Un rápido, método escalable para el aislamiento, estudio funcional, y análisis de la matriz extracelular derivado de células

Summary

La matriz extracelular desempeña un papel importante en la definición del microambiente de las células y en la modulación del comportamiento y el fenotipo celular. Describimos un método rápido para el aislamiento de matriz extracelular derivada de células, que puede adaptarse a diferentes escalas para estudios microscópicos, bioquímicos, proteómicos o funcionales.

Abstract

La matriz extracelular (MEC) se reconoce como un entorno diverso, dinámico y complejo que está involucrado en múltiples procesos fisiológicos y patológicos celulares. Sin embargo, el aislamiento de la MEC, a partir de tejidos o cultivos celulares, se complica por la naturaleza insoluble y reticulada de la MEC ensamblada y por la posible contaminación de los extractos de MEC con proteínas intracelulares y de superficie celular. Aquí, describimos un método para su uso con células cultivadas que es rápido y confiable elimina células para aislar una ECM derivada de células para la experimentación posterior.

Mediante el uso de este método, la MEC aislada y sus componentes pueden visualizarse mediante microscopía de inmunofluorescencia in situ. La dinámica de proteínas específicas de ECM se puede rastrear mediante el rastreo de la deposición de una proteína marcada mediante microscopía de fluorescencia, tanto antes como después de la extracción de las células. Alternativamente, se puede extraer la MEC aislada para análisis bioquímicos, como electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e inmunotransferencia. A escalas más grandes, se puede realizar un análisis proteómico completo de la MEC aislada mediante espectrometría de masas. Al realizar el aislamiento de la MEC en condiciones estériles, se pueden obtener capas de MEC estériles para estudios funcionales o fenotípicos con cualquier célula de interés. El método se puede aplicar a cualquier tipo de célula adherente, es relativamente fácil de realizar y se puede vincular a un amplio repertorio de diseños experimentales.

Introduction

Durante las últimas décadas, la matriz extracelular (ECM) ha sido reconocido como un entorno diverso, dinámico y complejo que está implicada en múltiples procesos celulares fisiológicos y patológicos. En el plano del tejido, el ECM influye en la señalización celular, la motilidad, la diferenciación, la angiogénesis, la biología de células madre, la tumorigénesis, fibrosis, etc. ^1,2. El estudio de la organización y los procesos ECM ECM dependiente tanto, tiene amplias implicaciones para la biología celular y la fisiología del tejido. Para llegar a una comprensión mecanicista de la composición de la MEC, organización y propiedades funcionales, se requieren métodos para el aislamiento exacta de ECM. Considerando que la primera identificación de proteínas ECM invocadas aislamiento de los tejidos ^3, la preparación de ECM de células cultivadas ahora ha vuelto más frecuente.

El aislamiento y el análisis de ECM derivado de células es complicada por dos razones principales. En primer lugar, la presencia de células y laabundantes proteínas intracelulares IR puede hacer que sea difícil aislar el ECM como una estructura extracelular discreta. De hecho, algunas proteínas ECM tienen funciones dentro de la célula, así como en la ECM ^4; Por lo tanto, la eliminación eficaz de las proteínas intracelulares de ECM derivado de células es vital para que el estudio de las proteínas dentro de la ECM no debe ser confundido con sus funciones dentro de la célula. En segundo lugar, ECM derivado de células se compone de muchas proteínas grandes, oligómeros, que suelen ser reticulado covalentemente en el montaje ECM y son, por tanto, insoluble en productos de limpieza usuales. Estas propiedades pueden complicar la extracción y el análisis ulterior de ECM. Para abordar estas cuestiones, se requiere un método que permite la separación eficaz de proteínas de la MEC de los componentes celulares.

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el aislamiento de ECM de cualquiera de cultivo de células o extractos de tejido. Muchos de estos métodos están dirigidos a la extracción de la abundante pr de ECMOtein, colágeno, a partir de tejidos e incluyen el uso de sales neutras ^3, condiciones ácidas ^5,6, o pepsina ^7. Aislamiento de ECM total a partir de extractos de tejidos a menudo implica descelularización del tejido antes de la aislamiento de la ECM. Por ejemplo, un método de extracción secuencial se ha descrito que aísla ECM de tejido cardiaco humano ^8. En primer lugar, las proteínas ECM unidos débilmente se extrajeron con 0,5 M NaCl antes de dodecil sulfato de sodio (SDS) se utilizó para eliminar las células. Por último, las proteínas de la MEC restantes se extrajeron usando 4 M de guanidina ^8. ECM también se puede solubilizar a partir de muestras descelularizados utilizando 8 M urea ^9. Otras técnicas utilizan detergentes, tales como el ácido desoxicólico ^10, para extraer las dos células y ECM antes de separar las proteínas ECM insolubles del lisado celular soluble por centrifugación.

