Artículo de método

Libre de células análisis de la integridad del ADN en muestras de orina

DOI:

10.3791/55049

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5 de enero de 2017

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1Biosciences Laboratory, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, 2Department of Urology, Morgagni-Pierantoni Hospital

En este artículo

Resumen

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Se propone un método para analizar la integridad del ADN en la fracción sobrenadante libre de células de las muestras de orina. El método es adecuado para la detección precoz de neoplasias urológicas malignas y ha demostrado ser preciso para el diagnóstico precoz del cáncer de vejiga.

Resumen

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Aunque la presencia de ADN circulante libre de células en el plasma o suero ha sido ampliamente demostrado ser una fuente adecuada de biomarcadores para muchos tipos de cáncer, pocos estudios se han centrado en el uso potencial de ADN libre de células de orina (UCF). Partiendo de la hipótesis de que las células apoptóticas normales producen ADN muy fragmentado y que las células de cáncer de liberación más largo de ADN, el papel potencial de la integridad del ADN UCF se evaluó como un marcador de diagnóstico temprano capaz de distinguir entre pacientes con cáncer de próstata o cáncer de vejiga y los individuos sanos.

Se propone un análisis de la integridad del ADN UCF sobre la base de cuatro PCR cuantitativa en tiempo real de cuatro secuencias de más de 250 pares de bases: c-MYC, BCAS1, HER2, y AR. Las secuencias que con frecuencia tienen un número de copias de ADN aumentado en la vejiga y de próstata fueron elegidos para el análisis, pero el método es flexible, y estos genes pueden ser sustituidos con otros genes de intedescanso. La utilidad potencial de ADN UCF como fuente de biomarcadores ya ha sido demostrada para tumores malignos urológicos, preparando así el camino para nuevos estudios sobre la caracterización del ADN UCF. La prueba de la integridad del ADN UCF tiene la ventaja de ser no invasivo, rápido y fácil de realizar, con sólo unos pocos mililitros de orina necesarios para llevar a cabo el análisis.

Introducción

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-Cell libre de ADN se puede detectar en la sangre y en la orina debido a la muerte celular por mecanismos apoptóticos o necróticos. ADN libre de células en la sangre se ha estudiado ampliamente para fines de diagnóstico y pronóstico en diversas enfermedades, especialmente el cáncer 1. Sin embargo, se sabe menos sobre el papel del ADN de orina libre de células (UCF). ADN UCF puede originarse de sangre que pasa a través del sistema de filtración glomerular o de células que entran directamente en contacto con este líquido cuerpo 2 (por ejemplo, células uroteliales o células prostáticas). El uso de ADN UCF como fuente de biomarcadores principalmente se ha investigado para el diagnóstico precoz de insuficiencia renal, la vejiga y el cáncer de próstata debido al alto porcentaje de ADN UCF procedentes directamente de las células del tracto urinario 3,4.

Poco se sabe sobre el ADN de la UCF y los mejores métodos para aislar y caracterizar ella. Dada la hipótesis de que las células tumorales liberan fragmentos de ADN más largos que las células normales, la evaluaciónde la integridad del ADN libre de células se ha estudiado en un intento de elucidar el origen del ADN en la circulación de la sangre 5. Algunos estudios han demostrado que la integridad del ADN libre de células en la sangre representa una buena prueba de diagnóstico para muchos tipos de cáncer 6, y la misma hipótesis ha sido propuesto en relación con la orina 7-9.

En este trabajo se describe un nuevo método para el análisis de la integridad del ADN UCF con una aplicación potencial para la detección de cáncer de vejiga y de próstata. En particular, la integridad del ADN UCF fragmentos más largos de 250 pb fue probado en 4 regiones sabe que tienen un número incrementado de copias de ADN en tumores sólidos, incluyendo cáncer de próstata y la vejiga: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2), y AR (Xq12) 10-14. oncogenes específicos, en lugar de secuencias aleatorias, se eligieron para aumentar la probabilidad de encontrar en la fracción libre de células de pacientes con cáncer. Una de las principales ventajas deeste método es que es flexible y que otras regiones también se puede seleccionar sobre la base de tipo de tumor y características.

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Protocolo

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El protocolo sigue las directrices del Comité de Ética de Investigación Humanos RIMERA.

NOTA: En este protocolo, se aisló el ADN a partir de muestras de orina para realizar un análisis de la integridad del ADN UCF. LNCaP y células MRC líneas se utilizaron para construir estándares. Técnicas tales como la extracción de ADN, la cuantificación de ADN (espectrofotómetro y PCR en tiempo real para el gen de control, STOX1) y PCR en tiempo real para oncogenes específicos se realizaron (Figura 1).

