. Este protocolo describe cómo realizar un análisis de microsonda nuclear en células cultivadas (U2OS) expuestas a las nanopartículas de dióxido de titanio. Las células deben crecer y ser expuestas directamente en un soporte de muestra especialmente diseñada en el microscopio óptico y en las etapas de análisis de microsonda nuclear. Inmersión de congelación criogénica fijación de las muestras conserva la organización celular y la distribución de elementos químicos. Análisis de microsonda nuclear simultánea (microscopía transmisión de iones, espectrometría de retrodispersión de Rutherford y partículas inducidas por emisión de rayos x) en la muestra proporciona información sobre la densidad celular, la distribución local de los elementos químicos, así como el contenido celular de nanopartículas. Hay una necesidad creciente de tales herramientas analíticas en biología, especialmente en el contexto emergente de la Nanotoxicología y la nanomedicina para que nuestra comprensión de las interacciones entre las nanopartículas y las muestras biológicas debe ser profundizado. En particular, como análisis de microsonda nuclear no requieren de nanopartículas que se etiqueten, abundancia de nanopartículas es cuantificable hasta el nivel de células individuales en una población celular, independientemente de su estado superficial.

Introducción

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Homeostasis celular está determinada por el control de la absorción, asimilación y localización intracelular de diferentes oligoelementos (iones, metales, compuestos inorgánicos exógenos). Estos componentes son frecuentemente en forma de huellas, pero sin embargo pueden tener un impacto considerable en la fisiología del sistema. Así, el estudio de la Bioquímica celular en situaciones normales y patológica, destacó es un paso clave hacia una comprensión global de los mecanismos metabólicos celulares. Por lo tanto, hace necesario el desarrollo de técnicas de proyección de imagen y analíticas que permiten la investigación de abundancias químicas intracelulares, organización estructural y sus funciones metabólicas relacionadas. Muy pocos métodos son capaces de proporcionar una pieza cuantitativa en situ de la información relativa a la naturaleza en general química de una muestra. Aparte de métodos de análisis de muestras en forma masiva, análisis en situ consideran muestras biológicas en su integralidad sin perder información masiva y estructural, conservando así sus constituyentes químicos (iones y elementos traza) y proteínas. Además, como las nanociencias continúan desarrollándose, la proyección de imagen mejorada y métodos analíticos para la vigilancia del medio ambiente a escala celular será necesarios observar y cuantificar las interacciones y los comportamientos de nano-objeto. 1

Nanopartículas (NPs) han sido definidas como objetos de exhibir al menos una dimensión facial en el rango 1 y 100 nm. 2 debido a sus propiedades fisicoquímicas particulares, NPs son ampliamente utilizados en la industria. NPs se emplean en aplicaciones de bio y en nanomedicina. 3 , 4 a pesar de las numerosas características físico-químicas del NPs, que pueden generar riesgos de efectos adversos sobre la salud humana y el medio ambiente. Estos riesgos pueden ser inducidos por la exposición prolongada y repetitiva en varios niveles de concentración y esto no todavía se ha establecido claramente. 5 , 6 , 7 , 8 en particular, el destino de NPs dentro de las células y las respuestas celulares asociadas son, hasta la fecha, no se describe. Esto es en parte debido a la escasez de métodos que permiten la detección y cuantificación de NPs interiorizados en una sola celda. 9

