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Artículo de método

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

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DOI:

10.3791/55094

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17 de enero de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 2Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

En este artículo

Resumen

Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.

Resumen

Aquí presentamos un método para establecer múltiples hidrogeles de cultivo de células de componentes para el cultivo in vitro de células de pulmón en. Comenzando con sano en tejido bloque de pulmón de porcino, de rata, o un ratón, el tejido es perfundido y sumergido en detergentes químicos subsiguientes para eliminar los restos celulares. comparación histológica del tejido antes y después del procesamiento confirma la eliminación de más del 95% de la doble tinción de ADN y alfa galactosidasa hebra sugiere se elimina la mayoría de los restos celulares. Después de la descelularización, el tejido es liofilizada y después cryomilled en un polvo. El polvo de la matriz se digiere durante 48 horas en una solución de digestión con pepsina ácida y después se neutralizó para formar la solución pregel. La gelificación de la solución pregel puede ser inducida por la incubación a 37 ° C y puede ser utilizado inmediatamente después de la neutralización o se almacenaron a 4 ° C durante hasta dos semanas. Los recubrimientos se pueden formar usando la solución pregel en una placa no tratada para capego ell. Las células pueden ser suspendidas en el pregel antes de la auto-ensamblaje de lograr una cultura 3D, chapada en la superficie de un gel formado a partir de la cual las células pueden migrar a través del andamio, o chapada en los revestimientos. Las alteraciones en la estrategia presentada puede afectar la temperatura de gelificación, la fuerza o el tamaño de los fragmentos de proteínas. Más allá de la formación del hidrogel, la rigidez de hidrogel se puede incrementar utilizando genipina.

Introducción

Trasladar los resultados in vitro a la clínica es uno de los retos más desafiantes a los que se enfrentan los investigadores biomédicos. La investigación in vitro sobre el plástico de cultivo de tejidos es más fácil, más conveniente y mantiene una alta viabilidad celular. 1 Este enfoque es un punto de partida razonable, pero los resultados tienen una traslación clínica limitada. Cada vez más, los laboratorios están incorporando construcciones tridimensionales para reemplazar los métodos bidimensionales tradicionales. Hay revisiones disponibles para muchos entornos tridimensionales, desde andamios biológicos hasta andamios poliméricos. 2,3

Los marcos biológicos pueden imitar las características de los entornos in vivo, ya que contienen muchos de los componentes proteicos y glicosaminoglicanos de la matriz nativa y proporcionan sitios de unión familiares para que las células se adhieran y reconozcan. Se ha demostrado que los materiales derivados de la matriz extracelular (MEC) son andamios capaces de adherirse y proliferar células. 4 Un desafío que limita la aplicación de las plataformas de hidrogel ECM se deriva de sus propiedades mecánicas inherentemente débiles después de la gelificación. El tejido nativo a menudo tiene propiedades mecánicas que son magnitudes superiores a las de los hidrogeles. Los agentes reticulantes no tóxicos pueden aumentar las propiedades mecánicas de los hidrogeles para imitar mejor el entorno del tejido nativo. Genipin es un reticulante natural no tóxico derivado de las plantas de Gardenia con la capacidad de adaptar estrechamente las propiedades mecánicas de la ECM con cambios en la concentración de genipina5,6.

Casi todas las células del cuerpo existen y se organizan en la MEC que producen o mantienen. Un nuevo enfoque en la importancia universal de la MEC en la organización, condición y función de cada órgano o sistema ha provocado la producción de plataformas basadas en matrices para la investigación in vitro. La submucosa del intestino delgado porcino es el andamio de origen natural más estudiado, y se ha utilizado para regenerar tendones, ligamentos, músculo esquelético4 e incluso hueso7. Las matrices de otros órganos y especies donantes también han demostrado un buen potencial de regeneración de tejidos. El uso de componentes extraños de la MEC causa problemas mínimos con la inmunomodulación. Después de la eliminación de la materia celular del huésped, el MEC restante será similar en contenido de aminoácidos y organización a todas las demás especies de mamíferos8. Existe una creciente línea de pensamiento de que la mejor manera de examinar las interacciones entre la célula y la MEC in vitro es utilizar andamios de MEC específicos de órganos. Cada órgano proporciona una composición única de proteínas y proteoglicanos para crear nichos celulares. Los nichos proporcionan la descomposición estructural, funcional e incluso enzimática de la matriz extracelular que contribuye a la señalización biofísica. Para lograr un microambiente in vitro más similar al microambiente in vivo, el uso de ECM específica de tejido optimizaría los nichos celulares para la investigación.

