Electroforesis Capilar La separación del anticuerpo monoclonal isoformas El uso de un capilar Neutral

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo completo de electroforesis de zona capilar para la evaluación de la heterogeneidad fisicoquímica intrínseca de los anticuerpos monoclonales como un atributo de calidad.

Resumen

Las proteínas bioterapéuticas, como los anticuerpos monoclonales (mAbs), son alternativas viables para el tratamiento de enfermedades crónico-degenerativas. La actividad biológica de estas proteínas depende de sus propiedades fisicoquímicas. Se ha descrito el uso de técnicas de alta rendimiento como la cromatografía y la electroforesis capilar para el análisis de la heterogeneidad fisicoquímica de los mAbs. Hoy en día, la técnica de electroforesis de zona capilar (CZE) constituye uno de los ensayos más resolutivos y sensibles para el análisis de biomoléculas. Además, la separación electroaccionada en CZE está gobernada por extensas propiedades de la materia y ofrece la ventaja de analizar proteínas cerca de su estado nativo. Sin embargo, la implementación exitosa de esta técnica para el análisis de rutina depende de las habilidades del analista en los pasos críticos durante la preparación de muestras y sistemas. El propósito de este tutorial es detallar los pasos para tener éxito en el análisis CZE de mAbs. Además, este protocolo se puede utilizar para el desarrollo y la mejora de las habilidades del personal involucrado en los laboratorios de química analítica de proteínas.

Introducción

Los anticuerpos monoclonales (mAb) son proteínas bioterapéuticos con creciente interés debido a su capacidad para actuar contra varias enfermedades crónicas y degenerativas ^1. Al igual que otras biomoléculas, mAbs son propensos a someterse a varias modificaciones fisicoquímicas en todas las etapas de su ciclo de vida (es decir, desde la biosíntesis en el producto final). Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a: la desamidación, glicosilación, oxidación, ciclación, isomerización, la agregación y la escisión proteolítica ^2. Por lo tanto, se necesitan técnicas analíticas capaces de resolver isoformas intrínsecas para supervisar....

Protocolo

1. Preparación de soluciones

1. Preparar la solución de BGE.
   1. Preparar 100 ml de una solución compuesta de 0,05% (m / v) de celulosa hidroxi propil metil celulosa (HPMC), 200 mM ε-amino n-caproico (EACA) y acetato de litio 30 mM.
      NOTA: Como HPMC es un polímero viscoelástico, verter el polvo en un vaso de precipitados de vidrio, añadir 80 ml de agua y, finalmente, añadir la barra de agitación. Continúe añadiendo los reactivos restantes como normalmente. Use gafas de seguridad al manipular acetato de litio, ya que puede causar irritación en los ojos.
   2. Ajustar a pH 4,8 ± 0,1 con 50% (v / v) de ácido acético. Deje que la s....

Resultados

La Figura 2 muestra el perfil de corriente eléctrica típica de un EACA 200 mM, acetato de litio 30 mM, pH 4,8 BGE con muestra de anti-TNFa mAb diluido con tampón de Tris (50 mM, pH 8,0). Como se puede observar, la corriente es estable durante todo el análisis y puede oscilar entre los valores de 30 a 35 mu. Figura 3 muestra el electroferograma CZE de una muestra en blanco en el que el pico detectado se corresponde con el patrón interno de histamina. Se e.......

Discusión

En este tutorial, destacamos la importancia de las prácticas adecuadas cuando se realizan los análisis de CZE de anticuerpos monoclonales con el fin de aumentar la probabilidad de tener éxito. Sin embargo, cuando se utiliza CZE de forma rutinaria, los problemas surgen inevitablemente ^12.

Para obtener los mejores resultados, es importante seguir las notas que se incluyeron durante todo el protocolo, ya que ayudarán al analista para superar y resolver problemas de pasos difíciles. U.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido acético glacial	Tecsiquim	AT0035-7
Ácido clorhídrico de grado ACS	J.T. Baker	9535-05
Dihidrocloruro de histamina	Fluka	53300
(Hidroxipropil) metilcelulosa	Fluka	09963
Acetato de litio	Sigma-Aldrich	517992
Ácido 6-aminocaproico	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tampón Tris, 50,0 mM,  pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus Sistema de análisis farmacéutico	Beckman Coulter	A66528
eCAP Capilar neutro	Beckman Coulter	477441
vial, micro, 200 y micro; l	Beckman Coulter	144709
Tapas de viales universales	Beckman Coulter	A62250
Viales universales	Beckman Coulter	A62251
Cable, óptica, UV/Vis	Beckman Coulter	144093
Módulo detector UV/Vis	Beckman Coulter	Kit
, en blanco	Beckman Coulter

de montaje de cartucho 144733144738