Las herramientas analíticas clásicas utilizadas para estimar la dosis celular de nanopartículas son Microscopias, espectrometría de masas (MS), acoplado inductivamente a plasma MS (ICP-MS)10,11 y cromatografía líquida de que MS (LC-MS), pero sólo proporcionan información útil en la escala macroscópica. Ninguno de ellos puede proporcionar una evaluación precisa de los contenidos subcelulares de NPs ni la distribución de NPs sin el uso de métodos de fraccionamiento. Una evaluación sistemática de la dosis-respuesta por lo tanto es imposible con estos métodos, en comparación con métodos basados en la espectroscopia atómica como la microsonda nuclear análisis12,13, microscopía de fluorescencia de rayos x de sincrotrón14 y Spectrometry total de Ion secundario (SIMS). 15 , 16 estos métodos son particularmente interesantes como complemento de observaciones mediante microscopía de fluorescencia, sobre todo cuando NPs no pueden ser etiquetados con moléculas fluorescentes y así se estudiaron en su estado nativo. Hasta cierto punto, incluso cuando los NPs son injertados con fluoróforos, i cuantificación sigue siendo difícil porque se desconoce el nivel marcado por NP y (ii) la modificación química de la superficie de la NP puede modificar su distribución celular.

En este artículo, nos centramos en un método basado en una combinación de técnicas de microsonda nuclear con el objetivo de la morfología y composición elemental de muestras biológicas en mayor, menor, la proyección de imagen y seguimiento de las concentraciones.

Análisis de microsonda nuclear resulta particularmente adecuado para la medición de elementos químicos en los tejidos biológicos. La resolución lateral del haz (0.3 a 1 μm) y la sensibilidad en la detección de elementos químicos (de 1 a 10 μg.g-1 masa en seco) son ideales para estudios a nivel celular. Microsonda nuclear técnicas se basan en la detección de partículas (fotones, electrones, iones) emitida después de la viga de ion (típicamente funcionando a energías de MeV) interactúa con los átomos presentes en la muestra. Las interacciones que ocurren en las células son principalmente: 1) excitación/ionización de átomos seguido por una emisión de fotones después de átomos vuelven a su estado fundamental; y 2) difusión de las partículas entrantes hacia el cambio en su energía y dirección. La medida de la identificación de permita de energía emite partículas de átomos involucrados en la interacción. Para realizar el mapeo de elementos, el ion microhaz es repetidamente analizado sobre la superficie de la muestra, a menudo sobre un área de cerca de 100 por 100 μm2 que contiene varias células. Se detectan las partículas emitidas y su energía se registra para cada posición de la viga. Clasificación de partículas según la posición de la viga, identificando así la estructura responsable de la emisión de dichas partículas es el objetivo del tratamiento de datos. Aquí, describimos precisamente un enfoque basado en la microscopía de fluorescencia y análisis de microsonda nuclear para detectar como para cuantificar NPs exógenas en las escalas celulares y subcelular, con el fin de investigar las consecuencias de las interacciones NP con vida sistemas. Enfocará particularmente en las oportunidades ofrecidas por este método en términos de cuantificación en situ de dióxido de titanio nanopartículas (TiO2 NPs) agregados a nivel subcelular.

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Protocolo

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1. sostenedor de la preparación

  1. Preparación y diseño de muestra
    1. Fabricación de un sostenedor de la muestra por un cuadrado de 5 x 5 mm en un marco PEEK grueso de 1 milímetro de la perforación.
    2. Limpieza por lavado con etanol 70% (v/v) y mantener en placas estériles hasta que esté listo para usar.
      Tenga en cuenta. Un sostenedor de la muestra apropiado para cultivo celular y manejo de celular se requiere. Debe diseñarse para cultivo, en vitro observaciones con microscopía óptica y análisis de microsonda nuclear y la proyección de imagen de la célula. Este soporte se hace de una ojeada marco13.
  2. Preparación de soporte para la muestra
    1. Preparar la solución de Formvar disolviendo 1 mg de Formvar en polvo en 100 mL de cloroformo.
    2. Estirar la lámina de policarbonato en un marco metálico que no presenta doblez.
    3. Utilice una punta estéril para distribuir la solución de Formvar alrededor del agujero del soporte de muestra.
    4. Colocar delicadamente el portamuestras con pegamento sobre la lámina de policarbonato estirado (un cuadrado de 5 x 5 mm).
    5. Repetir la secuencia anterior para preparar un sostenedor de la muestra para cada repetición.
      Tenga en cuenta. La película de policarbonato (PC) es biocompatible, suficientemente gruesa y resistente a los diferentes protocolos y limitaciones analíticas.
      PRECAUCIÓN- cloroformo es tóxico. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente y filtros adecuados.
  3. Esterilización de sostenedor de la muestra
    1. Coloque el portamuestras montado en un erlenmeyer con 50 mL de etanol 70% (v/v) con agitación a 180 rpm y + 37 ° C durante la noche, utilizando un incubadora/agitador.
    2. Enjuague el titular varias veces en agua destilada estéril.
    3. El aire seco en condiciones estériles y exponerlos a la luz ultravioleta (lámpara germicida de banco de seguridad biológica, clase II) por 30 min en cada lado.
    4. Mantener las muestras en placas de pocillos 12 estériles (poseedor de una muestra por pozo) hasta que esté listo para usar.
      Nota: Varios titulares de la muestra pueden almacenarse a temperatura ambiente en estériles y secas placas 12-bien sellado con parafilm durante varios días.