El método para el aislamiento y análisis de ECM derivado de células se describe en este informe proporciona una reprométodo ducible para la eliminación de material de las células, dejando ECM derivado de células que puede ser analizada por inmunofluorescencia en situ o se extrae para su posterior análisis bioquímico. Este método puede ser adaptado para cualquier tipo de células adherentes y se pueden ampliar para procedimientos aguas abajo, tales como inmunotransferencia o espectrometría de masas, o para la utilización de la ECM aislado en estudios funcionales. El método también se puede utilizar en conjunción con la microscopía confocal de células vivas para realizar un seguimiento de la deposición de ECM de una proteína etiquetada de interés en tiempo real. Esto se logra mediante el uso de un plato cuadriculada, con fondo de vidrio. En general, el enfoque proporciona un aislamiento preciso de ECM derivado de las células y también el alcance de identificar y controlar la deposición y la dinámica de las proteínas ECM individuales.

Protocol

1. La eliminación de las células con solución de hidróxido de amonio

1. Preparar las células adherentes mediante siembra en la densidad adecuada.
   NOTA: Las células pueden ser cualquier tipo de célula adherente que produce suficiente ECM para el análisis. A continuación, describimos el uso de células COS-7, una línea celular similar a fibroblastos de riñón de mono verde africano que contiene secuencias de ADN viral SV-40; RCS, una línea celular de condrosarcoma de rata; o normal de fibroblastos dérmicos humanos (HDF) cepas de prepucio juvenil. HDF se utilizan desde el paso 1 al paso 8 solamente.
   1. Placa de las células sobre cubreobjetos para la obtención de imágenes de células vivas y ECM, para estudios de microscopía de fluorescencia de ECM fijo, o para la preparación de ECM derivado de células para los ensayos funcionales de pequeña escala. Placa las células en placas de cultivo celular para el análisis de SDS-PAGE, inmunotransferencia, o estudios de proteómica.
      NOTA: Las condiciones de cultivo celular (número de células a la placa y medio de cultivo) dependerá del tipo de célula. El número de células a la placa necesitaráestablecerse empíricamente para la línea celular en particular o cepa de células.
   2. Permitir un tiempo adecuado para que las células depositan ECM, normalmente> 16 h. NOTA: El periodo de tiempo dependerá del tipo de célula y tendrá que ser determinado empíricamente. Si la realización de la expresión ectópica, dar tiempo apropiado para la expresión de la proteína transfectada de interés y para la deposición de ECM.
2. En una campana extractora, Preparar 20 mM de hidróxido de amonio en un recipiente adecuado mediante la dilución de la solución madre de 1/14 con H desionizada ₂ O.
   1. Eliminar las células de la incubadora y eliminar suavemente medio de cultivo. Añadir solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2 ⁺ / Mg2 ^+, vertiendo suavemente contra las paredes de la cápsula. Oscile el plato dos veces y retirar el líquido con una pipeta de transferencia de plástico. Repetir dos veces más.
3. En una campana extractora, incline cada plato y retirar el PBS de la etapa 1.2 con una pipeta de transferencia de plástico. Añadir 3ml de hidróxido de amonio por plato de 100 mm y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min. Durante el período de incubación de 5 min, agitar suavemente el plato cada minutos para asegurar la lisis de todas las células. Los pasos 1.4-1.7 También se llevará a cabo en la campana extractora.
   NOTA: eliminación de células Alternativa reactivos incluyen 2 M o 8 M urea, que se incubó con las células durante 10 min.
4. Añadir cantidades copiosas de desionizada _H2O para cada plato, por lo menos 20 ml por placa de 100 mm, con balanceo. Eliminar el hidróxido de amonio solubilizado material que se compone de hidróxido de amonio, las células lisadas, y H ₂ desionizada O-por aspiración con una pipeta de transferencia. Transferir dicha solución de desecho en un recipiente para residuos líquidos.
5. Se lava la capa ECM insoluble en copiosa desionizada H ₂ O cuatro veces más para asegurar la eliminación completa de todo el material de hidróxido de amonio solubilizado.
6. Para el examen de la MEC mediante inmunofluorescencia, fijar la ECM mediante la adición de un 2%paraformaldehído (PFA; 3 ml por placa de 100 mm) a temperatura ambiente durante 10 min.
   Precaución: PFA es muy peligroso en caso de contacto con los ojos o la piel y la sobreexposición severa puede producir daño pulmonar, asfixia, inconsciencia o la muerte. Sólo debe ser manejado en una campana extractora, y el equipo de protección personal se debe usar.
7. Lavar cada muestra fija dos veces con PBS, como en el paso 1.2, y disponer de la solución de PFA en un contenedor de residuos líquidos adecuados. Si es necesario, almacenar las muestras de ECM en PBS a 4 ° C antes de prepararlos para la microscopía de fluorescencia.

