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Artículo de método

Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

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DOI:

10.3791/55043

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5 de enero de 2017

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1Department of Otolaryngology, University of Pittsburgh Medical Center, 2University of Pittsburgh Cancer Institute, Hillman Cancer Center

En este artículo

Resumen

La invasión perineural (PNI) es una característica común del carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), que confiere tasas de supervivencia más bajas. Sus mecanismos son poco conocidos. Utilizando neuritas generadas a partir de ganglios de la raíz dorsal murina confinados a una matriz semisólida, se pueden investigar las vías involucradas en el PNI de las líneas celulares HNSCC.

Resumen

La invasión perineural (PNI) se encuentra en aproximadamente el 40% de los carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). A pesar del tratamiento multimodal con cirugía, radiación y quimioterapia, las recidivas locorregionales y las metástasis a distancia se presentan en tasas más altas, y la supervivencia general se reduce en un 40 % en comparación con el HNSCC sin PNI. Los estudios in vitro de las vías implicadas en el PNI de HNSCC han sido históricamente un reto debido a la falta de un ensayo consistente y reproducible. Aquí se describe la adaptación del ensayo del ganglio de la raíz dorsal (DRG) para el examen de PNI en HNSCC. En este modelo, los DRG se extraen de la columna vertebral de un ratón desnudo sacrificado y se colocan dentro de una matriz semisólida. Durante los días siguientes, se generan neuritas que crecen en un patrón radial a partir de los cuerpos celulares del DRG. A continuación, las líneas celulares HNSCC se colocan periféricamente alrededor de la matriz e invaden preferentemente a lo largo de las neuritas hacia el DRG. Este método permite una evaluación rápida de múltiples condiciones de tratamiento, con tasas de éxito y reproducibilidad de ensayos muy altas.

Introducción

El carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) es el sexto cáncer más común en los Estados Unidos, con 10.000 muertes al año a nivel nacional y 300.000 muertes al año en todo el mundo1. El pronóstico general para el HNSCC se ha mantenido sin cambios en el 50% durante las últimas décadas. La invasión perineural (PNI) es una de las características patológicas más destacadas que auguran un mal pronóstico en los pacientes con HNSCC. Desafortunadamente, la PNI es una ocurrencia frecuente en el HNSCC y puede encontrarse hasta en el 40% de los pacientes con HNSCC2,3.

PNI es el proceso por el cual las células malignas se desplazan a lo largo de los nervios hasta los tejidos adyacentes, lo que permite tasas más altas de propagación local y a distancia. En consecuencia, los tumores HNSCC positivos para PNI tienen tasas más altas de recidivas locorregionales y metástasis a distancia, lo que resulta en una supervivencia general más baja en comparación con los pacientes con HNSCC sin PNI4-8.

Aunque el tratamiento de los pacientes con PNI generalmente se maximiza mediante el empleo de cirugía, radiación y quimioterapia, las tasas de supervivencia general de estos pacientes aún están disminuidas hasta en un 40% en comparación con los pacientes sin PNI9-11. Por lo tanto, está claro que las modalidades de tratamiento actuales para el HNSCC son ineficaces para mejorar el pronóstico adverso asociado con la PNI. El enfoque del desarrollo de la terapia dirigida contra la PNI en el HNSCC se ha visto obstaculizado por la escasa comprensión de los factores que regulan este proceso. Esto es, en parte, una consecuencia de la falta de un modelo in vitro consistente para el estudio de la PNI en el HNSCC.

En los últimos años, varios grupos han estado utilizando un modelo in vitro para estudiar el PNI en cánceres predominantemente de páncreas y próstata12-19. Este modelo utiliza las neuritas generadas a partir de ganglios de la raíz dorsal aislados de ratones o ratas como sustituto de la invasión de nervios grandes. Los ganglios de la raíz dorsal se fijan en una matriz semisólida con factor deplecionado, que es una mezcla de proteínas de la membrana basal solubilizada secretada por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm. Esta matriz permite el crecimiento de las neuritas y el seguimiento de células cancerosas individuales a lo largo de estas neuritas. Aquí se describe la adaptación de este modelo para el examen de PNI en HNSCC.

