Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 - 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.
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Artículo de método
Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos
En este artículo
Resumen
Resumen
Con este método, cryosections consecutivas se recogen para permitir que las aplicaciones de microscopía para histología de tejido y el enriquecimiento de ARN para la expresión de genes utilizando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. Por lo general, es difícil lograr una homogeneización adecuada de pequeñas muestras de músculo esquelético debido a los volúmenes de tampón puede ser demasiado baja para aplicaciones de molienda eficiente, pero sin la suficiente alteración mecánica, la arquitectura del tejido denso de los límites del músculo penetración de los reactivos de amortiguamiento, en última instancia, causando bajo rendimiento de ARN. Siguiendo el protocolo informado aquí, 30 micras secciones se recogen y se agruparon permitiendo cryosectioning y posterior homogeneización aguja para interrumpir mecánicamente el músculo, aumentar el área de superficie expuesta para la penetración buffer. Las limitaciones principales de la técnica son que requiere un criostato, y es relativamente bajo rendimiento. Sin embargo, el ARN de alta calidad puede obtenerse a partir de pequeñas muestras de m agrupadocryosections uscle, haciendo de este método accesible para muchas diferentes músculos esqueléticos y otros tejidos. Análisis Además, esta técnica permite adaptado (por ejemplo, la histopatología de tejidos y la expresión de genes) de las regiones adyacentes de un solo músculo esquelético de modo que las mediciones se pueden comparar directamente entre aplicaciones para reducir la incertidumbre experimental y para reducir los experimentos con animales replicativos necesario a la fuente de un pequeño tejido para múltiples aplicaciones.
Introducción
El objetivo de esta técnica es hacer múltiples análisis experimentales por diferentes modalidades, como la histología y la expresión génica, accesible desde un solo pequeño tejido fuente músculo esquelético. aplicaciones de microscopía son los más sensibles a la muestra métodos de conservación, que deben ser controladas cuidadosamente para limitar la formación de artefactos de cristales de hielo durante la criopreservación. Por lo tanto, el desarrollo del método se basa en el tibial anterior (TA) de músculo congelado parcialmente cubierta con incrustación de resina en un baño de 2-metilbutano enfriado con nitrógeno líquido -140 ° C como el material de origen tanto pa....
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Protocolo
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Georgia Institucional Cuidado de Animales y el empleo en condiciones de uso de animales protocolo A2013 07-016 (Beedle).
1. La criopreservación del músculo esquelético no fijado
- Preparación
- Cortar el corcho en cuadrados pequeños (aproximadamente 1 cm x 1 cm) con una hoja de afeitar, escriba en el corcho con un marcador de punta fina que es resistente a 2-metilbutano para identificar el ratón fuente y el músculo, y haga un corte poco profundo (aproximadamente 1 mm) a través de la superficie superior. Inserte un cubreobjetos de plástico en el corte de utilizar para orie....
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Resultados
RNA cryosection muscular es de alta calidad y proporciona un rendimiento suficiente para la mayoría de aplicaciones
Los análisis de dieciséis preparaciones de ARN de músculo esquelético se muestran en la Tabla 1 usando 19,4 a 41 mg de músculo agrupada tibial anterior (TA) a partir de 8 ratones de control. Tanto la izquierda (L) y derecho músculos (R) TA se prepararon en los experimentos de regeneración con los mú.......
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Discusión
Para lograr los mejores resultados con este método, mantenga la resina de inclusión restringida al tercio inferior o la mitad del músculo durante la criopreservación de tejidos porque el exceso de resina ralentizará la recolección de las criosecciones agrupadas y puede aumentar la contaminación de la resina de inclusión en el aislamiento de ARN. Además, es importante prestar especial atención durante la homogeneización de la aguja para maximizar el rendimiento y minimizar la probabilidad de obstruir la aguja. El protocol.......