2. Seguimiento de la deposición de una proteína ECM por microscopía confocal de imágenes de células vivas

1. Contar las células en un hemocitómetro. Para células COS-7, la placa de 250.000 células en una placa de cultivo de células de 60 mm para la transfección.
   NOTA: Para obtener imágenes de células vivas, las células deben ser transfectadas con un vector que codifica la proteína de interés ECM, fusionado en el marco con una fluorescencia codificado genéticamenteetiqueta nt. Esto es para permitir la identificación de la proteína de interés durante ECM imágenes de células vivas.
2. Después de un tiempo adecuado para la expresión de proteínas (por ejemplo, 16 h) eliminar las células de la placa con una solución de tripsina-EDTA, contarlas en un hemocitómetro, y ~ 150.000 células de la placa en una placa de 35 mm cuadriculada, con fondo de cristal para la imagen. Permitir 2 h para las células para volver a unir y para comenzar la deposición de ECM (el período de tiempo dependerá del tipo de célula y debe ser establecida empíricamente).
   NOTA: Utilice un soporte de células que no contiene rojo fenol, ya que esto puede dar un tinte rojo que afecta a la calidad de imagen.
3. Durante el anterior período de 2 h, establecer un microscopio confocal con una cámara de 37 ° C incubadora y un suministro de _CO2. Dejar que la temperatura en la cámara y en el plato para estabilizar a 37 ° C antes de formación de imágenes; esto puede tardar hasta 1 h.
4. Se incuban las células en placas sobre los 35 mm plato reticulados con un marcador de células fluorescentes para 30 min. A continuación, se lavan las célulasdos veces en fenol medio de cultivo libre de rojo antes de la imagen.
   NOTA: un marcador fluorescente citoplásmica se puede utilizar para visualizar volúmenes de células, o un marcador de membrana de la incorporación se puede utilizar para visualizar bordes de la celda.
5. Utilizando el objetivo 20X y contraste de fases en un microscopio confocal, identificar un cuadro de la cuadrícula apropiado que contiene un número (> 3) de adherentes, las células sanas. Confirmar la expresión de la proteína diana de elección en las celdas de la cuadrícula seleccionada utilizando los objetivos 63x o 100x y las longitudes de onda apropiadas bajo microscopía de fluorescencia.
6. Configurar la fluorescencia y de contraste de fase imágenes de lapso de tiempo utilizando un software z-pila. Coloque la pila "Comenzar" para ser justo por debajo de la capa de ECM y la pila de "Fin" para ser justo por encima del cuerpo de la célula. Ajuste el tamaño de z a paso a 0,3 micras y la z-volumen a entre un 5 y 10 micras de profundidad en total, dependiendo del tipo de célula. Esto dará entre 15-30 z secciones por cada punto de tiempo.
7. Capture fluorescencia (para la proteína roja fluorescente (RFP), excitación = 555 nm y emisión = 584 nm) y las imágenes de contraste de fase periódicamente durante un período de tiempo establecido. Por ejemplo, utilizar el software de lapso de tiempo para establecer el intervalo de tiempo entre 2 min y la duración de 2 h. Seleccione el botón "Inicio" para iniciar la captura de imágenes de sección z durante el período de tiempo definido.
8. Al final del periodo de tiempo, eliminar las células de plato, como se describe en los pasos 1.1-1.5, para confirmar la localización de la proteína fluorescente de etiquetado de interés en el ECM.
9. Usar imágenes de contraste de fase y el objetivo 20X para reubicar el cuadrado de la cuadrícula correspondiente.
10. Cambiar con el objetivo 63X e identificar la capa de ECM con microscopía de fluorescencia. Compara esta imagen con la imagen anterior a la extracción