2. crecimiento de las células en el portamuestras apropiado.

PRECAUCIÓN: Protocolo debe realizarse en un banco de flujo laminar de seguridad biológica (clase II) para excluir los microorganismos contaminantes. Manejar antibióticos (e.g. penicilina, estreptomicina) con guantes. Respetar las mejores prácticas al manipular material biológico (líneas celulares genéticamente modificadas derivan de las células humanas).

Crítico: las líneas celulares usadas deben controlarse para asegurar que no están infectados con micoplasma.

  1. Transfectar U2OS línea de células con el plásmido roGFP matriz 17,18,19 usando un método de transfección de acuerdo al protocolo establecido por el fabricante del cojinete.
  2. Para confirmar la transfección con el plásmido-llevar el biosensor y para evitar la pérdida del plásmido, seleccionar y mantener las células transfected en el medio de cultivo apropiado.
  3. Visualizar células transfected por microscopía de fluorescencia para que la transfección ha ocurrido y para confirmar la expresión de la fluorescencia y el despliegue de una red mitocondrial reticular y tubular19.
    Pausa punto: Las células pueden ser congeladas en nitrógeno líquido durante varios años.
  4. Utilizar la población de células transfected las células en un medio adecuado de cultivo para obtener poblaciones celulares los confluentes. Crecen las células a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en un ambiente saturado de agua.
  5. Semilla de las células en una concentración, tal como son en el 80% de confluencia el día de la fijación. Por lo general, se podría utilizar una concentración de 500 células por μl. Células con 400 μL de tripsina-EDTA 0.25% (v/v) de la cosecha y mantener durante 3 minutos a 37 ° C. Detener la acción de la tripsina con 1 mL de medio de cultivo. Sedimenten las células por centrifugación durante 5 min a 230 x g y + 4 ° C, luego retirar el sobrenadante y añadir el volumen deseado de medio de cultivo fresco.
    Nota. El protocolo es aplicable para todo tipo de celular y el número de células sembradas depende del tamaño de celda y en el tiempo de duplicación de la célula.
    PRECAUCIÓN: Evitar someter a tripsina, antibióticos y suero a ciclos de congelación y descongelación repetida. Mantenerlos estériles. Dividir la solución en alícuotas y congelarse a −20 ° C. Almacenar las alícuotas hasta la fecha de caducidad. Enjuague cuidadosamente el precipitado de células con el fin de eliminar completamente la tripsina. Vestigios de tripsina residual serán retrasar y disminuir la eficacia de la galjanoplastia.
  6. Contar las células y realizar una dilución con medio completo fresco de la cultura mantenido a 37 ° C para obtener una suspensión con 500 células por μl.
    Nota: La concentración de la suspensión de células tiene que ser adaptado en función del tipo de la célula, para una caída de 40 μl de la placa.
  7. Una gota de 40 μL en el centro de la hoja del policarbonato de la placa. Coloque con cuidado la muestra por 2 h a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 en un ambiente saturado de agua.
    Crítica: Una vez que la muestra se coloca en la incubadora, limitar tanto como sea posible cualquier movimiento mecánico para favorecer la fijación rápida de la célula. Según el tipo celular, podría ser necesario incubar las células de más de 2 h para una óptima eficiencia de baño. Compruebe que la atmósfera de la incubadora está bien saturado para impedir la evaporación de gotas.
  8. Compruebe que las células estén bien conectadas en la hoja de policarbonato utilizando un microscopio óptico. Añadir 2 mL de medio completo fresco y mantenga durante 24 h.