1. Recolección de orina y Procesamiento

  1. Obtener una primera muestra de la mañana limpia de orina en un recipiente limpio y seco, de plástico. Recoge al menos 50 ml de la muestra de orina.
  2. Mantener la orina a 4 ° C durante un máximo de 3 h y enviarlo al laboratorio a la misma temperatura.
  3. Mezcle cada muestra invirtiendo dos veces inmediatamente después de su llegada en el laboratorio y la transferencia en dos tubos cónicos de polipropileno de fondo de 50 ml.
  4. Centrifugar los tubosa 850 xg durante 10 min a 4 ° C o a temperatura ambiente.
  5. transferir cuidadosamente 10 ml de la parte superior del sobrenadante de la orina en dos tubos de 5 ml, dejando al menos 2 ml del sobrenadante por encima del sedimento celular.
    NOTA: La transferencia de la parte superior del sobrenadante reduce el riesgo de contaminación por células o restos celulares. No hay una clara delimitación entre las partes superior e inferior.
  6. Se desecha el precipitado y congelar inmediatamente el sobrenadante a -80 ° C hasta su uso.

2. Aislamiento de ADN a partir del sobrenadante de la orina y las líneas celulares

NOTA: Aislar el DNA de una línea celular (por ejemplo, LNCaP de cáncer de próstata o MRC para cáncer de vejiga) utilizando un kit comercial y siguiendo las instrucciones del fabricante. Aislamiento de ADN a partir del sobrenadante de la orina debe ser realizada utilizando el protocolo comercial, modificado como sigue:

  1. Descongelar una alícuota del sobrenadante de la orina a temperatura ambiente.
  2. Vortex y mezclar la muestra de orina y la transferencia de 1 ml del sobrenadante de la orina en un claro tubo de 5 ml. Congelar la orina residual a -80 ° C.
  3. Añadir 100 ml de proteinasa K a la muestra.
  4. Añadir 1 ml de tampón AL a la muestra y mezclar bien con la pipeta.
  5. Cerrar los tubos y se incuban las muestras a 56 ° C durante 15 min.
  6. Durante la incubación, preparar una columna para cada muestra y preparar los tampones de lavado, AW1 y AW2, según las instrucciones del fabricante (añada la cantidad indicada de etanol al 100%).
  7. Llevar las muestras a temperatura ambiente y se añade 1 ml de etanol absoluto. Mezclar completamente mediante pipeteo.
  8. Añadir 650 l de la mezcla obtenida en la etapa 2.7 a la columna y centrifugar al 6000 xg durante 1 min.
  9. Desechar el tubo que contiene el filtrado y coloque la columna en un nuevo tubo de recogida limpio. Repetir los pasos 2.8 y 2.9 hasta que toda la mezcla de la muestra se ha utilizado (5 veces).
  10. Añadir 500 y# 181; L de tampón AW1 sin mojar el borde de la columna. Se centrifuga a 6.000 xg que durante 1 min.
  11. Desechar el tubo que contiene el filtrado y sustituirla por una nueva, tubo de recogida limpio.
  12. Añadir 500 l de tampón AW2 sin mojar el borde de la columna. Centrifugar a toda velocidad (20.000 g) durante 3 min.
  13. Desechar el tubo que contiene el filtrado y sustituirla por una nueva, tubo de recogida limpio.
  14. Repita el paso 2.12 para remover todo el tampón de lavado residual.
  15. Colocar la columna en un tubo limpio de 1,5 ml. Añadir 50 l de tampón de elución AE y esperar 7 min para asegurar que los moja tampón de la columna.
  16. Se centrifuga a 8.000 xg que durante 1 min.
  17. Pipetear el eluyente de la etapa 2.15 en la mini-columna y centrifugar que a velocidad máxima durante 1 min para asegurar la máxima recuperación de ADN.

3. Cuantificación de ADN y dilución

  1. El uso de un espectrofotómetro, lleve a cabo la cuantificación de ADN de both la línea celular y las muestras de sobrenadante de la orina. Use 2 l de muestra en un espectrómetro de sobremesa, según las instrucciones del fabricante.
  2. Diluir las muestras de ADN UCF para obtener una concentración de 1 ng / l y almacenar el ADN a -20 ° C hasta que el análisis de la integridad del ADN.
    NOTA: Si la cantidad de ADN no es suficiente para proceder con PCR en tiempo real (por lo menos 100 ng), lleve a cabo un nuevo proceso de aislamiento de ADN.
  3. Diluir el ADN de muestras de líneas celulares para obtener seis estándares con diferentes concentraciones: 0,001, 0,01, 0,1, 1, 0,5, y 2 ng / l, cada uno con un volumen de 100 l (st1, ST2, ST3, ST4, ST5, y ST6). Almacenar los patrones de ADN de líneas celulares a -20 ° C hasta que el análisis de la integridad del ADN.