3. Preparación estéril de ECM de la célula derivada de la célula para ensayos funcionales

1. Crecer una población de células (las células productoras "matriz") en cubreobjetos y otra poblamento (las células de "prueba") en cultivo estándar en una placa de cultivo celular 100 mm durante al menos 24 h.
   NOTA: Estos pueden ser cualquiera de los dos tipos de células adherentes diferentes, y el diseño experimental pueden incluir la transfección de las poblaciones de una o ambas de células para expresar una proteína fluorescente ECM-tagged.
2. En una campana de flujo laminar, tal como se utiliza para el cultivo celular, se preparan soluciones estériles de PBS sin Ca2 ⁺ / Mg2 ^+, hidróxido de amonio 20 mM (véase el paso 1.3), y des-ionizada _H2O haciendo pasar cada uno a través de un estéril de 0,2 filtro de micras en un contenedor estéril apropiado.
3. El mantenimiento de una técnica estéril, lavar suavemente las células "productoras de matriz" en cubreobjetos tres veces con PBS estéril (véase el paso 1.2).
4. Retire el PBS mediante aspiración con una pipeta estéril y disponer en un contenedor de residuos líquidos adecuados. Añadir mM de hidróxido de amonio 20 estéril (3 ml / 100 mm placa) y se incuba durante 5 min con balanceo a intervalos.
5. Agregar grandes cantidadesde estéril desionizada _H2O al plato "productor de matriz", por lo menos 20 ml por placa de 100 mm, con balanceo, y vaciar el lisado celular en un contenedor de residuos adecuado.
6. Repita el paso 3.5 cuatro veces más para asegurar la eliminación completa del material de hidróxido de amonio solubilizado.
   NOTA: El ECM depositado por las células productoras "matriz" en los cubreobjetos a continuación, proporciona una ECM estéril para los ensayos funcionales con cualquier célula de prueba de interés.
7. Se incuban las células de ensayo de la placa celular stock con 1,5 ml de solución de tripsina-EDTA por plato 100 mm (0,05% w / v de tripsina y 0,02% w / v EDTA en solución salina equilibrada de Hank) hasta que las células de ensayo se separan de la placa . Añadir medio de células, centrifugar las células de ensayo a 400 xg durante 5 minutos, y retirar el líquido sobrenadante.
8. Resuspender las células de prueba en medio fresco, estéril y contarlas en un hemocitómetro. Placa de un número apropiado de estas células de ensayo a la ECM estéril, aislado en coversliPD. Cultura ellos en el medio de células apropiado para 2-3 h, o para el periodo de tiempo requerido para el diseño experimental.
9. Para examinar la organización del citoesqueleto de actina, fijar las células de prueba en el 2% PFA y teñirlos con isotiocianato de fluoresceína (FITC) -phalloidin (excitación = 490 nm y emisión = 525 nm) para visualizar la actina F y con 4 ', 6 -diamidino-2-fenilindol (DAPI; excitación = 358 nm y emisión = 461 nm) para visualizar los núcleos ^11.
   NOTA: Comparar la morfología y organización de actina en las células de ensayo chapada en ECM derivado de células con células de ensayo heteróloga chapada en su propia ECM.

4. Aislamiento de ECM para SDS-PAGE, análisis de inmunotransferencia, o Proteómica

1. Se cultivan las células adherentes de interés en placas de cultivo celular de 100 mm (5 a 10 platos para la proteómica o 1-2 platos para inmunotransferencia) de 24-96 h, según sea apropiado para el tipo de célula, para permitir la secreción y la deposición de ECM.
2. Eliminar las células como described en pasos 1.1-1.5.
3. Incline cada placa en un ángulo para drenar H ₂ O residual al fondo del plato, y retirar con cuidado cualquier resto de H ₂ O con una pipeta P200 hasta que la placa esté completamente seco.
4. En paralelo, el tampón de muestra de SDS-PAGE de calor que contiene ditiotreitol 100 mM (DTT) a 95 ° C durante 2 minutos usando un bloque de calor, y luego añadirlo a la placa. 200 l de tampón de muestras por placa de 100 mm es apropiado para muestras para ser examinadas por inmunoblot.
   1. Para analizar ECM por espectrometría de masas, lograr una muestra más concentrada recogiendo el tampón de muestra de SDS-PAGE de la placa (como se describe en los pasos 4.5 y 4.6, a continuación), re-calentamiento a 95 ° C, y el uso de la misma alícuota a través 2-3 placas adicionales.
5. Use un raspador de células para raspar a fondo el ECM fuera del plato, asegurando que todas las áreas del plato han sido raspada.
6. Con el rascador de células, recoger la muestra a un lado del plato y retirarlo con un 200l punta de la pipeta en un tubo.
7. Transferencia cualquier SDS-PAGE de extracto de tampón de muestra residual de la punta de raspador de células en el tubo para reducir al mínimo la pérdida de material ECM. Para una muestra concentrada, volver a calentar la misma SDS-PAGE alícuota de tampón de muestra a 95 ° C y volver a usarlo a través de 2-3 placas adicionales.
8. Resolver las proteínas de la MEC por SDS-PAGE ^12, usando 7% o 4-7% geles de poliacrilamida en gradiente.
   NOTA: Es conveniente utilizar marcadores de proteínas pre-manchadas.
9. Para aumentar la resolución de las proteínas de la MEC de alto peso molecular, extender el tiempo de gel en funcionamiento de manera que el marcador de peso molecular 37 kDa se extiende cerca de la parte inferior del gel y marcadores de peso molecular <37 kDa han salido del gel.
10. Para el análisis proteómico de las proteínas ECM, teñir el gel con una tinción de proteínas y la captura de una imagen. Cortar bandas de interés del gel, se digieren con tripsina, y analizarlos mediante desorción por láser asistida por matriz / ionización (MALDI) espectrometría -peso ^13.
11. Alternativamente, para un análisis más exhaustivo del extracto de ECM y analizar toda la muestra, cortar el carril de gel en secciones, digerir con tripsina, y llevar a cabo la espectrometría de masa de cromatografía de líquidos (LC-MS) ^14.
12. Alternativamente, para inmunotransferencia ^15, la transferencia de proteínas desde el gel SDS-PAGE en fluoruro de membrana de polivinilideno (PVDF) a 15 V durante al menos 1 h 10 min (método semi-seco) para asegurar la transferencia de las proteínas de la MEC de alto peso molecular . Visualizar la proteína total transferida a la membrana con una mancha de Ponceau S.
13. Después de la etapa 4.11, utilizar anticuerpos para establecer la presencia y / o hacer un análisis semi-cuantitativo de proteínas ECM individuales ^15.
    1. Bloquear la membrana con 2% (w / v) de leche en TBS-Tween 20 (tampón de bloqueo) durante la noche a 4 ° C. Diluir anticuerpos específicos frente a proteínas de la MEC en tampón de bloqueo y se incuba con la membrana durante 1,5 h a temperatura ambiente (anticuerpo a fibronectin diluido 1/600 y para el anti-trombospondina 1 diluida 1/150; Que complementa el cuadro 1).
    2. Prueba de la calidad del aislamiento ECM por la re-sondeo de la misma transferencia con anticuerpos frente a proteínas intracelulares abundantes, tales como actina o tubulina (anti-actina diluyó 1 / 10.000 y anti-tubulina diluido 1 / 5.000).