3. nanopartículas preparación y exposición

Nota: Fluorescente tinte modificado TiO2 NPs fueron diseñado, sintetizados y modificados químicamente con tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC). 20 , 21 esta modificación superficial permite la detección de nanopartículas, rastreo y localización en situ y en cellulo en células vivas y fijadas o en los organismos multicelulares. 12 , 13 , 18

PRECAUCIÓN: Nanomateriales y nanopartículas deben manipularse con cuidado. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Para evitar la difusión en el aire, las nanopartículas se mantienen en solución (agua ultrapura).

  1. Preparar una suspensión de 1 mg.mL−1 deTiO2 NPs en agua ultrapura. Dispersar el TiO2 NPs usando pulsos de intensa sonicación de 1 min a temperatura ambiente (750 W, 20 kHz, amplitud: 30%) utilizando un generador de ultrasonidos y un dedicado microprobe cónico.
  2. Diluir el TiO2 NPs en la concentración deseada en el medio de cultivo para obtener una suspensión de la exposición de 4 μg.cm−2 (concentración final). Reemplazar el medio con el volumen adecuado de medio conteniendo NPs en células y mezclar suavemente para una distribución homogénea de TiO2 NPs. preparar células control igualmente sin la adición de TiO2 NPs.
  3. Incubar las poblaciones celulares por 24 h a 37 ° C, 5% (v/v) CO2 y una atmósfera saturada de agua.

4. paraformaldehido fijación y fluorescencia microscopía.

  1. Preparar una solución fresca de solución paraformaldehido (PFA 4% p/v) en tampón de fosfato salino (PBS, pH 7,4).
    1. Disolver 4 g de polvo de la PFA en 100 mL de PBS. Calentar la solución a 65 ° C removiendo con un imán y un agitador magnético en una campana de humos. Aumentar el pH mediante la adición de una gota de 1 M de NaOH en un momento hasta que se aclare la solución. Enfriar la solución a temperatura ambiente y ajustar el pH a 7.4. Utilizar la solución recién preparada de inmediato o mantener a + 4 ° C y proteger de la luz.
      Nota: Soluciones prefabricadas de PFA se podrían utilizar sin embargo una preparación extemporánea de PFA garantiza mejor calidad de fijación y conservación a largo plazo de las muestras fijas.
      PRECAUCIÓN: PFA es tóxica; evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente y filtros adecuados.
  2. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, retirar el medio de cultivo celular que contiene el TiO2 NPs. Enjuague las poblaciones celulares una vez con medio de cultivo fresco y una vez con PBS (2 mL). Quite el PBS, enjuague rápidamente con una alícuota de la PFA fresca y fría (4% w/v, + 4 ° C).
    1. Añadir PFA (mL 2, 4% w/v, + 4 ° C). Incubar 15 min a temperatura ambiente.
    2. Quite la PFA, lavar las células con PBS (2 mL, 3 veces, 5 minutos) bajo agitación.
      Pausa punto: Estos fijos químicamente muestras pueden utilizarse para el procedimiento de "penetración-freeze" después de la proyección de imagen (ir al paso 5) la fluorescencia o utilizado sólo para (ir al paso 4.3) la proyección de imagen de la fluorescencia.
  3. Tiñen el núcleo con Hoechst33342 incubando las células durante 10 minutos en PBS. Hoescht33342 se utiliza a una concentración final de 500 nM. Después de la incubación retirar la solución y lavar con PBS.
    PRECAUCIÓN: Hoechst33342 es florescente de la célula y puede ser tóxico. Evitar el contacto directo y use guantes mientras preparando y utilizando Hoechst33342.
    Crítico: que el Hoechst33342 solución de tinción es recién preparado y mantenido en condiciones estériles.
  4. Proceso de fijado muestras para in situ y la proyección de imagen de célula mediante microscopía de fluorescencia (figura 1).

