Artículo de método

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

DOI:

10.3791/55094

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17 de enero de 2017

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1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 2Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

En este artículo

Resumen

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Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.

Resumen

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Aquí presentamos un método para establecer múltiples hidrogeles de cultivo de células de componentes para el cultivo in vitro de células de pulmón en. Comenzando con sano en tejido bloque de pulmón de porcino, de rata, o un ratón, el tejido es perfundido y sumergido en detergentes químicos subsiguientes para eliminar los restos celulares. comparación histológica del tejido antes y después del procesamiento confirma la eliminación de más del 95% de la doble tinción de ADN y alfa galactosidasa hebra sugiere se elimina la mayoría de los restos celulares. Después de la descelularización, el tejido es liofilizada y después cryomilled en un polvo. El polvo de la matriz se digiere durante 48 horas en una solución de digestión con pepsina ácida y después se neutralizó para formar la solución pregel. La gelificación de la solución pregel puede ser inducida por la incubación a 37 ° C y puede ser utilizado inmediatamente después de la neutralización o se almacenaron a 4 ° C durante hasta dos semanas. Los recubrimientos se pueden formar usando la solución pregel en una placa no tratada para capego ell. Las células pueden ser suspendidas en el pregel antes de la auto-ensamblaje de lograr una cultura 3D, chapada en la superficie de un gel formado a partir de la cual las células pueden migrar a través del andamio, o chapada en los revestimientos. Las alteraciones en la estrategia presentada puede afectar la temperatura de gelificación, la fuerza o el tamaño de los fragmentos de proteínas. Más allá de la formación del hidrogel, la rigidez de hidrogel se puede incrementar utilizando genipina.

Introducción

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Trasladar los resultados in vitro a la clínica es uno de los retos más desafiantes a los que se enfrentan los investigadores biomédicos. La investigación in vitro sobre el plástico de cultivo de tejidos es más fácil, más conveniente y mantiene una alta viabilidad celular. 1 Este enfoque es un punto de partida razonable, pero los resultados tienen una traslación clínica limitada. Cada vez más, los laboratorios están incorporando construcciones tridimensionales para reemplazar los métodos bidimensionales tradicionales. Hay revisiones disponibles para muchos entornos tridimensionales, desde andamios biológicos hasta andamios poliméricos.

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Protocolo

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Solución filtro estéril Direcciones
DiH 2 O Sí DiH 2 O; estéril filtrada
Solución Triton X-100 0,1% Sí Bajo campana de humos Añadir 100 ml de Triton X-100 a 100 ml Solución DiH 2 O y agitar hasta que se disuelva;
filtro estéril.
2% desoxicolato Solution Sí Bajo campana de humos agregar 2 g de solución de desoxicolato de sodio
por 100 ml de DiH 2 ....

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Resultados

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Usando este método, hemos producido hidrogeles de cerdo normal de rata, y los pulmones de ratón (Figura 1). pulmones procesados ​​proporcionan un estimado de 5 mg, 40 mg, y 10 g de polvo de ECM respectivamente. Una visión general del proceso se muestra en la Figura 2. visualizaciones clave durante el proceso incluyen: aspecto blanco de los pulmones después de aclarar desoxicolato; después de la formación pregel, la solución debe ser opaca y la solución d.......

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Discusión

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Uno de los aspectos integrales de la biología es la auto-organización de las moléculas en estructuras jerárquicas que realizan una tarea específica. 13 En el laboratorio, el autoensamblaje depende de numerosos factores tales como la concentración de sal, pH, y la duración de digestión. Como se muestra, se forma un hidrogel de auto-organización cuando las proteínas solubilizadas vuelve a la temperatura fisiológica. El hidrogel formado es capaz de promover la unión celular y la proliferación in vitro. .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Nos gustaría dar las gracias a las granjas de Smithfield de la donación del tejido pulmonar porcino intacta. También nos gustaría agradecer al Dr. Hu Yang, el Dr. Christina Tang y el Departamento de Cirugía Plástica de VCU para permitirnos usar sus equipos. muestras de hidrogel y tejidos se prepararon para la SEM en el Departamento de Anatomía y de las instalaciones Neurobiología Microscopía VCU apoyado, en parte, por fondos del NIH NINDS Core Center de Grant 5 P30 NS047463 y, en parte, por la forma de financiación de los NIH-NCI Cancer Center Proyectos financiados P30 CA016059. SEM de imágenes de muestras en la Instalación Core Caracterización VCU Nanotecnología (NC....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tritón X-100 Fisher ScientificBP151-100Úselo en campana extractora con protección para los ojos y guantes.
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750-100gUso en capucha con protección ocular y guantes.
Sulfatode magnesio Sigma-AldrichM7506-500gNinguno
Cloruro de calcioSigma-AldrichC1016-500gNinguno
DNasaSigma-AldrichD5025-150KUNinguno
HClSigma-Aldrich258148-500MLUsar con protección ocular y guantes.
PepsinSigma-AldrichP6887-5GUso en campana extractora con protección ocular y guantes.
Hidróxido de sodioFisher ScientificBP359-500Úselo con protección para los ojos y guantes.
GenipinWako Chemicals078-03021Uso en campana extractora con protección ocular y guantes.
PBS 10xCalidad Biológico119-069-151Ninguno
PBSVWR45000-448Ninguno
Papel de filtroWhatman8519N/
A Bomba manualFisher Scientific10-239-1N/A
Vaso de precipitados para graduadosVitLab445941N/A
CryomillSPEX6700Uso criogénicos y ojo protección.
Guantes LiofilizadorFTS FlexiDryUse.
ReómetroDiscoveryHR-2Utilice guantes y protección para los ojos.

Referencias

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  1. Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
  2. Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
  3. Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture pro....

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Etiquetas

Formaci n de hidrogelest cnica de descelularizaci ncultivo celular 3Ddigesti n con pepsinareticulaci n con genipinapruebas reol gicasensayo de adhesi n celularprotocolo de liofilizaci nproceso de criomolienda

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