Results

El protocolo descrito en los pasos 1.1-1.5 actúa para eliminar las células y dejar atrás el ECM derivado de células. El protocolo se llevó a cabo en células COS-7 cultivadas durante 96 h en cubreobjetos de vidrio, y el ECM derivado de células se analizó mediante microscopía de fluorescencia. El tratamiento con hidróxido de amonio elimina las células efectivamente, según lo establecido por la pérdida de los núcleos de las células y citoesqueleto de actina, de acuerdo con DAPI y tinción faloidina, respectivamente (Figura 1). La extracción de las células con urea 2 M no fue tan eficaz como el hidróxido de amonio; Se detectaron trazas de DAPI y phalloidin tinción después del tratamiento. 8 M urea tenía un efecto similar al de hidróxido de amonio (Figura 1). A continuación, ECM derivado de células se visualizó antes y después del tratamiento con hidróxido de amonio (pasos 2.1 a 2.11). Células COS-7 se transfectaron con una proteína fluorescente roja monomérica (mRFP)-etiquetados trímero trombospondina-1 C-terminal, (mRFPovTSP1C) ¹1 y se cultivaron en una placa de 35 mm con una base de vidrio cuadriculada.

Dos horas después de la galvanoplastia, una rejilla de cuadrados adecuada que contenían múltiples células sanas que expresan mRFPovTSP1C se visualizó en un microscopio confocal. Una imagen de contraste de fase de referencia se han tenido en esta área, y después de imágenes de fluorescencia de lapso de tiempo se llevó a cabo cada 1 min durante 2 h (Figura 2A). Las células fueron luego removidos utilizando hidróxido de amonio, y el mismo cuadro de la cuadrícula en el plato fue reubicada en virtud de contraste de fase y luego re-analizadas por microscopía de fluorescencia. Las células ya no estaban presentes en el cuadrado de la cuadrícula, pero mRFPovTSP1C se mantuvieron dentro de la ECM, que se detectó mediante microscopía de fluorescencia como característica puntos lagrimales (Figura 2A). Cualquier mRFPovTSP1C depositada en la ECM antes de la eliminación de células se identifica comparando el patrón de fluorescencia pre- y post-extracción de células. Los puntos lagrimales fluorescente identificado en ambas imágenes (Figure 2A, ejemplo flechas) se infieren para ser asociado con el ECM.

A continuación se utilizó tratamiento con hidróxido de amonio para aislar ECM nativa a partir de células cultivadas, adherentes. fibroblastos dérmicos humanos (HDF) se cultivaron en cubreobjetos de vidrio durante 96 h. Las células se retiraron usando hidróxido de amonio, y el ECM se sondeó con un anticuerpo anti-I de colágeno, lo que demuestra un fibrilar y tinción malla patrón característico ¹⁶ (Figura 2B). Patrón fibronectina se examinó, células alrededor fijos no permeabilizadas de condrosarcoma de rata (RCS) y dentro de la ECM después de la eliminación de las células RCS (Figura 2C). El aislamiento de hidróxido de amonio de ECM también se llevó a cabo en condiciones estériles para que las células de "prueba" podrían ser re-sembraron en el ECM para fenotípica o estudios funcionales. Por ejemplo, "prueba" células COS-7 se cultivaron durante 2 h en ECM estéril producida por las células RCS, ytgallina que se fijaron, se permeabilizaron y se analizaron para la organización de la actina F por tinción con FITC-faloidina, en comparación con las células COS-7 que producen su propia ECM (pasos 3.1 hasta 3.9) (Figura 3).

En una escala mayor, se utilizó el método para aislar ECM para los procedimientos bioquímicos. Por ejemplo, las células fueron cultivadas en RCS dos placas de cultivo celular de 100 mm durante 7 días, y se siguieron los procedimientos de los pasos 4.1-4.7. Las proteínas de la ECM derivado de células se recogieron por raspado de ellos en tampón de muestra de SDS-PAGE caliente y se separaron por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 7% en condiciones reductoras. Se tiñó el gel de proteínas, y las cuatro bandas principales fueron cada aisló y se analizó mediante espectrometría de masas (Figura 4A). Se identificó una serie de proteínas ECM, incluyendo fibronectina, trombospondina 1 (TSP1), trombospondina 5 / cartílago de la proteína oligomérica de matriz (TSP5 / COMP), y matrilin-1 (Figura 4B).