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Divulgaciones
La autora declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre y Junna Luan proporcionaron asistencia técnica. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel de los Institutos Nacionales de Salud bajo el premio número AR065077. El contenido es responsabilidad exclusiva del autor y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Corcho | VWR Scientific | 23420-708 | Cortar en cuadrados pequeños con una cuchilla afilada. |
| Funda de plástico | Fisher Scientific | 12-547 | Se utiliza para orientar el músculo durante la congelación. |
| Termómetro de baja temperatura | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-metilbutano | Sigma | M32631-4L | Precaución: producto químico peligroso. Almacenar en un armario inflamable. |
| Resina de inclusión: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific 6769006 | Otras resinas de inclusión pueden sustituirse por cryomatrix. | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 con portacuchillas desechable | Cualquier criostato que funcione debería ser suficiente para el protocolo. |
| Cuchilla de criostato desechable Thermo | Fisher Scientific | 3052835 | Utilice una cuchilla o cuchillo adecuado para el criostato que se va a utilizar. |
| Solución de descontaminación de ARNasa: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Balanza analítica | Mettler Toledo | XS64 | |
| Pincel | Daler Rowney | 214900920 | Úselo para manipular criosecciones. Se puede encontrar en tiendas con materiales de arte simples. |
| Hoja de afeitar | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Portaobjetos de microscopio | VWR Scientific | 48311600 | |
| reactivo de extracción orgánica de ARN: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Atención: TRIzol es un producto químico peligroso. Nota: Solo se recomiendan reactivos de extracción orgánicos para la extracción de ARN del músculo esquelético. |
| aguja de calibre 18 | VWR Scientific | BD305185 | |
| aguja de calibre 22 | VWR Scientific | BD305155 | |
| aguja de calibre 26 | VWR Scientific | BD305115 | Opcional. Se puede utilizar para una tercera ronda de trituración de muestras en el protocolo de extracción de ARN. |
| Jeringa de 1 ml | VWR Scientific | BD309659 | Para muestras de muy alto valor, se recomienda una jeringa Luer-Lok (p. ej., VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-cloopentano (BCP) | Sigma | B9673 | |
| Para etanol al 70% en agua DPC: alcohol de 200 grados | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mezcle 35 ml de alcohol de 200 grados + 15 ml de agua DEPC. |
| Para etanol al 70% en agua DEPC: Agua tratada con DEPC | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml de alcohol de 200 grados + 15 ml de agua DEPC. |
| Kit de purificación de ARN: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Pasos finales de la preparación del ARN. |
| Agua libre de DNasa/Rnasa | También se puede utilizar agua tratada con DEPC | Gibco | 10977 |
| Espectrofotómetro: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Trate el ARN purificado para eliminar cualquier contaminación del ADN antes de las aplicaciones posteriores. |
| Bolígrafo hidrofóbico | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| PBS de Dulbecco | Gibco | 14190 | PBS para protocolo de inmunofluorescencia. |
| Suero de burro | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehidrate el reflujo de suero de burro normal de acuerdo con las instrucciones del fabricante, luego diluya una alícuota al 5% para inmunofluorescencia. También se puede utilizar suero de cabra normal. |
| Anticuerpo eMHC | Universidad de Iowa Estudios del Desarrollo Banco de Hibridoma | F1.652 | |
| Anticuerpo de colágeno VI | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Burro anti-conejo AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Cabra anti-ratón IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6- diamidino-2-fenilindol) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Medios de montaje acuosos: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Utilice únicamente medios de montaje diseñados para aplicaciones fluorescentes con propiedades antidecoloración. |
| Cubreobjetos de vidrio | VWR Scientific | 16004-314 | Uso para el montaje de portaobjetos al final del prototipo de inmunofluorescencia |
| Software de análisis de imágenes: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, o productos más avanzados | Freeware ImageJ también deberían funcionar para el conteo manual. Un software más avanzado con capacidades de segmentación puede permitir la automatización parcial del proceso; por ejemplo, , ImageProPremier. |
| Fusionar y mapear imágenes de sección: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 ha sido descontinuado. Otras opciones para la cardiotoxina son EMD Millipore #217503; Corporación Americana de Productos Químicos Personalizados # BIO0000618; o Ge Script # RP17303; Pero estos no han sido validados. |
| kit de transcripción inversa: Superscript III Sistema de síntesis de primera cadena | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Se puede utilizar cualquier reactivo de transcripción inversa validado y de alta calidad. |
| PCR estándar: Sistema de polimerasa GoTaq Flexi | Promega | M8298 | Se puede utilizar cualquier sistema de polimerasa Taq validado y de alta calidad. Si se va a utilizar la secuenciación del ADN para cualquier aplicación posterior a la PCR, se debe utilizar un sistema de PCR de alta fidelidad. |
| SYBR verde | Thermo Fisher Scientific | S7585 | Para uso en qPCR cuando no se utiliza una mezcla maestra de qPCR dedicada. Úselo con SuperROX (para instrumentos de Applied Biosystems) y GoTaq Flexi polimerasa y tampones. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX es más estable en la reacción de PCR, por lo que se prefiere su uso como colorante de referencia pasivo de qPCR sobre ROX (carboxi-X-rodamina). Para qPCR con instrumentos de Applied Biosystems |
| PCR en tiempo real | Applied Biosystems | 7900HT |
Referencias
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).
- Bartoli, M., et al.
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Reimpresiones y permisos