5 "deshidratación y fijación de"congelación de inmersión

  1. Preparar una placa de aluminio de transferencia por el enfriamiento de nitrógeno líquido. La placa en una caja llena de nitrógeno líquido y mantener la superficie de la placa sobre el líquido en el vapor del nitrógeno frío.
    Nota: La placa de transferencia se puede hacer de cualquier placa metálica (aquí hemos utilizado aluminio) que puede ser enfriado a temperatura de nitrógeno líquido, y que puede entrar en la cámara de muestra congelar-secador.
    Crítica: La caja debe mantenerse cerrada tanto como sea posible para evitar la deposición de vapor de agua sobre la superficie de la placa fría. La muestra almacenada en la placa durante la preparación no debe ser cubierta por nitrógeno líquido.
  2. Enjuague las células una vez en medio de cultivo y luego dos veces más, brevemente, en agua ultrapuro estéril para conseguir deshacerse de cualquier rastro de las restantes sales extracelulares.
    Crítica: Asegúrese de que los medios de comunicación están recién preparados y mantenidos en condiciones estériles. Todos los medios a 37 ° C de calor antes de ser utilizados. El enjuague debe ser muy breve (pocos segundos) y el exceso de líquido en las muestras quitado tan rápido como sea posible.
  3. Inmersión de congelación de las células a-150 ° C en líquido nitrógeno frío 2-Metilbutano durante 30 s y el lugar de ellos sobre el aluminio transfieren placa. Almacenar las muestras aquí durante la preparación del resto de las muestras. Cuando las muestras son cryofixed todos, todos-de una vez mediante la colocación de la placa de transferencia en un secador de congelación de la transferencia.
    Crítica: El proceso general de criofijación no debería durar más de 20 minutos con el fin de evitar modificaciones estructurales para aparecer en las muestras almacenadas temporalmente en la caja de transferencia.
  4. Liofilización de las muestras utilizando las siguientes secuencias: 1) efectuar una desecación primaria por 12 a 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar) a baja presión y baja temperatura, luego 2) realizar una fase de desecación secundaria durante al menos 24 h, aumentando la temperatura de la placa a + 40 ° C, manteniendo la presión baja (+ 40 ° C, 10-3 mbar).
    PRECAUCIÓN: Nitrógeno líquido extremadamente frío y puede producir daños graves de congelación o los ojos al contacto. Utilice recipientes superior Banco adaptado para el transporte y usar equipo de seguridad (protección facial y ocular, Guantes criogénicos).
    PRECAUCIÓN: 2-Metilbutano es extremadamente inflamable. Una perjudicial contaminación del aire se puede llegar bastante rápidamente en la evaporación de esta sustancia a 20 ° C. Evitar la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Uso de respiración y protección ocular y guantes de protección. Siempre utilice una campana de humos químicos funciona correctamente. Puede ser almacenado a + 4 ° C.
    Crítica: Utilice un termómetro apropiado (-150 ° C) para monitorear las temperaturas de 2-Metilbutano durante la sesión de "Congelamiento de penetración". El 2-Metilbutano debe mantenerse fresco en una fase líquida. Transferencia de muestras de cryofixed a la atmósfera ambiente puede causar daño celular debido al aumento de la temperatura o vapor de agua de condensación en la superficie de la muestra. En consecuencia, la transferencia debe hacerse tan rápidamente como sea razonablemente posible (30 s)
    Pausa punto: Después de criofijación, las muestras pueden almacenarse a temperatura ambiente durante varios días en condiciones estériles y secas (protegidos contra polvo y humedad). Manejar las muestras con pinzas finas y colocarlas en una placa de 12 pozos estéril sellada con parafilm. Desecante se puede utilizar para secar el ambiente.

