Libre de células análisis de la integridad del ADN en muestras de orina

Resumen

Se propone un método para analizar la integridad del ADN en la fracción sobrenadante libre de células de las muestras de orina. El método es adecuado para la detección precoz de neoplasias urológicas malignas y ha demostrado ser preciso para el diagnóstico precoz del cáncer de vejiga.

Resumen

Aunque la presencia de ADN circulante libre de células en el plasma o suero ha sido ampliamente demostrado ser una fuente adecuada de biomarcadores para muchos tipos de cáncer, pocos estudios se han centrado en el uso potencial de ADN libre de células de orina (UCF). Partiendo de la hipótesis de que las células apoptóticas normales producen ADN muy fragmentado y que las células de cáncer de liberación más largo de ADN, el papel potencial de la integridad del ADN UCF se evaluó como un marcador de diagnóstico temprano capaz de distinguir entre pacientes con cáncer de próstata o cáncer de vejiga y los individuos sanos.

Se propone un análisis de la integridad del ADN UCF sobre la base de cuatro PCR cuantitativa en tiempo real de cuatro secuencias de más de 250 pares de bases: c-MYC, BCAS1, HER2, y AR. Las secuencias que con frecuencia tienen un número de copias de ADN aumentado en la vejiga y de próstata fueron elegidos para el análisis, pero el método es flexible, y estos genes pueden ser sustituidos con otros genes de intedescanso. La utilidad potencial de ADN UCF como fuente de biomarcadores ya ha sido demostrada para tumores malignos urológicos, preparando así el camino para nuevos estudios sobre la caracterización del ADN UCF. La prueba de la integridad del ADN UCF tiene la ventaja de ser no invasivo, rápido y fácil de realizar, con sólo unos pocos mililitros de orina necesarios para llevar a cabo el análisis.

Introducción

-Cell libre de ADN se puede detectar en la sangre y en la orina debido a la muerte celular por mecanismos apoptóticos o necróticos. ADN libre de células en la sangre se ha estudiado ampliamente para fines de diagnóstico y pronóstico en diversas enfermedades, especialmente el cáncer ^1. Sin embargo, se sabe menos sobre el papel del ADN de orina libre de células (UCF). ADN UCF puede originarse de sangre que pasa a través del sistema de filtración glomerular o de células que entran directamente en contacto con este líquido cuerpo ² (por ejemplo, células uroteliales o células prostáticas). El uso de ADN UCF como fuente de biomarcadores princ....

Protocolo

El protocolo sigue las directrices del Comité de Ética de Investigación Humanos RIMERA.

NOTA: En este protocolo, se aisló el ADN a partir de muestras de orina para realizar un análisis de la integridad del ADN UCF. LNCaP y células MRC líneas se utilizaron para construir estándares. Técnicas tales como la extracción de ADN, la cuantificación de ADN (espectrofotómetro y PCR en tiempo real para el gen de control, STOX1) y PCR en tiempo real para oncogenes específicos se realizaron (Figura 1).

1. Recolección de orina y Procesamiento

1. Obtener una primera muestra de la mañana limpia de ori....

Resultados

La concentración total de ADN libre era cuantificable mediante espectrofotometría para todas las muestras analizadas, que muestra un intervalo de entre 1,51 y 138 ng / mL. Cinco muestras de control se utilizaron para la reproducibilidad de los datos: dos experimentos independientes en tiempo real se realizaron para c-MYC, HER2, BCAS1, AR, y STOX1. Los coeficientes de variación (CV) se calcularon entonces para cada gen (Tabla 2),

Discusión

análisis de la integridad del ADN UCF es un método nuevo, no invasivo para la evaluación de la integridad del ADN en la orina. Se propuso recientemente para el diagnóstico precoz de la vejiga y de próstata ^{9 7,8.} Se discute aquí una serie de ventajas y desventajas de la prueba de la integridad del ADN UCF, junto con las perspectivas de futuro.

La principal ventaja de este enfoque es que ofrece un método barato, no invasivo y un protocolo sencillo para estudiar la orina .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304
iQ SYBR  Supermix Verde, 100 x 50 y micro; L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)	Biorad	1708880
IDT oligótidos de ADN personalizados	IDT		Purificación por HPLC, 100nMole ADN oligo
NanoDrop 1000 Espectrofotómetro	Thermo Scientific		También se podrían utilizar otros métodos espectrofotométricos para cuantificar el ADN
Rotor-Gene 6000	Corbett		También se podría utilizar otro instrumento de PCR en tiempo real
microcentrífuga
una centrífuga para tubos de
incubadora-80
° C congelador-20
° C congelador
10 μ Pipeta
20 μ Pipeta
200 μ Pipeta
1.000 μ L pipeta
puntas de pipeta (10; 20; 200; 1.000)
Tubos de 1,5 mL Tubos de
50 mL Tubos
de
mL Rotor-Disco 72 Rotor	Corbett	9018899
Tubos y tapones, 0,1 mL (250)	Qiagen	981103
Tubos de recolección (2 mL)	Qiagen	19201
Tampón AL (264 mL)	Qiagen	19075
Proteinasa K (10 mL)	Qiagen	19133

50 mLLLL15