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Protocolo

1. Preparación del medio de cultivo y platos (10 min)

  1. Añadir 100 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en V.
  2. Retirar un pre-alícuotas-vial de aproximadamente 100 l de matriz semisólida del congelador 20 ° C y colocarlo directamente en hielo.
    NOTA: Para ello, antes de la ganglio de la raíz dorsal de la cosecha (DRG) porque la matriz semisólida tarda aproximadamente 30 min para alcanzar el estado líquido en el hielo, que es necesaria para las etapas ulteriores. Si no se mantiene la matriz semisólida en hielo en todo momento, el resultado es la matriz de gotitas de mala calidad.
  3. culturas placas con tinta indeleble etiqueta de fondo de vidrio, la creación de identificadores únicos en cada una de las cuatro esquinas de la parte inferior de la placa. Colocar las placas del lado derecho hacia arriba en hielo para enfriar la superficie de la placa.
    NOTA: los rendimientos de cada ratón 32 - 40 DRG, por lo etiquetarlos de 1 a 40. No es necesario pre-enfriamiento del pimascotas consejos, como consejos refrigerados se calentará durante el transcurso de la colocación de las gotitas de la matriz, lo que podría introducir diferencias en la consistencia de la matriz.

2. Disección de murino DRG (45 min)

  1. La eutanasia a un ratón nude atímicos como por protocolos de laboratorio específicas, tales como mediante el uso de una cámara de CO 2 y una toracotomía.
  2. Configurar el área de la disección y el microscopio. Utilice la parte inferior limpia, se esteriliza, y plano de contenedores de poliestireno de 15 ó tubos cónicos de 50 ml.
    NOTA: Además, son adecuados para uso como la superficie de disección, ya que son de bajo costo, desechables, y permitir la fijación de la columna vertebral utilizando agujas o alfileres. Sólo utilice los instrumentos y agujas esterilizadas.
  3. Bajo la visión natural, hacer una incisión longitudinal a lo largo de la columna vertebral de la raíz de la cola a la cabeza del ratón con un par de tijeras finas rectas o curvas.
  4. Use las mismas tijeras para dividir transversalmente por debajo de la sacral columna vertebral. Diseccionar ambos lados de la columna vertebral de todo el camino hasta la base del cráneo con las tijeras. En este punto, asegúrese de que la columna vertebral cervical se secciona cranealmente medida de lo posible con unas tijeras.
  5. Observe el extremo cervical de la columna vertebral en el microscopio de operación a baja potencia. La médula espinal blanco es evidente en el medio de un anillo óseo, que está rodeado por cantidades variables de los músculos paraespinales y tejido blando.
  6. Dividir el dorsal o aspecto superior de los primeros 2 - 3 cuerpos vertebrales con tijeras de primavera microscópicas. El uso de la acción de resorte de las tijeras, abrir este ósea inicial cortado para asegurar que la disección del cuerpo vertebral se produjo en la línea media. Continuar en pequeños incrementos hacia la columna vertebral sacro, y luego dividir en dos la columna vertebral, completando los cortes idénticos en el aspecto ventral o inferior de los cuerpos vertebrales.
    NOTA: Si no se garantiza la disección de la línea media de la columna vertebral ósea dará lugar a un rendimiento inferior DRG.
  7. en Thipunto s, la columna vertebral se divide en dos mitades. Coloque una hemi-columna vertebral a un lado, con la médula espinal en su lugar y hacia abajo en una placa estéril.
    NOTA: Al salir de la médula espinal en su lugar evitará que los GRD se sequen, ya que los GRD son profundos a la médula espinal.
  8. Asegure cada extremo de la otra hemi-espina dorsal con dos agujas de calibre 18 en la plataforma de poliestireno de disección. Comenzando en el extremo cervical (que es evidente porque la espina dorsal es más estrecha, el DRG están más cerca el uno al otro, y hay inserciones RIB), suavemente remueva la médula espinal de alrededor de 4 niveles vertebrales.
  9. Observar los nervios sensoriales (generalmente dos) que conectan la DRG. En el área donde los nervios se insertan a la DRG, agarre suavemente la fascia circundantes con unas pinzas microscópicas. Diseccionar y recortar esta fascia y otros tejidos nerviosos con las tijeras de primavera microscópicas para liberar el GRD. la retracción suave traerá el DRG fuera de su posición dentro de la columna ósea.
    NOTA: El aumento de lapoder microscopio en este paso es beneficioso. Lesión por aplastamiento a la DRG limitará de forma significativa el crecimiento de neuritas. Esto se evita que nunca agarrando el DRG directamente, sino más bien agarrando la fascia de los alrededores.
  10. Cortar el nervio periférico (DRG generalmente tiene un nervio periférico, que es profunda relación a la vista de disección) con las tijeras de primavera microscópicas para liberar el DRG.
    NOTA: Es más fácil de determinar, donde los extremos de los nervios y los GRD se inicia mientras está en tensión, por lo que hacer este corte lo más cerca posible a la GRD en este momento es ideal. Una vez que se corta esta rama distal, las ramas proximales se recortan también.
  11. Recorte el DRG de las fibras nerviosas callejeros o uniones fasciales con las tijeras de primavera microscópicas. Después de un aislamiento adecuado, coloque el DRG en el medio a temperatura ambiente dentro de la placa de 96 pocillos de fondo en V.
    NOTA: La colocación de un fondo oscuro debajo de la placa hace que la visualización de la sub-mm GRD blanco más fácil. Instale solamente un GRD en el EACh así; de esta manera, que puede explicarse más fácilmente en las etapas subsiguientes.
  12. Repita este proceso hasta el fondo de un hemi-espina dorsal y después el otro. Cada lado se obtiene 16 - 20 GRD, un total de 32 - 40.
    NOTA: Si hay menos GRD que esto, la disección de la columna vertebral debe ser llevado a cabo más cefálica y / o en sentido caudal. Los GRD se vuelven cada vez menos bien definida como se procede en sentido caudal.