4. Prueba de ADN Integridad - PCR

  1. Descongelar los cebadores (la concentración depende del tipo de ensayo), Supermix verde, patrones de ADN de la línea celular, y muestras de ADN UCF diluidas en hielo.
  2. Prepare tiras de tubos en la placa fo el disco rotor 72 pocillos. Alícuota de 10 l por duplicado para cada estándar y muestra diluida y 10 l de agua libre de RNasa para el control negativo.
  3. Preparar una mezcla de 1 l de cada cebador (las concentraciones se indican en la Tabla 1), 12,5 l de supermix verde, y 6,5 l de agua libre de RNasa para cada muestra. En la preparación de la mezcla, utilice el siguiente número de muestras: 6 estándares para 2 repeticiones, el número de muestras de 2 repeticiones, control negativo de 2 repeticiones y 2 muestras adicionales.
  4. Alícuota de 15 l de la mezcla en cada pocillo. No pipetear o girar los tubos.
  5. Iniciar el protocolo con las condiciones de la PCR se indican en la Tabla 1.
    NOTA: Para obtener el valor de ADN UCF, 29 muestras de ADN fueron procesados ​​para cada experimento en tiempo real mediante el disco de rotor de 72 pocillos: 29 x 2 + 6 muestras x 2 + normas de regulación x 2 = 72 (valor ADN UCF) negativo.
    NOTA: El protocolo para el análisis de la integridad del ADN también puede ser UCFrealizado utilizando otro instrumento PCR en tiempo real (cuando se utiliza otro dispositivo, puede ser necesario añadir colorante ROX).

5. Prueba de ADN Integridad - Análisis e interpretación de datos

NOTA: El valor ADN UCF para cada muestra se obtuvo mediante un software de sistema de instrumento de detección en tiempo real utilizando una construcción curva estándar para cada gen evaluación PCR individual y usando interpolación curva estándar, como se describe anteriormente 7-9 (Figura 2).

  1. Evaluar las repeticiones; la muestra se replica con una diferencia ≥1 Ct debe ser desechado y re-evaluado en un segundo experimento.
  2. Calcular la mediana de Ct para cada muestra y considerar las muestras con un valor de Ct ≤ 36.
  3. Evaluar la especificidad de los productos de PCR utilizando el análisis de fusión.
  4. Evaluar la concentración de cada uno de amplificación por interpolación con la curva estándar; obtener un valor de concentración (ng / l) para cada amplicón.

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Resultados

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La concentración total de ADN libre era cuantificable mediante espectrofotometría para todas las muestras analizadas, que muestra un intervalo de entre 1,51 y 138 ng / mL. Cinco muestras de control se utilizaron para la reproducibilidad de los datos: dos experimentos independientes en tiempo real se realizaron para c-MYC, HER2, BCAS1, AR, y STOX1. Los coeficientes de variación (CV) se calcularon entonces para cada gen (Tabla 2),

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Discusión

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análisis de la integridad del ADN UCF es un método nuevo, no invasivo para la evaluación de la integridad del ADN en la orina. Se propuso recientemente para el diagnóstico precoz de la vejiga y de próstata 9 7,8. Se discute aquí una serie de ventajas y desventajas de la prueba de la integridad del ADN UCF, junto con las perspectivas de futuro.

La principal ventaja de este enfoque es que ofrece un método barato, no invasivo y un protocolo sencillo para estudiar la orina ...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Los autores agradecen a Gráinne Tierney y Silvia Bellissimo por su ayuda editorial.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
QIAamp DNA Mini Kit
 		Qiagen51304
iQ SYBR  Supermix Verde, 100 x 50 y micro; L rxns, 2,5 mL (2 x 1,25 mL)Biorad1708880
IDT oligótidos de ADN personalizados IDT Purificación por HPLC, 100nMole ADN oligo
NanoDrop 1000 EspectrofotómetroThermo ScientificTambién se podrían utilizar otros métodos espectrofotométricos para cuantificar el ADN
Rotor-Gene 6000CorbettTambién se podría utilizar otro instrumento de PCR en tiempo real
microcentrífuga
una centrífuga para tubos de
incubadora-80
° C congelador-20
° C congelador
10 μ Pipeta
20 μ Pipeta
200 μ Pipeta
1.000 μ L pipeta
puntas de pipeta (10; 20; 200; 1.000)
Tubos de 1,5 mL Tubos de
50 mL Tubos
de
mL Rotor-Disco 72 RotorCorbett9018899
Tubos y tapones, 0,1 mL (250)Qiagen981103
Tubos de recolección (2 mL)Qiagen19201
Tampón AL (264 mL)Qiagen19075
Proteinasa K (10 mL)Qiagen19133
50 mLLLL15

Referencias

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  1. Francis, G., Stein, S. Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer. Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).
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