6. nuclear análisis de microsonda

Nota: Análisis de microsonda Nuclear se llevó a cabo en la línea de microhaz de AIFIRA (aplicaciones Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine) utilizando las técnicas analíticas de haz de iones complementarios emisión de rayos x inducida por partículas (μ- PIXE) y microscopía de transmisión de iones (μ-STIM). La instalación está basada en un acelerador de partículas de 3,5 MV entrega de haces de iones ligeros en la gama de energía del MeV. 22 , 23

Pausa punto: AIFIRA es una instalación de la viga de ion organizada por la Universidad de Bordeaux que ofrece un acceso a los equipos nacionales e internacionales después de la evaluación científica del experimento propuesto.

  1. Monte los portamuestras PEEK en una placa perforada usando cinta de doble cara.
  2. Coloque la placa de apoyo muestra en un plano vertical perpendicular a la dirección de la viga.
  3. Cierre el compartimiento de análisis y vacío de la cámara de análisis.
  4. Microscopía de transmisión de iones (μ-STIM)
    Nota: STIM se utiliza para registrar los mapas de densidad de las células después de la conversión de la pérdida de energía a masa celular, aprovechando el hecho de que la pérdida de energía es proporcional a la densidad areal de la muestra (expresada en μg.cm-2).
    1. Utilizar un microhaz de helio (él+) de 2 MeV como una sonda con un tamaño en el plano focal de alrededor de 300 nm de diámetro y baja fluidez (2000 ions.s-1). Medida de la energía de los transmisión iones con un detector de silicio planar (detector de puntos, 25 mm2, 11 keV energía resolución @ 5,4 MeV), colocado detrás de la muestra en el eje de la viga.
  5. Partículas inducidas por emisión de rayos x (μ-PIXE) y espectrometría de retrodispersión Rutherford (RBS-μ).
    Nota: los análisis Pixe de μ y μ-RBS proporcionan la distribución espacial y cuantificación de elementos químicos con una resolución del secundario-micrómetro.
    1. Utilice un microhaz de protón (H+) de 1,5 MeV (50-150 pA), centrado hasta un diámetro de 1 μm y análisis sobre las mismas células de interés identificados por STIM de 4 a 8 horas y alrededor de 100 x 100 μm2.
    2. Recoger inducidos fotones de rayos x emitidos de los átomos presentes en la muestra (más pesada que el Na) por un detector estado sólido de alta resolución Li (resolución de energía de 145 eV, @Mn-Kα) colocados a 45 ° del eje de la viga entrante. Utilizar la energía del fotón detectado para identificar la naturaleza de los emisores (por ejemplo, Z del elemento) y la intensidad de rayos x para determinar la concentración de elemento.
    3. Al mismo tiempo recoger los protones back-esparcidas a-135 ° con un detector de silicio (detector parcialmente depletado, 25 mm2, 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) para medir el número total de partículas entrantes y para normalizar las intensidades de rayos x.
      Crítica: Una colección de estándares de calibración certificados para la cuantificación de la concentración atómica se utiliza para calibrar la respuesta del detector de rayos x. Materiales de referencia son una colección de películas delgadas de atomicas en 6,3 μm espesor láminas de Mylar. Emite la gama de energías de rayos x de 0.6 (Li, K line) a 20.2 keV (Rh, K line).