3. Preparación de la matriz semiduros Las gotitas (<1 min por placa)

  1. Retire una placa de vidrio pocillos de fondo de hielo y colocarlo en un bloque de hielo debajo del microscopio quirúrgico. Asegúrese de que la parte alícuota de la matriz se mantiene en hielo en todo momento.
  2. Coloque una gota de 1,5 l de matriz en cada una de las cuatro esquinas de la placa con fondo de vidrio con un 2-l o micropipeta de 10 l, dejando una distancia al menos tan grande como la propia gota desde el borde de la copa también.
    1. Coloque la punta de la pipeta directamente sobreel vidrio en un ángulo de 45 grados. pipeta lentamente la matriz. Poco a poco alejarse de la parte inferior de vidrio después de la matriz se dedica en la placa.
      NOTA: La tensión superficial entre la matriz y el vidrio debe crear un hemisferio perfecto cada vez.
    2. Deja de pipeteado justo antes de la punta está vacío, porque inyección inadvertida de aire en la gotita matriz hace que el diámetro de la gotita de matriz mucho mayor y es difícil de eliminar.
      NOTA: El uso de una segunda mano para estabilizar la mano de pipeteado facilita la colocación más precisa.

4. La inserción de DRG en semiduros Matrix Las gotitas (<2 min por placa)

  1. Deje el plato con las gotitas de matriz brevemente a temperatura ambiente (~ 1 min). Esto endurece ligeramente la matriz, por lo que es más fácil para la colocación precisa de la DRG.
  2. Cucharada (no la sujete) el DRG suavemente con fórceps microscópicas cerradas en la mano izquierda. Una vez más, un fondo oscuro contra el pequeño, blancoDRG facilita la visualización. La transferencia de la DRG a la punta de una aguja de calibre 21 en la mano derecha. Esta transferencia dejará medios residual sobre los fórceps.
  3. Introduzca suavemente el DRG en el medio de la gotita de matriz, usando la aguja de calibre 21 (Figura 1). La mayor parte del tiempo, el DRG se suelte fácilmente en la matriz y luego se puede colocar en el centro con la aguja.
    1. Si el DRG se pega a la aguja, utilice el fórceps microscópicas para empujar el DRG fuera de la aguja y en la gota de matriz. Wick el exceso de medios de las pinzas microscópicos con un paño de laboratorio.
      NOTA: La introducción de medios de comunicación a la matriz alterará el diámetro, el volumen y la consistencia del ensayo. Un bloque de hielo con el color o la escritura de color proporciona un contraste de fondo, lo que facilita la visualización de este delicado proceso.
  4. Después de que la placa tiene las cuatro GRD, lleve a cabo una inspección final para asegurar que el DRG está en el centro de la gotita de matriz. Hacer ajustessegún sea necesario con la aguja 21 de calibre.
  5. Colocar la placa completada a una incubadora a 37ºC. Esto se solidificará la matriz semisólida y fijar la DRG en su posición.
  6. Repita este procedimiento para todos los GRD. Coloque gotitas de matriz en blanco sin una DRG como el control negativo.
  7. Añadir 4 ml de DMEM con 10% FBS a cada placa con fondo de vidrio después de completar todas las placas y exponiéndolos a la incubadora a 37ºC durante al menos 3 min. Colocar la placa en un ligero ángulo y se añade lentamente el medio, de manera que se trata poco a poco en contacto con las unidades de matriz-DRG.
    NOTA: Si se añade el medio demasiado rápido o con vigor, la matriz y / o DRG puede desalojarse.
  8. Almacenar los ensayos en la incubadora a 37ºC durante las siguientes 48 - 72 h.
    NOTA: el examen periódico de los ensayos mostrará excrecencia circunferencial de neuritas hacia el borde de la matriz (Figura 2). Cuando las neuritas son mayores que las tres cuartas partes de la forma de la matriz, sees adecuado para la placa de las células.

5. Preparación de la Cabeza y Cuello células de cáncer

NOTA: Las líneas celulares distintas de la cabeza y las células de carcinoma de células escamosas de cuello se pueden utilizar en este diseño experimental.

