Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Summary

La termoforesis a microescala (MST) es una tecnología sensible para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo. Este manuscrito describe un protocolo MST para caracterizar las interacciones aptámero-molécula pequeña.

Abstract

La caracterización de las interacciones moleculares en términos de parámetros básicos de unión como la afinidad de unión, la estequiometría y la termodinámica es un paso esencial en la ciencia básica y aplicada. La termoforesis a microescala (MST) es un método biofísico sensible para obtener esta importante información. Basándose en un efecto físico llamado termoforesis, que describe el movimiento de las moléculas a través de gradientes de temperatura, esta tecnología permite la determinación rápida y precisa de los parámetros de unión en solución y permite la libre elección de las condiciones del tampón (desde el tampón hasta los lisados/sueros). MST utiliza el hecho de que una molécula no unida muestra un movimiento termoforético diferente al de una molécula que está en complejo con un socio de unión. El movimiento termoforético se altera en el momento de la interacción molecular debido a cambios en el tamaño, la carga y la capa de hidratación. Al comparar los perfiles de movimiento de diferentes proporciones moleculares de los dos socios de unión, se puede determinar información cuantitativa como la afinidad de unión (pM a mM). Incluso las interacciones desafiantes entre moléculas de tamaños pequeños, como aptámeros y compuestos pequeños, pueden ser estudiadas por MST. Utilizando el modelo de interacción bien estudiado entre el aptámero de ADN DH25.42 y el ATP, este manuscrito proporciona un protocolo para caracterizar las interacciones entre el aptámero y las moléculas pequeñas. Este estudio demuestra que MST es altamente sensible y permite el mapeo del sitio de unión del aptámero de ADN de 7,9 kDa a la adenina del ATP.

Introduction

La interacción entre las moléculas es la base de la naturaleza. Por lo tanto, los científicos en muchos campos de la investigación básica y aplicada tratan de comprender los principios fundamentales de las interacciones moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforesis (MST) permite a los científicos para llevar a cabo la caracterización rápida, precisa y rentable, y con control de calidad de las interacciones moleculares en solución, con una libre elección de tampones. Ya hay más de 1.000 publicaciones utilizando MST, a partir de 2016 solo, que describe diferentes tipos de análisis, incluyendo proyecciones de la biblioteca, validaciones de eventos, ensayos de competición, y los experimentos de unión con múltiples parejas de unión ^1-8. En general, MST permite el estudio de los parámetros de unión clásicos, tales como la afinidad de unión (pM ​​a mM), estequiometría, y la termodinámica, de cualquier tipo de interacción molecular. Una gran ventaja de MST es la capacidad para estudiar eventos de unión independientes del tamaño de las parejas de interacción. incluso chalinteracciones lenging entre pequeños aptámeros de ácido nucleico (15-30 nt) y objetivos tales como moléculas pequeñas, fármacos, antibióticos, o metabolitos pueden ser cuantificados.

Las tecnologías actuales del estado de la técnica para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo son ya sea en laboratorio intensa y de gran complejidad o no se cuantifica aptámero-molécula pequeña Interacciones de ^9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) a base de ensayos colorimétricos ^11,12 y enfoques verdaderamente libre de marca, tales como calorimetría de titulación isotérmica (ITC) ^13-15, elución isocrática ^16, el equilibrio filtración ^17,18, el sondeo en línea ^19, de gel cambiar ensayos, stopped- flujo espectroscopía de fluorescencia ^20,21, anisotropía de fluorescencia (FA) ^22,23, de una sola molécula de fluorescencia de imagen ^24,25, y Bio-capa de interferometría (BLI) ²⁶ también son bien imprecisa o incompatible con la molécula del aptámero microcítico interacciones. otros principal problemas de estos métodos son de baja sensibilidad, alto consumo de ejemplo, la inmovilización, las limitaciones de transporte de masa en las superficies, y / o restricciones de amortiguamiento. Sólo unas pocas de estas tecnologías proporcionan controles integrados para la agregación y adsorción efectos.

MST representa una poderosa herramienta para los científicos para superar esta limitación para estudiar las interacciones entre los aptámeros y moléculas pequeñas ^27-29, así como otros objetivos, tales como proteínas ^30-33. La tecnología se basa en el movimiento de moléculas a través de gradientes de temperatura. Este movimiento dirigido, llamado "termoforesis," depende del tamaño, la carga, y la capa de hidratación de la molécula ^34,35. La unión de un ligando a la molécula alterará directamente al menos uno de estos parámetros, lo que resulta en una movilidad termoforético cambiado. Ligandos con tamaños pequeños pueden no tener un impacto considerable en términos de cambio de tamaño de la independiente al estado ligado, pero pueden tener dr Amatic efectos sobre la capa de hidratación y / o carga. Los cambios en el movimiento termoforético de moléculas después de la interacción con la pareja de unión permite la cuantificación de los parámetros de unión básicas ^{2,7,34,36,37.}