7. Análisis de datos

  1. Reconstrucción de mapas elementales químicos usando el plugin de IBA-J de ImageJ. 24
    Nota: Software dedicado en forma de un plugin para ImageJ ha sido desarrollado para procesar datos de análisis de microsonda nuclear cruda. Datos corresponden a una lista de acontecimientos derivados de la interacción del haz de partículas con las células que se registran junto con la posición de la viga como una secuencia cronológica.
    1. Usar el plugin J IBA a ordenar los eventos según su tipo: transmite energía del ion (STIM), dispersión energía del ion (RBS) o energía del fotón de rayos x (PIXE). Luego, procesar por separado cada tipo de datos.
    2. Calcular el mapa de densidad de área STIM
    3. Calcular promedio espectros de energía de fotones de rayos x y definir para cada elemento químico de interés una ventana de energía para recuperar la distribución espacial del elemento.
    4. Definir regiones de interés (ROI) (por ejemplo, las células individuales, estructura densa, agregados, etcetera) y calcular los correspondientes espectros de rayos x.
  2. Analizar los correspondientes espectros RBS para calcular el número total de partículas incidentes25.
  3. Ajuste de los espectros de rayos x utilizando los Gupix software26 para determinar la concentración de elemento para cada ROI.
    Nota: Típico límite de detección (LOD) del método está en la gama 1 a 10 μg.g-1 masa seca según el número atómico de los elementos (LOD está disminuyendo con Z).

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Resultados

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Cultivo celular y proyección de imagen de fluorescencia de etiquetado fluorescente TiO 2 NPs

Hemos diseñado un sostenedor de la muestra para cultivo celular, manejo de celular así como análisis multimodal. Específicamente, es importante que el titular permitió microscopia óptica rutinaria como bien como nuclear proyección de imagen y análisis de microsonda. Este soste...

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Discusión

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Se describe un método que proporciona información útil más allá de lo que es posible con otras técnicas de imagen, especialmente en el nivel subcelular. Además de su capacidad de proyección de imagen, análisis de microsonda nuclear también ofrece posibilidades de cuantificación de elementos químicos en la composición de una muestra biológica. En el presente trabajo, estudiamos las poblaciones de células humanas y enfocado hacia el análisis de una región solicitada de interés basándose en una sola celda expuesta a TiO