Alternativamente, las preparaciones de menor escala de ECM pueden ser evaluados por inmunotransferencias. Por ejemplo, ECM derivado de células a partir de células COS-7 que expresan ectópica mRFPovTSP1C se separó por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de PVDF, y probaron para RFP con un anticuerpo anti-RFP (Figura 4C). Esta técnica es lo suficientemente sensible para detectar diferencias en la deposición de entre un trímero nativo de TSP1 (mRFPovTSP1C) y un Engineered pentámero de la región TSP1 C-terminal (mRFP-TSP-5-1C) ¹⁷ (Figura 4C). Para investigar el ECM endógena de HDF, la presencia de proteínas específicas en lisado de células o el ECM aislado fue examinado por inmunotransferencia. La característica proteínas ECM fibronectina y trombospondina-1 se detectaron en el ECM, mientras que la abundancia de las proteínas intracelulares α-tubulina y β-actina estuvieron ausentes de la ECM aislado (Figura 4D).

Figura 1: Comparación de los métodos de eliminación de la célula. Células COS-7 se cultivaron a alta densidad durante 96 h en cubreobjetos, fijadas en 2% PFA, y se permeabilizaron en 0,5% de Triton X100, o se trataron como se indica para la eliminación de células. Los cubreobjetos fueron teñidas con FITC-faloidina para visualizar F-actina y DAPI para visualizar los núcleos. Barra de escala = 25 micras. Esta cifra se modificó a partir de una publicación original en el Journal of Cell Science ^11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Identificación de proteínas ECM en ECM aislada. (A) de contraste de fase y fluorescencia de imágenesCOS-7 que expresan mRFPovTSP1C y cultivadas en un plato de 35 mm con una base cuadriculada con fondo de vidrio durante 2 h. Las imágenes se muestran antes y después de la eliminación de las células por hidróxido de amonio. El borde de la carta rejilla se indica en las imágenes de contraste de fase con una línea de puntos. Las flechas blancas indican ejemplos de puntos lagrimales fluorescente que estaban presentes antes y después de la eliminación de células. (B) Detección de colágeno I en HDF ECM por inmunofluorescencia indirecta. HDF se cultivaron durante 96 h y se retira con hidróxido de amonio, y el ECM se tiñó para el colágeno fibrilar humano I. El ECM también se tiñó con anti-anticuerpo secundario de conejo conjugado con FITC solo. (C) La localización de la fibronectina alrededor de las células o dentro de RCS aislado RCS ECM, como se detecta por inmunofluorescencia indirecta. células RCS se cultivaron durante 48 h, fijadas en 2% PFA, y se tiñeron para fibronectina y con DAPI. En platos paralelos, las células se eliminaron con hidróxido de amonio 20 mM y el ECM se tiñeron para fibronectin y con DAPI. Las células también se tiñeron con anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con FITC solo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El uso de ECM estéril de Estudios funcionales. células RCS "matriz" de productores se hicieron crecer durante 48 h en cubreobjetos de vidrio y después se trataron con hidróxido de amonio 20 mM en condiciones estériles para eliminar las células. células COS-7 de "prueba" se sembraron en cubreobjetos con o sin aislado RCS ECM durante 2 h, se fijaron en 2% PFA, permeabilized en 0,5% de Triton X100, y se tiñeron con FITC-faloidina para visualizar F-actina y DAPI para visualizar los núcleos . COS-7 células cultivadas en placas de RCS ECM propagarse más ampliamente y formaron grandes haces de microfilamentos (ejemplo flechas) y gorguera bordeles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Identificación de las proteínas de ECM aislada por SDS-PAGE, espectrometría de masas, o inmunotransferencia. Se hicieron crecer células (A) RCS durante 7 días y se eliminan con hidróxido amónico 20 mM; el ECM se raspó hasta en un tampón de muestra de SDS-PAGE caliente que contiene DTT 100 mM. La preparación ECM se separó por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 7% en condiciones reductoras. Cuatro bandas significativas (flechas 1-4) fueron identificadas por tinción de proteínas. (B) Las proteínas de bandas ECM RCS 1-4 se identifican por espectrometría de masas MALDI. (C) células COS-7 que expresan bien mRFPovTSP1C (trímero) o mRFP-TSP-5-1C (pentámero) se cultivaron durante 48h y se retira con hidróxido de amonio 20 mM, y el ECM fue aislado en un tampón de muestra de SDS-PAGE caliente que contiene DTT 100 mM. La preparación ECM se separó por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 7% en condiciones reductoras, se transfirió a una membrana de PVDF, y se sondeó con un anticuerpo anti-RFP. Este panel se modifica a partir de una publicación original en Bioscience Reports ^17. (D) HDF se cultivaron durante 96 h y después se trata ya sea con ácido desoxicólico 2% en PBS (lisado celular) o con hidróxido de amonio 20 mM para eliminar las células. El ECM fue raspado en tampón de muestra SDS-PAGE caliente. Las dos fracciones se separaron por SDS-PAGE en un gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones reductoras, se transfirió a una membrana de PVDF, y se sondaron con anticuerpos, como se indica. En cada panel, las posiciones de marcadores de peso molecular se indican en kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Los pasos críticos dentro del Protocolo