Como se muestra en la Figura 1A, el dispositivo MST consta de un láser infrarrojo enfocado sobre la muestra dentro de los capilares de vidrio utilizando la misma óptica como para la detección de fluorescencia. El movimiento termoforético de las proteínas a través de la fluorescencia intrínseca de triptófanos ⁶ o de un ^3,8 pareja de interacción marcado con fluorescencia se puede monitorizar mientras el láser se establece un gradiente de temperatura (? T de 2-6 ° C). La diferencia de temperatura resultante en el espacio,? T, conduce al agotamiento o la acumulación de moléculas en el área de temperatura elevada, que se puede cuantificar por el Soret coeficiente (S _T):

g "/>

c _caliente representa la concentración en la región calentada, y c es la concentración _{de frío} en la región en frío inicial.

Como se muestra en la Figura 1B, un típico experimento MST produce un perfil de movimiento MST (traza el tiempo), que consta de diferentes fases, que pueden separarse por sus respectivas escalas de tiempo. La fluorescencia inicial se mide en los primeros 5 s en ausencia del gradiente de temperatura para definir la fluorescencia a partir preciso y para comprobar si hay photobleaching o photoenhancement. El salto de temperatura (T-Jump) representa la fase en la que los cambios de fluorescencia antes del movimiento termoforético. Esta disminución inicial de la fluorescencia depende de cambios dependientes de calor de fluoróforo rendimiento cuántico. La fase termoforesis sigue, en el que se alcanza la disminución de fluorescencia (o aumenta) debido al movimiento de las moléculas termoforético hasta la distribución en el estado estacionario.El TJump inversa y retrodifusión concomitante de moléculas fluorescentes fl se pueden observar como se indica en la figura 1B después de que el láser está apagado. Con el fin de acceder a los parámetros básicos de unión, diferentes relaciones molares de los compañeros de interacción son analizados y comparados. Típicamente, 16 relaciones diferentes se estudian en un experimento MST, mientras que la molécula visible óptico se mantiene constante y se suministra con una cantidad creciente de ligando no marcado. La interacción entre las dos parejas de unión induce cambios en la termoforesis, y así en la fluorescencia normalizada, F _norma, que se calcula de la siguiente manera:

F _caliente y _fría F representan un promedio de intensidades de fluorescencia en puntos de tiempo de fi nido de las huellas del MST. Las afinidades de unión _(Kd o valores de _EC50) se pueden calcular por curve apropiado (Figura 1C).

En general, el MST es una poderosa herramienta para estudiar las interacciones moleculares de ningún tipo. Este manuscrito ofrece un protocolo para caracterizar la interacción entre el reto pequeña molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) y el 25-nt corto ssDNA aptámero DH25.42 (7,9 kDa). En el transcurso del manuscrito, el sitio de unión del aptámero en la molécula de ATP se mapea hasta el grupo adenina del ATP.

Protocol

1. Preparación del aptámero de Trabajo de la

1. Siga las instrucciones del fabricante y se disuelve el oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la secuencia de referencia ¹⁸⁾ en agua, alcanzando una concentración final de 100 mM.
2. Preparar la solución de aptámero de trabajo diluyendo la solución madre oligonucleótido a 200 nm con tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 ₅ mM, Tween 20 al 0,01%).
3. Incubar la mezcla durante 2 min a 90 ° C, permita que la muestra se enfríe inmediatamente en hielo, y el uso de la muestra a temperatura ambiente.

2. Preparación de la serie de diluciones de ligandos

1. Para cada ligando (adenosina trifosfato (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina trifosfato (dATP), y S-adenosil metionina (SAM) ; 10 mM cada uno), preparar una diluti serie de 16 pasosen en 200 l tubos de reacción Micro.
   NOTA: La centrifugación de las poblaciones de ligando durante 5 min a 14.000 xg puede ayudar a eliminar los agregados. Bajo volumen, se recomienda a los tubos de reacción de unión bajas para evitar la adsorción de moléculas a las paredes del tubo.
2. Comienza con una concentración máxima de al menos 50 veces mayor que la afinidad estimada y reducir la concentración de ligando en un 50% en cada etapa de dilución.
   NOTA: La herramienta de búsqueda de concentración llevada a cabo en el software de control simula los datos de unión y ayuda a encontrar el rango de concentración adecuado para la serie de dilución.
3. Llenar 20 l de ligando de stock (10 mM) en el tubo 1. Añadir 10 l de tampón de unión de aptámeros en tubos de reacción micro 2-16.
4. Transferencia de 10 l de tubo 1 al tubo 2 y mezclar bien pipeteando arriba y abajo varias veces. Transferir 10 l al siguiente tubo y repetir esta dilución para los tubos restantes.
5. Descartar el exceso de 10 l del último tubo. B evitar cualquierUffer efectos de dilución. El tampón en el tubo 1 y en los tubos de 2-16 debe ser idéntica.