El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para establecer un andamio de hidrogel único para la MEC pulmonar. Este método proporciona una plataforma para la investigación in vitro sobre las interacciones entre las células pulmonares y la MEC.

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Protocolo

Solución filtro estéril Direcciones
DiH 2 O Sí DiH 2 O; estéril filtrada
Solución Triton X-100 0,1% Sí Bajo campana de humos Añadir 100 ml de Triton X-100 a 100 ml Solución DiH 2 O y agitar hasta que se disuelva;
filtro estéril.
2% desoxicolato Solution Sí Bajo campana de humos agregar 2 g de solución de desoxicolato de sodio
por 100 ml de DiH 2 O y agitar hasta que se disuelva; filtro estéril
1 M NaCl Sí Añadir 58.44 g de NaCl a 1 L de DiH 2 O; agitar hasta que se disuelva;
filtro estéril
solución de DNasa Sí Añadir 12.000unidades de DNasa a 1 L DiH 2 O; Añadir 0,156 g MgSO4
(Anhidro), y 0,222 g de CaCl 2; agitar hasta que se disuelva; filtro estéril
PBS Sí Combinar 27,2 g de Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (dibásico heptahidratado),
80 g de NaCl, y 2 g de KCl con 10 L DiH 2 O; agitar hasta que se disuelva; ajustar el pH a 7,4; filtro estéril

Tabla 1: Soluciones requeridos para la descelularización de tejidos. Hacer las soluciones anteriores para el proceso de descelularización. Almacenar a 4 ° C. Aproximadamente se necesitará 2,5 L de un pulmón porcino.