  1. Mantener las líneas celulares de carcinoma de células escamosas en DMEM con 10% de FBS en matraces o placas de cultivo preferidos en una incubadora a 37ºC. Para preparar células para la experimentación, la succión de todo el medio del matraz de cultivo o un plato y se lava dos veces con PBS. Suspender las células mediante la adición de una cantidad apropiada de 0,025% de tripsina durante 5 min, seguido de DMEM con 10% de FBS. Pipetear 4 ml de la mezcla de células y medios de comunicación en placas de cultivo de 6 ml.
    NOTA: Una placa de cultivo de 6 ml proporciona más que suficientes células, incluso cuando menos de 50% de confluencia.
  2. Exponer las líneas celulares HNSCC a diferentes condiciones de 24 h antes de la tinción y placas en el ensayo DRG. Re-dosificar la condición una vez que las células se colocan para mantener un environme consistenteNuevo Testamento.
    NOTA: Añadir anticuerpos, factores de crecimiento, citoquinas, u otras moléculas a las placas de cultivo celular de 1 - 2 días después de la disección del ratón y la implantación del DRG en la matriz.
  3. Añadir manchas de células fluorescentes 1 h antes en placas de las células (2 - 3 días después de la cosecha DRG y la implantación en la matriz).
    NOTA: Las manchas particulares usados ​​aquí pasar libremente a través de la membrana celular; sin embargo, después de reaccionar con los grupos tiol intracelulares, la mancha permanece dentro de la célula y se transmite a las células hijas. La tinción facilita en gran medida la visualización dentro de los ensayos. Estas manchas temporales son ideales para estos ensayos ya que la fluorescencia está presente durante 2 - 3 días, que es el período de tiempo de estos experimentos. También permite el uso de muchos colores diferentes y evita la necesidad de la creación de líneas celulares de proteína transfectadas fluorescentes.
    1. Preparar 10 M de solución de colorante mediante la mezcla de 2 l de 10 mM manchas de células de valores en 2 ml de DMEM libre de sueropara cada condición de la celda. Calentar este a 37 ° C antes de añadir a las células.
    2. Retire el medio de cultivo dentro de la placa de 6 ml, dejando las células adherentes CECC en el plato. Añadir 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y retire 2 ml de DMEM 10 M tinción celular / sin suero añadieron a cada placa
    3. Devolver la placa de cultivo de 6 ml con la mancha de células a la 37 ° C incubadora durante 40 min.
    4. Después de 40 minutos, aspirar el medio. Añadir 2 ml de PBS y luego aspirar él. Añadir 1 ml de tripsina al 0,025% a cada placa y volver a colocarlas en la incubadora a 37ºC.
    5. Añadir 2 ml de DMEM con 10% FBS después de 3-5 min y transferir las células suspendidas a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células y les volvió a suspender en 1 ml de DMEM con 10% de SFB.
    6. Contar las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado, y luego añadir DMEM con 10% de FBS para crear una concentración final de células de 300.000 células por ml.

6. Revestimiento del Jefe y NLas células del cáncer Eck

  1. Retire las placas con fondo de cristal con los ensayos de matriz-DRG de la incubadora.
    NOTA: Una vez más, que son pertinentes cuando neuritas son al menos 75% del camino hacia el borde de la matriz, que se produce generalmente después de 2 - 3 días. Esto se ve mejor utilizando al menos un objetivo de 10X.