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Serge Borderes para dirección y edición del vídeo. La Agencia Nacional de investigación francés apoya el programa de investigación TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). El CNRS y la Comunidad Europea como una actividad de integración proporcionan el "apoyo de público y Industrial investigación usando Ion viga tecnología (espíritu)" bajo la CE contrato n ° 227012. Este trabajo ha sido apoyado por acciones Marie Curie - redes de formación inicial (ITN) como una "integración actividad apoyo postgrado con prácticas en industria y formación excelencia en la investigación" (SPRITE, D1.3) bajo contrato CE nº 317169. C'NANO Grand Sud Ouest y la región Aquitania apoyan el programa de investigación TOX-NANO (n ° 20111201003) y el programa de investigación POPRA (n ° 14006636-034).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
U2OSATCC, LGC ESTÁNDARESATCC HTB-96
Medio MCCOY 5A sin L-GlutaminaDominique DUTSCHERL0211-500
FBS 500 mLDominique DUTSCHER500105U
Penicilina/Estreptomicina ThermoFisher Scientific 11548876
  L-Glutamina 200 mM, 100 mL Invitrogen25030024
Geneticin,  20 mLThermoFisher Scientific10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mLThermoFisher Scientific11570626
Viromer RedLipocalyxVR-01LB-01
Matrix-roGFP PlasmidAddGene#49437
Hoechst 33342ThermoFisher ScientificH3570Maneje con cuidado
Preparación de NPs
TiO2 P25 AEROXIDEDegussa/Evonik
Tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC)SIGMA-ALDRICHT3163Modificación de la superficie de NPs
Preparación de muestras
Lámina de policarbonatoGoodfellowCT301020
Soporte de poliéter éter cetona (PEEK)MatechplastA-239-4047
Etanol, ACS absolutoSIGMA-ALDRICH02860-6x1L
Clorformo, Anhidro, 99%SIGMA-ALDRICH372978-1L Precaución tóxico
Formvar 100 gAgar Científico AGR1201Nocivo. Úselo en una concentración de 10 & micro; g por mL de cloroformo
NaOHSIGMA-ALDRICHS5881-500G
Fijación de muestras
Polvo, 95% ParaformaldehídoSIGMA-ALDRICH158127-500GPrecaución tóxico. Úselo como solución al 4% en PBS
PBS (pH 7,4, sin Ca2+ y Mg2+)ThermoFisher Scientific11503387
Prolong, Reactivo antidecoloración de oroThermoFisher ScientificP36934
Triton X-100SIGMA-ALDRICH93443
Criofijación < muestra dañina< fuerte>>
muestras de aire nitrógeno santeNocivo
>=99%SIGMA-ALDRICH  M32631-1LPrecaución
tóxico Placa de transferencia de aluminioHecho
Agua destilada y desionizadaHechoen casa Producido en el laboratorio con el sistema Barnstead Smart2Pure
ParafilmVWR52858-000
Equipment
Barnstead Smart2PureThermoFisher Banco50129870
clase IIThermoFisher ScientificMSC-Advantage
TC20 contador de células automatizadoBiorad145-0102SP
Portaobjetos de recuento 2 pocillosBiorad1450016
Detector PIPS, 25 mm2, 12 keV resolución de energía @5.5 MeVCanberra PD25-12-100AM
Detector de estado sólido de Si (Li) de alta resolución, resolución de energía de 145 eV, @Mn-K y alfa;Detector
;Orsay Physics1-SED
Estándar de calibración XRF Sodio o cloro como NaClMicromateria34381
Estándar de calibración XRF Magnesio como MgF2Micromateria34382
Estándar de calibración XRF Aluminio como Al metalMicromateria34383
Estándar de calibración XRF Silicio como SiOMicromateria34384
Estándar de calibración XRF Azufre como CuSxMicromateria34385
Estándar de calibración XRF Calcio como CaF2Micromateria34387
Estándar de calibración XRF Titanio como metalTi Micromateria34388
Estándar de calibración XRF Hierro como metal FeMicromateria34389
Sonicator 750WSonics Materiales11743619
Microsonda de 3MMBioblock scientific220-05
Liofilizador en vacíoElexienceEK3147
Microscopio óptico Zeiss AxioObserver Z1Carl Zeiss MicroImaging, GmbH431006-9901
Etapa motorizada xyCarl Zeiss MicroImaging, GmbH432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objetivoCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objetivoCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420781-9910
Juego de filtros Zeiss 02Carl Zeiss MicroImaging, GmbH488002-9901
Juego de filtros Zeiss 38HECarl Zeiss MicroImaging, GmbH489038-9901
Juego de filtros Zeiss 31Carl Zeiss MicroImaging, GmbH000000-1031-350
Campana de gases químicosErlabCaptair SD321
Acelerador de partículasHVEEsingletron
Software
ImageJ softwareInstitutos Nacionales de Salud, EE. UU.ImageJ 1.51
SimNRA softwareMax-Planck-Institut fü r Plasmaphysik, AlemaniaSIMNRA 6.06
Gupix softwareUniversidad de Guelph, CanadáGUPIXWIN 2.2.4
líquido Metilbutano en casa de bioseguridad Scientific , de electrones secundarios (SED) tipo Everhart-Thornley de Oxford Instruments

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety - A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies - A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , Elsevier Ltd. (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135(2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. SIMNRA User's Guide, Report IPP 9/113. , Max-Planck-Institut für Plasmaphysik. Garching, Germany. (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).

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