3. Preparación de la mezcla final de reacción

1. Preparar las reacciones de unión individuales con un volumen de 20 l (10 l de solución de trabajo de aptámero + 10 l de la dilución ligando respectivo) para minimizar los errores de pipeteado. Un volumen de sólo 4 l es su fi ciente para llenar el capilar.
2. Añadir 10 l de la solución de trabajo 200 nM de aptámero a 10 l de cada dilución ligando y mezclar adecuadamente pipeteando arriba y abajo varias veces.
3. Se incuban las muestras durante 5 min a temperatura ambiente y fi ll las muestras en tubos capilares estándar por inmersión de los capilares en la muestra. tiempos de incubación más largos pueden ser necesarios para algunas interacciones; sin embargo, 5 min es adecuada para la mayoría. Toca los capilares sólo en los lados, no en la parte media, donde se toma la medición óptica.
4. Colocar los capilares a la sabandeja de correo capilar e iniciar el dispositivo MST.

4. Puesta en marcha del dispositivo MST

NOTA: El dispositivo ofrece dos paquetes de software pre-instalado, el "software para la configuración técnica de las condiciones experimentales y el control '' análisis" 'software para la interpretación de los datos producidos.

1. Antes de colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST, inicie el software de control y ajuste la temperatura global deseada seleccionando '' permitir el control manual de temperatura "en el '' control de la temperatura" menú desplegable. Ajustar la temperatura a 25 ° C de esta manera.
   NOTA: Los instrumentos MST pueden ser de temperatura controlada 22 a 45 ° C.
2. Espere a que la temperatura alcance el nivel esperado y luego colocar la bandeja capilar en el dispositivo MST.
3. Ajuste el canal de LED para '' roja "para los colorantes Cy5 y ajustar la potencia de LED para obtener una fl uorescence señal de 300 a 1000 unidades de fluorescencia en el dispositivo MST con un sensor estándar. de energía del LED 25% se utiliza en este estudio.
   NOTA: Se recomienda a entre 6.000 y 18.000 unidades de fluorescencia para el MST con un sensor de alta sensibilidad.

5. capilar Scan

1. Realizar un análisis capilar para comprobar aspectos diferentes de calidad de la muestra por la elección de la posición capilar sobre el software de "control" y hacer clic en "iniciar la exploración de tope" antes de iniciar la medición MST.
2. Inspeccionar el análisis capilar para la mejora de la fluorescencia / temple y efectos que se pegan (en forma de U o aplanado picos) en el software.
   NOTA: Más detalles sobre la detección y manejo de fluorescencia y se pegan efectos se pueden encontrar en la discusión.

6. Medición MST

NOTA: Antes de iniciar la medición MST, asegúrese de excluir a pegarse efectos, el realce / efectos de temple, olos errores de pipeteo, y asegurar que la exploración capilar indica que la señal de fluorescencia es su fi ciente. Para más detalles, véase la discusión.

1. Asignar las concentraciones de ligando de la serie de diluciones a la posición respectiva en el capilar software '' de control de "Considere la etapa de dilución de la mezcla del aptámero y el ligando. (1: 1).
2. Introduce la mayor concentración de ligando (5 mM) durante capilar # 1, seleccione el tipo de dilución correcta (en este caso, 1: 1), haga clic en la concentración máxima, y ​​utilizar la función de arrastrar para asignar automáticamente las concentraciones restantes en los capilares # 2- dieciséis. La concentración más baja es de 152,6 nm.
3. Introduzca la concentración del aptámero fluorescente fl (aquí, 100 nM) en la sección respectiva del software de control.
4. Utilice la configuración predeterminada, que detectan la fluorescencia durante 5 segundos, el MST grabar durante 30 segundos, y registrar la fluorescencia de 5 segundos más después de la inactivación del láser t o controlar la difusión posterior de las moléculas.
5. Ajustar la potencia del láser a 20% en la sección respectiva del software de control.
   NOTA: Para poder recibir la mejor relación señal-ruido y para evitar efectos no específicos, se recomienda una potencia de láser de 20-40%. En casos específicos, una mayor potencia del láser puede ser necesaria para obtener una buena separación de las moléculas no unidas y unidos.
6. Guarde el experimento después de seleccionar la carpeta de destino y comenzar la medición MST pulsando el botón '' Iniciar la medición MST ".
   NOTA: El archivo .ntp se generará en la carpeta de destino. Con esta instalación, una medición tiene una duración de 10-15 minutos.
7. Repetir el procedimiento experimental al menos dos veces para una determinación más precisa del valor CE _50.
   NOTA: Con el fin de probar la reproducibilidad técnica, los mismos capilares se pueden escanear varias veces (repeticiones técnicas).