  2. Aspirar el medio dentro de la placa con fondo de vidrio. Completamente aspirar el medio dentro del vidrio bien sin la eliminación de las unidades de matriz-DRG.
  3. Elaborar 200 l de las 300.000 células / ml de medio utilizando una pipeta de 200 l. Colocar dos gotas de las células sobre cada ensayo de matriz-DRG. Realice este paso para cada gotita matriz, creando cuatro repeticiones de cada condición de células en un plato.
    NOTA: La forma hemisférica de la matriz permite que las células se asientan en un anillo a lo largo de la periferia del ensayo (Figura 3a, Figura 3b). Encontrar una pipeta con un gatillo suave hace que la colocación de uniforme cae muy fácil.
  4. Confirmar el número de células similares y distribution de las diversas condiciones de las celdas bajo microscopía de 4X.
  5. Colocar las placas con fondo de vidrio en la incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 60 minutos. NOTA: A pesar de que sólo hay un pequeño volumen de las células y los medios de comunicación (~ 150 ml), los ensayos no se sequen hasta que hayan transcurrido varias horas de tiempo incubadora.
  6. Después de 60 min, añadir con cuidado 4 ml de DMEM con 10% FBS a lo largo de la pared lateral de la placa de fondo de vidrio.
    NOTA: Durante un período de tiempo, las células se adhieren parcialmente a la placa inferior, y el método de añadir el medio no perturbar las células. Diferentes tipos de células pueden tardar más o menos tiempo para comenzar a adherirse a la placa con fondo de vidrio.
  7. Reemplazar cualquier droga exógenos o factores de crecimiento en este momento para mantener los niveles de concentración anteriores.
  8. Devolver los ensayos para la incubadora a 37ºC, excepto cuando se examinan al microscopio. Cuantificar los resultados de este ensayo de imágenes microscópicas. En pocas palabras, contar las hebras de la invasión perineural conen cuatro cuadrantes utilizando una imagen microscópica 4X.
    NOTA: un microscopio con una 4X capacidades objetivas y de fluorescencia es adecuada para la foto-documentación de los ensayos. El tamaño de los ensayos se adapta muy bien dentro del campo de un objetivo 4X, que se detalla lo suficiente para capturar las áreas individuales de la invasión perineural. La invasión perineural se hace evidente dentro de las 24 h, pero más allá de 48 h, la integridad de los ensayos comienza a debilitarse, ya que las células tumorales se dividen a lo largo de la periferia de la matriz e invaden. Más allá de 48 h, hay también flujo de salida sustancial de los fibroblastos de la DRG, que oscurece la visualización mediante microscopía de campo claro. Por lo tanto, es aconsejable foto-documento los resultados con microscopia 4X al menos dos veces durante esta ventana (por ejemplo, a las 24 y 48 h después de la siembra las células tumorales). Tener en cuenta que estos son ensayos de 3 dimensiones, y es difícil por completo la imagen de todo el ensayo. La mayoría invasión perineural se produce en un plano de la parte inferior de la placa, donde tque células están incrustadas en la matriz ligeramente por encima de la parte inferior de la placa. Debido a que este plano es cerca de la horizontal, la gran mayoría de las neuritas con las células tumorales se capturan una imagen de un solo nivel en 4X en.