1. Formación de hidrogel

  1. Porcino de pulmón descelularización (adaptado de referencias 9,10)
    1. Obtener, un cuarto bloque de pulmón porcino normal de un matadero, con el corazón y Vasculature intacto.
    2. Con unas tijeras de tejido o un bisturí para diseccionar el corazón, vasculatura lo más cerca posible al corazón de corte, vasculatura restante se utilizó en pasos posteriores para perfusión.
    3. diseccionar cuidadosamente el tejido conectivo que rodea la tráquea, los bronquios, y la vasculatura utilizando un escalpelo o tijeras.
      NOTA: Determinar el mejor de pulmón a utilizar para el resto del procedimiento por la elección de un pulmón y sin grandes heridas o perforaciones a través de la pleura y grandes cantidades de atelectasia o la oclusión vascular que pueden impedir la eficacia del proceso de descelularización.
    4. Cortar el pulmón subóptima deja la mayor parte del bronquio unidos a la tráquea como sea posible (corazón, tejido conectivo y los lóbulos del pulmón eliminado podrán ser eliminados). Debe haber un pulmón que permanezcan unidas a la tráquea y la vasculatura.
      NOTA: Conservar secciones para histología si se desea. 9
    5. Cierre bronquios desconectados con abrazaderas o sutura a prevenir el exceso de flujo de retorno.
    1. Preparar las soluciones descelularización y refrigerar a 4 ° C hasta que se necesite (Tabla 1).
    2. El uso de una bomba de mano canulado para ajustarse a la arteria pulmonar, la perfusión del tejido pulmonar 3 veces con agua DI a través tanto de la arteria pulmonar y la tráquea. Perfundir vasculatura primera cada vez. Comienza con alrededor de 1 L en la vasculatura y 1,5 L en la tráquea para cada perfusión, pero como se elimina los desechos celulares más líquido puede ser perfundido a través del sistema.
    3. Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de Triton X-100.
    4. Sumergir el tejido pulmonar en una solución de Triton X-100 durante 24 horas a 4 ° C.
    5. Perfuse vasculatura y tráquea 3 veces con agua DI para enjuagar.
    6. Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de desoxicolato.
    7. Sumergir las secciones de tejido en desoxicolato durante 24 horas a 4 ° C.
    8. Perfuse vasculatura y tráquea 3 veces con agua DI para enjuagar.
    9. Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de NaCl.
    10. Sumergir el tejido en solución de NaCl se filtró durante 1 hora a 4 ° C.
    11. Perfuse vasculatura y tráquea 3 veces con agua DI para enjuagar.
    12. Perfundir tanto vasculatura y la tráquea con una solución de DNasa.
    13. Sumergir el tejido en solución filtrada DNasa durante 1 hora a 4 ° C.
    14. Perfundir tanto vasculatura y la tráquea 5 veces con PBS.
    15. Diseccionar tejido cartilaginoso notable, tráquea y todo túbulos 2 mm o más de diámetro (que se encuentra principalmente en torno a la hilio y porciones mediales de los pulmones) de la realización de las vías respiratorias, dejando sólo las zonas respiratorias (principalmente las zonas periféricas).
    16. Diseccionar el tejido en secciones de 1 pulgada o más pequeños. Orientación del tejido no importa para este paso.
    17. Retirar el exceso de tejido líquido y colocar en tubos de 50 ml cónicos. Congelar el tejido a -80 ° C.
      NOTA: Conservar secciones de histología para asegurar la eliminación de las células y debri celulars, si se desea. Utilizamos H & E, α-galactosidasa, PicoGreen, hidroxiprolina, ninhidrina, Alcian azul, SDS-PAGE y espectrometría de masas para caracterizar. 9
  2. Procesamiento de pulmón
    1. Retire las tapas de los tubos congelados que contienen tejido pulmonar descelularizado.
    2. Coloque papel de filtro sobre la abertura del tubo y asegurar con banda de goma.
      NOTA: El tubo y el contenido todavía se deben congelar cualquier otra manera ponga en -80 ° C hasta que se congele.
    3. Liofilizar el tejido hasta que todo el exceso de líquido se ha ido, utilizando un secador de congelación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacenar a -80 ° C hasta el momento de molino.
    4. Antes de comenzar añadir nitrógeno líquido para molino congelador para enfriar el aislamiento y los componentes internos de las condiciones de trabajo.
    5. Retire la barra magnética molino de tubo de molino y agregar el tejido para cubrir el fondo.
    6. Cambie la barra de molino y agregar el tejido sin apretar. La barra de molino todavía debe moverse libremente.
    7. Cerrar el tubo molino y place en el molino congelador.
    8. Llenar nitrógeno líquido para línea de llenado máximo.
    9. Molino Congelador todo el tejido en polvo fino (aproximadamente 5 min, la tasa de impactación de ~ 600 min -1), en un cilindro de policarbonato con un impactador de acero inoxidable, así como tapones de extremo de acero inoxidable utilizando el molino congelador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su uso.
  3. Micro-porosa formación de gel (8 mg / ml) (adaptado de referencias 9,11)
    1. Añadir 1% (w / v) del polvo descelularizado y 0,1% (w / v) de pepsina a M HCl 0,01, con agitación constante (debe ser capaz de ver el flujo en el nivel superior de líquido), a temperatura ambiente, durante 48 hr.
      NOTA: El polvo se carga estáticamente, por lo que añadir el HCl después el polvo produce la oportunidad para lavar el exceso de las paredes del tubo.
    2. Después de la digestión durante 48 h, colocar la solución y los reactivos en hielo durante 5 min.
    3. Usando refrigerado 10% (v / v) de NaOH 0,1 M, unad 11.11% (v / v) 10x PBS (para llevar la solución entera a 1x concentración), llevar la solución de proteína digerida a pH fisiológico de 7,4.
      NOTA: La solución ahora se puede almacenar a 4 ° C durante un máximo de una semana. Realizar una cinética de gelificación utilizando reometría 9 si se desea.

2. El entrecruzamiento hidrogeles para mejorar la resistencia mecánica

  1. Las soluciones de 1%, 0,1% y 0,01% w / v solución genipina reticulación se prepararon disolviendo la cantidad necesaria de polvo de genipina en 10% de DMSO.
  2. Vortex la solución cada 15 min durante 1 hora.
  3. Añadir solución genipina para cubrir hidrogeles ECM (100 l por cada pocillo de una placa de 96 pocillos) que han sido previamente montados en parte 1.3.4.
  4. Dejar a cada hidrogel ECM para reticular durante 24 horas a 37 ° C.
  5. Enjuague el hidrogel ECM 3 veces con PBS hasta que la solución de lavado ya no es de color azul. Los hidrogeles reticulados serán entonces listo para su posterior caracterización y ceestudios de cultivo ll.