7. Análisis de datos MST

nt "> NOTA: El software de análisis permite el análisis de los datos de la mosca durante la medición El software de análisis de traza las huellas del tiempo del MST y los cambios en la normalizado de fluorescencia _(norma F) frente a la concentración de ligando ^37..

1. Iniciar el software de análisis de MST (Análisis MO.Affinity) y cargar el archivo .ntp de la carpeta de destino. Seleccione "MST" como el tipo de análisis en el menú de selección de datos.
   NOTA: En caso de efectos de fluorescencia dependientes de ligando, la fluorescencia inicial se puede elegir para su análisis.
2. Añadir la respectiva carrera (s) técnica o biológica a un nuevo análisis de arrastrar y soltar o presionando el botón "+" por debajo de la respectiva prueba experimental.
3. Presione el botón de información por debajo de la respectiva prueba experimental para obtener información sobre las propiedades del experimento, los rastros del MST, escaneo capilar, forma capilar, fluorescencia inicial y la tasa de blanqueo.
   Nota: Estos datos en bruto puede colpor lo que ser inspeccionados en las etapas posteriores del análisis.
4. una inspección visual de los restos del MST para la agregación y precipitación efectos visibles, como golpes y picos.
   NOTA: Para obtener más información sobre la detección y manejo de los efectos de agregación, leer la discusión.
5. Inspeccione visualmente el análisis capilar y la superposición de forma capilar para efectos de adsorción, visible como picos aplanados o en forma de U. Inspeccione visualmente el análisis capilar y la fluorescencia inicial para efectos de fluorescencia. una inspección visual de la tasa de blanqueo para efectos photobleaching.
6. Cambiar al modo dosis-respuesta y cambiar la configuración de análisis para el modo "experto" pulsando el botón correspondiente. Seleccionar "T-Jump", como la estrategia de evaluación del MST.
7. Seleccione el modelo de "Colina" para la curva fi tting. se calculará automáticamente los parámetros de unión. Normalizar los datos mediante la elección del tipo respectivo de la normalización en el menú de "comparación de resultados". exportar eldatos, ya sea como un archivo .xls o .pdf.
   NOTA: La tabla debajo del gráfico de unión se resumen los parámetros de unión calculados.

Results

En este estudio, se aplicó MST para caracterizar el sitio de unión del aptámero de ADN DH25.42 ¹⁸ en ATP. En contraste con otros estudios que caracterizan la interacción de ATP o ATP que imitan moléculas pequeñas con proteínas marcadas aleatoriamente con uno o más fluoróforos ^38-40, este estudio incluye una versión etiquetada del aptámero 7,9 kDa ssDNA con una molécula de Cy5 en el extremo 5 ' . Diferentes derivados de ATP y moléculas relacionadas, todas diferentes ...

Discussion

Los controles de calidad:

adherencia inespecífica / adsorción de material de muestra a las superficies, así como los efectos de agregación, tiene una influencia dramática en la calidad de los datos de afinidad. Sin embargo, sólo unas pocas tecnologías de última generación ofrecen opciones precisos y rápidos para controlar y evitar estos efectos. MST ofrece controles de calidad integrados que detectan y ayudan a superar estos problemas, lo que permite la optimización paso a paso de la configurac...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tampón de unión a aptámeros			20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20
Aptámero ATP marcado con fluorescencia	IDT, Lovaina, Bélgica		secuencia: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Alemania	A2383	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & grados; C
ADP	Sigma Aldrich, Alemania	A2754	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
AMP	Sigma Aldrich, Alemania	A2252	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
Adenine	Sigma Aldrich, Alemania	A8626	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 ° C
SAM	Sigma Aldrich, Alemania	A7007	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
dATP	Sigma Aldrich, Alemania	11934511001	10 mM de soluciones madre almacenadas a - 20 & °C C
CTP	Sigma Aldrich, Alemania	C1506	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
GTP	Sigma Aldrich, Alemania	G8877	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 &°
C Monolito NT.115	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania	MO-G008	Canal Azul/Rojo Dispositivo MST con detector estándar, Monolith NT115 pico es un dispositivo MST con detector de alta sensibilidad
Capilares Monolith NT.115 Standard	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania	MO-K002
Tubos de PCR Eppendorf	Eppendorf, Alemania	30124537
Software de control Monolith. 2.1.33, preinstalado en el dispositivo	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania
MO.análisis de afinidad v2.1.1	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software