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Resultados

Después de la disección de la DRG y la colocación dentro de la gotita de matriz, la aparición del ensayo debe parecerse a la Figura 1. Obsérvese que el DRG no es perfectamente redonda, pero se centra dentro de la gotita de matriz. Esto permite la excrecencia de neuritas en 360 grados, que se muestra parcialmente en la figura 2. Tenga en cuenta que ciertas partes de la DRG envían axones más rápido y en mayor número que los demás, por lo general correspond...

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Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Los pasos más importantes dentro de este protocolo son la disección precisa y extracción de los ganglios de la raíz dorsal. transección adecuado de la columna vertebral y una división de la línea media longitudinal en dos-hemi-espinas son críticos para la obtención de un gran número de DRG. Durante la disección de los GRD individuales, el ganglio nunca debe ser manejado directamente, sino más bien los que rodean la fascia se debe agarr...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado en su totalidad por los NIH a través de la subvención R21, "Mecanismos de invasión perineural en el cáncer de cabeza y cuello" y la beca de capacitación T32 del NCI, "Capacitación en investigación postdoctoral en oncología de cabeza y cuello (2T32CA060397-21)." Gracias a Richard Steiman, MD, PhD y al personal del laboratorio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DMEM/F-12 50/50 Mezcla con L-glutamina y 15 mM HEPESCorning Cellgro10-090-CVManassas, VA
Suero fetal bovinoAtlanta BiologicalsS11150Flowery Branch, GA
0.25% Tripsina-EDTA (1x)Life Technologies Corporation25200056Grand Island, NY
Solución salina tamponada con fosfato 1xCorning21-040-CMManassas, VA
Matrigel hESC-Qualif MouseCorning Incorporated354277Bedford, MA
Placas de cultivo con fondo de vidrio irradiadas con rayos gamma de 35 mmMatTek CorporationP35G-1.5-14-CAshland, MA
SteREO Discovery.V8 MicroscopioCarl Zeiss Microimaging495015-0021-000 Thornwood, Nueva York
Fuente de luz Schott ACE ISchottA20500Alemania
CellTracker Life Technologies CorporationC2925Carlsbad, CA
BD Aguja PrecisionGlide de 18 G y 21 GBD305195Franklin Lakes, NJ
Pinza de microdisección premiumHarvard Aparato60-3851Holliston, MA
Tijeras estándar de operación fina premiumHarvard Aparato52-2789Holliston, MA
Tijeras de resorte premium Harvard Aparato60-3923Holliston, MA
Pinzas de vendajeHarvard Aparato72-8949Holliston, MA
Ratones desnudos atímicos (002019)Laboratorio Jackson 002019Bar Harbor, ME
de operación

Referencias

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