El método tiene algunos pasos críticos que se deben seguir para asegurar el éxito en el aislamiento y análisis de ECM. Por ejemplo, hidróxido de amonio se utiliza para eliminar las células y para aislar ECM para su análisis. Aunque el hidróxido de amonio es estable en soluciones acuosas en la oscuridad y se puede almacenar a temperatura ambiente, las botellas deben estar bien volver a sellarse entre cada uso. Debido a que el gas puede evaporarse de la solución, lo que reduce la concentración, se recomienda encarecidamente comenzar una botella fresca cada 6-8 semanas. Además, la solución de trabajo debe hacerse recién para cada experimento. También es esencial que las células se han retirado completamente con lavados abundantes en agua desionizada. Si estos pasos no se llevan a cabo de manera adecuada, material celular puede permanecer en el plato y contaminar los análisis posteriores. Si las células se han cultivado durante 10 días o más, pueden ser necesarios lavados adicionales de agua. Es importante nota que la capa de ECM aislado es típicamente muy fina en comparación con las células ^11, por lo que es necesario tener cuidado en la identificación de la ECM durante la exploración. Para la extracción efectiva de la ECM aislado en tampón de muestra de SDS-PAGE, es esencial que el tampón de muestra contiene un agente reductor. Para la eliminación más eficaz de la ECM, debe ser utilizado hirviendo-tampón de muestra. Para los experimentos en los que las muestras de ECM serán resueltas por electroforesis SDS-PAGE para la tinción de proteínas o proteómica, es fundamental para lograr una muestra concentrada por raspado varias placas-el valor de ECM en la misma alícuota de tampón de muestra.

Modificaciones y solución de problemas

La producción y secreción de proteínas de la MEC pueden variar significativamente entre los tipos de células, por lo que los períodos de tiempo para la secreción y la deposición de ECM se deben determinar de novo para cada tipo de célula. También es importante tener en cuenta que la composición de ECM cambiará dinámicamente en relación to la densidad celular y la hora en la cultura ^18. Este factor debe ser tenido en cuenta en el diseño de experimentos. Claramente, la selección de un tipo celular para este método es importante, particularmente cuando la extracción de ECM para el análisis por espectrometría de masas, que puede requerir una cantidad sustancial de proteína total ECM.

Limitaciones de la Técnica

Las células que secretan niveles muy bajos de proteínas ECM será más difícil para su uso con este método. Las células no adherentes, cultivos de células 3D, o ensayos de la invasión de células no son adecuados en la actualidad para el aislamiento ECM por este método. El método es el más adecuado para uso con cultivos de células estándar "2-dimensionales". Debido a que la extracción de hidróxido de amonio elimina las células completamente, ECM asociada con los lados superiores de las células y se secreta, pero no reticulado, también se eliminan las proteínas ECM, dejando en el plato de una fina capa de ECM montado desde abajo y alrededor de las bases de las células ^11,17 . Es complejo para cuantificar la cantidad de ECM es liberada por la extracción de hidróxido de amonio, debido a que el material liberado también incluye proteínas ECM que son intracelulares, ya sea antes de la secreción o después de la absorción de la superficie celular.

Importancia de la Técnica en Materia de Métodos Alternativos / Existentes

La capacidad para llevar a cabo una amplia gama de experimentos con ECM aislado es importante en el contexto de la biología celular y la fisiología del tejido, y también tiene implicaciones para el campo de la regeneración de tejidos y la ingeniería de tejidos. El método tiene ventajas sobre los geles formados a partir de colágenos purificados u otras proteínas ECM purificada en que las células se reúnen estructuras ECM complejas en su tamaño nativo, con los mecanismos de reticulación nativas y con las proteínas ECM individuales presentes en proporciones apropiadas para el tipo de célula de origen. Por ejemplo, el estudio proteómico de RCS ECM demostró abundantes matrilins y COMP / TSP5, como se esperaba paraun ECM cartilaginoso ^19,20 (Figura 4). En general, el análisis de ECM derivado de las células se ve obstaculizada por su naturaleza como una extensa red, multi-proteína que da lugar a la reticulación covalente y la insolubilidad de muchas proteínas ECM, y también por la posible contaminación de ECM extrae con proteínas intracelulares. Un procedimiento de múltiples etapas diseñado para aislar la fracción ECM de los tejidos para el análisis proteómico produjo 8% de proteínas ECM en el conjunto total de proteínas identificadas ^21. Sin embargo, los péptidos de proteínas ECM eran 73% de los péptidos totales identificados. Este método para el aislamiento y análisis de ECM derivado de células elimina rápidamente y de forma fiable material celular mientras que conserva las proteínas ECM. Este método se puede utilizar para una amplia gama de tipos de células y las aplicaciones posteriores y facilita el análisis de la biología ECM y célula-ECM interacciones en cultivo celular. Nuestros protocolos de detalle cómo el método puede ser aplicado a diferentes escalas para hacer frente a una amplia gama de exppreguntas erimental con respecto a la organización ECM, la dinámica, o la composición, y a los efectos funcionales de ECM aislado en las células.