3. cultivo celular con microporosa Gel

  1. Recubrimiento de dos dimensiones
    1. Usando la solución de 1.3.3, añadir 20 l de solución de pregel a cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 96 pocillos no tratados.
    2. refrigere durante la noche a 4 ° C para permitir la adsorción de proteínas a la placa.
    3. Aspirar solución pregel y enjuague con PBS.
    4. Células pasantes 9.
    5. Añadir 10.000 células / cm 2 a los pocillos.
    6. Aumentar los medios de comunicación a 100 l por pocillo y se incuba a 37 ° C.
  2. Tres de cultivo celular dimensional 9
    1. Utilizando la solución de 1.3.3, resuspender las células sedimentadas a una concentración de 1.000.000 células / ml de solución pregel.
    2. dispensar rápidamente 16 l de suspensión de células pregel en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, para formar un hidrogel de espesor ~ 500 micras para el cultivo celular en 3D.
    3. Incubar a 37 ° C durante 30min para el gel a la forma.
    4. Añadir 100 l de medios de comunicación a la parte superior de hidrogeles formados y se incuba a 37 ° C.
  3. Tres de cultivo celular dimensional en geles de rigidez variable
    1. Utilizando la solución de 1.3.3, pipeta 100 l de solución de pregel en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
    2. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos para gel a la forma.
      Nota: El entrecruzamiento pasos de la parte 2 se puede utilizar aquí.
    3. Células pasantes 9.
    4. Añadir 10.000 células / cm 2 a los pocillos.
    5. Aumentar los medios de comunicación a 100 l por pocillo y se incuba a 37 ° C.

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Resultados

Usando este método, hemos producido hidrogeles de cerdo normal de rata, y los pulmones de ratón (Figura 1). pulmones procesados ​​proporcionan un estimado de 5 mg, 40 mg, y 10 g de polvo de ECM respectivamente. Una visión general del proceso se muestra en la Figura 2. visualizaciones clave durante el proceso incluyen: aspecto blanco de los pulmones después de aclarar desoxicolato; después de la formación pregel, la solución debe ser opaca y la solución d...

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Discusión

Uno de los aspectos integrales de la biología es la auto-organización de las moléculas en estructuras jerárquicas que realizan una tarea específica. 13 En el laboratorio, el autoensamblaje depende de numerosos factores tales como la concentración de sal, pH, y la duración de digestión. Como se muestra, se forma un hidrogel de auto-organización cuando las proteínas solubilizadas vuelve a la temperatura fisiológica. El hidrogel formado es capaz de promover la unión celular y la proliferación in vitro. ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a las granjas de Smithfield de la donación del tejido pulmonar porcino intacta. También nos gustaría agradecer al Dr. Hu Yang, el Dr. Christina Tang y el Departamento de Cirugía Plástica de VCU para permitirnos usar sus equipos. muestras de hidrogel y tejidos se prepararon para la SEM en el Departamento de Anatomía y de las instalaciones Neurobiología Microscopía VCU apoyado, en parte, por fondos del NIH NINDS Core Center de Grant 5 P30 NS047463 y, en parte, por la forma de financiación de los NIH-NCI Cancer Center Proyectos financiados P30 CA016059. SEM de imágenes de muestras en la Instalación Core Caracterización VCU Nanotecnología (NCC). Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation, CMMI 1.351.162.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tritón X-100 Fisher ScientificBP151-100Úselo en campana extractora con protección para los ojos y guantes.
Desoxicolato de sodioSigma-AldrichD6750-100gUso en capucha con protección ocular y guantes.
Sulfatode magnesio Sigma-AldrichM7506-500gNinguno
Cloruro de calcioSigma-AldrichC1016-500gNinguno
DNasaSigma-AldrichD5025-150KUNinguno
HClSigma-Aldrich258148-500MLUsar con protección ocular y guantes.
PepsinSigma-AldrichP6887-5GUso en campana extractora con protección ocular y guantes.
Hidróxido de sodioFisher ScientificBP359-500Úselo con protección para los ojos y guantes.
GenipinWako Chemicals078-03021Uso en campana extractora con protección ocular y guantes.
PBS 10xCalidad Biológico119-069-151Ninguno
PBSVWR45000-448Ninguno
Papel de filtroWhatman8519N/
A Bomba manualFisher Scientific10-239-1N/A
Vaso de precipitados para graduadosVitLab445941N/A
CryomillSPEX6700Uso criogénicos y ojo protección.
Guantes LiofilizadorFTS FlexiDryUse.
ReómetroDiscoveryHR-2Utilice guantes y protección para los ojos.

Referencias

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