Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Resumen

La termoforesis a microescala (MST) es una tecnología sensible para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo. Este manuscrito describe un protocolo MST para caracterizar las interacciones aptámero-molécula pequeña.

Resumen

La caracterización de las interacciones moleculares en términos de parámetros básicos de unión como la afinidad de unión, la estequiometría y la termodinámica es un paso esencial en la ciencia básica y aplicada. La termoforesis a microescala (MST) es un método biofísico sensible para obtener esta importante información. Basándose en un efecto físico llamado termoforesis, que describe el movimiento de las moléculas a través de gradientes de temperatura, esta tecnología permite la determinación rápida y precisa de los parámetros de unión en solución y permite la libre elección de las condiciones del tampón (desde el tampón hasta los lisados/sueros). MST utiliza el hecho de que una molécula no unida muestra un movimiento termoforético diferente al de una molécula que está en complejo con un socio de unión. El movimiento termoforético se altera en el momento de la interacción molecular debido a cambios en el tamaño, la carga y la capa de hidratación. Al comparar los perfiles de movimiento de diferentes proporciones moleculares de los dos socios de unión, se puede determinar información cuantitativa como la afinidad de unión (pM a mM). Incluso las interacciones desafiantes entre moléculas de tamaños pequeños, como aptámeros y compuestos pequeños, pueden ser estudiadas por MST. Utilizando el modelo de interacción bien estudiado entre el aptámero de ADN DH25.42 y el ATP, este manuscrito proporciona un protocolo para caracterizar las interacciones entre el aptámero y las moléculas pequeñas. Este estudio demuestra que MST es altamente sensible y permite el mapeo del sitio de unión del aptámero de ADN de 7,9 kDa a la adenina del ATP.

Introducción

La interacción entre las moléculas es la base de la naturaleza. Por lo tanto, los científicos en muchos campos de la investigación básica y aplicada tratan de comprender los principios fundamentales de las interacciones moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforesis (MST) permite a los científicos para llevar a cabo la caracterización rápida, precisa y rentable, y con control de calidad de las interacciones moleculares en solución, con una libre elección de tampones. Ya hay más de 1.000 publicaciones utilizando MST, a partir de 2016 solo, que describe diferentes tipos de análisis, incluyendo proyecciones de la biblioteca, validaciones de eventos, ensayos de....

Protocolo

1. Preparación del aptámero de Trabajo de la

1. Siga las instrucciones del fabricante y se disuelve el oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, la secuencia de referencia ¹⁸⁾ en agua, alcanzando una concentración final de 100 mM.
2. Preparar la solución de aptámero de trabajo diluyendo la solución madre oligonucleótido a 200 nm con tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 ₅ mM, Tween 20 al 0,01%).
3. Incubar la mezcla durante 2 min a 90 ° C, permita que la muestra se enfríe inmediatamente en hielo, y el uso de la muestra a temperatura ambiente.

2. Preparación de la....

Resultados

En este estudio, se aplicó MST para caracterizar el sitio de unión del aptámero de ADN DH25.42 ¹⁸ en ATP. En contraste con otros estudios que caracterizan la interacción de ATP o ATP que imitan moléculas pequeñas con proteínas marcadas aleatoriamente con uno o más fluoróforos ^38-40, este estudio incluye una versión etiquetada del aptámero 7,9 kDa ssDNA con una molécula de Cy5 en el extremo 5 ' . Diferentes derivados de ATP y moléculas relacionadas, todas diferen.......

Discusión

Los controles de calidad:

adherencia inespecífica / adsorción de material de muestra a las superficies, así como los efectos de agregación, tiene una influencia dramática en la calidad de los datos de afinidad. Sin embargo, sólo unas pocas tecnologías de última generación ofrecen opciones precisos y rápidos para controlar y evitar estos efectos. MST ofrece controles de calidad integrados que detectan y ayudan a superar estos problemas, lo que permite la optimización paso a paso de la configurac.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón de unión a aptámeros			20 mM Tris pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween-20
Aptámero ATP marcado con fluorescencia	IDT, Lovaina, Bélgica		secuencia: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Alemania	A2383	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & grados; C
ADP	Sigma Aldrich, Alemania	A2754	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
AMP	Sigma Aldrich, Alemania	A2252	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
Adenine	Sigma Aldrich, Alemania	A8626	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 ° C
SAM	Sigma Aldrich, Alemania	A7007	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
dATP	Sigma Aldrich, Alemania	11934511001	10 mM de soluciones madre almacenadas a - 20 & °C C
CTP	Sigma Aldrich, Alemania	C1506	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 & deg; C
GTP	Sigma Aldrich, Alemania	G8877	Soluciones madre de 10 mM almacenadas a - 20 &°
C Monolito NT.115	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania	MO-G008	Canal Azul/Rojo Dispositivo MST con detector estándar, Monolith NT115 pico es un dispositivo MST con detector de alta sensibilidad
Capilares Monolith NT.115 Standard	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania	MO-K002
Tubos de PCR Eppendorf	Eppendorf, Alemania	30124537
Software de control Monolith. 2.1.33, preinstalado en el dispositivo	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania
MO.análisis de afinidad v2.1.1	NanoTemper Technologies, Múnich, Alemania
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software