Las aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica

De cara al futuro, el método podría ser adaptado para su uso con cultivos de células en 3D; esto podría ampliar su relevancia fisiológica. Tejido nativo descelularizado tiene un gran potencial como un andamio para la regeneración de tejido perdido o dañado, y como alternativa al trasplante, como después de la insuficiencia cardíaca ^22. Tiene el potencial de superar los problemas de disponibilidad de donantes y immunorejection. Las futuras aplicaciones del método descrito en este informe podrían investigar su uso con cultivos de células en 3D o descelularización tejido, lo que aumentaría aún más el alcance de este enfoque.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticuerpo contra COL1A1	Novus	NB600-408	Conejo policlonal. Reacciona con otros colágenos fibrilares así como con el colágeno I. IF: 1/200
Anticuerpo contra fibronectina	Sigma	F3648	Conejo policlonal. WB: 1/600 durante 1,5 h. SI: 1/200
Anticuerpo contra trombospondina 1	ThermoFisher	MA5-13398	Clon monoclonal de ratón A6.1. WB: 1/150 durante 1,5 h
Anticuerpo contra RFP	Abcam	ab62341	Conejo policlonal. WB: 1/2.000 durante 2 h
Anticuerpos contra β-actina	Sigma	A1978	clon monoclonal de ratón AC-15. WB: 1/10.000 durante 1,5 h
Anticuerpo contra &alfa;-tubulina	Sigma	T9026	clon monoclonal de ratón DM1A. WB: 1/5.000 para 1,5 h
Cell Tracker Green	ThermoFisher	C2925	Marcador de células fluorescentes. Uso en 1 µ M para 30 min
Isotiocianato de fluoresceína (FITC)-Faloidina	Sigma	P-5282	Stock = 50 mg/mL en DMSO. 1/50 durante 45 min
Sigma	F8771	cabra conjugada con FITC	SI: 1/50 durante 1 h
IgG anticonejo de oveja conjugada con FITC	SIgma	F7512	IF: 1/50 durante 1 h
Peroxidasa de rábano picante (HRP)-conjugada de cabra anti-ratón IgG	LI-COR	926-80010	WB: 1/50.000 para 1 h
IgG ANTI-CONEJO de cabra conjugada con HRP	Li-Cor	926-80011	WB: 1/100.000 para 1 h
Medio de montaje Vectorshield con DAPI	Vector	H-1200	Almacenar a 4 & grados; C en la oscuridad
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma	D6429	Calentar antes de usar
Medio de crecimiento de fibroblastos	PromoCell	C-23010	Calentar antes de usar, complementar con 50 µ g/mL de ácido ascórbico
Fenol sin rojo DMEM	ThermoFisher	21063-029	Calentar antes de usar
Solución de tripsina-EDTA	Sigma	T3924	Calentar antes
de usar Plato cuadriculado con fondo de vidrio	MatTek	P35G-2-14-C-GRID
NH4OH, solución al 28-30%	Sigma	221228	Diluido a 20 mM en agua desionizada. Una vez abierto, la tienda está a oscuras, bien tapada.
Paraformaldehído, solución al 16%	Alfa Aesar	43368	Diluido al 2% (v/v) en PBS
Ácido desoxicólico	Sigma	D2510	Uso a una concentración final del 2% (v/v)
Triton X-100	Sigma	T8787	Diluir a una concentración final del 0,5% (v/v)
Reactivo para tinciones GelCode Blue	ThermoFisher	24590	Tinción de proteínas para geles SDS-PAGE
Patrones de proteínas Precision Plus	Biorad	161-0374 Patrones de	proteínas para geles SDS-PAGE
Trans-Blot SD Semi Célula de transferencia	Biorad	1703940	Transferencia eficiente de proteínas de alto peso molecular
Membrana de transferencia de PVDF	Millipore	ISEQ00010	Immobilon-PSQ
Ponceau S stain	Sigma	P7170	Tinción de proteínas reversible para membrana de PVDF
WesternSure Sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL)	LI-COR	926-80200
Película de quimioluminiscencia de alto rendimiento	GE Healthcare	28906837
Unidad de filtración estéril, MILLEX-GV	Millipore	ML481051
SP8 Escaneo láser confocal AOBS microscopio	Leica		Cámara ambiental necesaria para el control de la temperatura y el CO2 (Life Imaging Services)
Key: IF, Inmunofluorescencia; WB, Western Blot