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Artículo de método

La activación de la autofagia mediante ejercicio aeróbico en ratones

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DOI:

10.3791/55099

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3 de febrero de 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

En este artículo

Resumen

activación autofagia es beneficioso en la prevención de una serie de enfermedades. Uno de los enfoques fisiológicos para inducir la autofagia in vivo es el ejercicio físico. Aquí mostramos cómo activar la autofagia mediante el ejercicio aeróbico y medir los niveles de autofagia en ratones.

Resumen

La autofagia es una vía de degradación lisosomal esencial para la homeostasis, función y diferenciación celular. En condiciones de estrés, se induce la autofagia y se dirige a varias cargas, como el citosol a granel, los orgánulos dañados y las proteínas mal plegadas, para su degradación en los lisosomas. Las moléculas de nutrientes resultantes se reciclan de nuevo en el citosol para la síntesis de nuevas proteínas y la producción de ATP. La regulación positiva de la autofagia tiene efectos beneficiosos contra la patogénesis de muchas enfermedades, y se han reportado estrategias farmacológicas y fisiológicas para activar la autofagia. El ejercicio aeróbico se ha identificado recientemente como un inductor eficiente de la autofagia en múltiples órganos de ratones, incluidos los músculos, el hígado, el corazón y el cerebro. Aquí mostramos procedimientos para inducir la autofagia in vivo mediante ejercicio forzado en cinta rodante o carrera voluntaria con ruedas. También demostramos métodos microscópicos y bioquímicos para analizar cuantitativamente los niveles de autofagia en tejidos de ratón, utilizando las proteínas marcadoras LC3 y p62 que se transportan y degradan en los lisosomas junto con los autofagosomas.

Introducción

La autofagia es una vía de degradación evolutivamente conservado, que se induce en respuesta a diversas condiciones de estrés, tales como el hambre y la hipoxia 1, 2. Durante la autofagia, las vesículas de doble membrana, llamados autofagosomas, incorporan componentes subcelulares innecesarias o dañadas y los transportan hacia los lisosomas para la degradación 3. Autofagia basal es esencial para la función celular y el desarrollo organismo, y alteración de la autofagia basal está implicado en muchos trastornos, incluyendo neurodegeneración, la tumorigénesis y la diabetes 4, 5, 6 tipo 2.

El más conocido inductor de la autofagia fisiológica es el hambre. Sin embargo, tiene dos limitaciones importantes. En primer lugar, el hambre toma un largo período de inducir la autofagia con eficacia en animales, por ejemplo, 48 horas de restricción de alimentos en ratonesen la mayoría de órganos. En segundo lugar, el hambre apenas induce la autofagia cerebro, debido a un suministro de nutrientes relativamente estable en el cerebro. De hecho, también es difícil de detectar la inducción de la autofagia por inductores de molécula pequeña, como muchos fármacos no pueden pasar la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, para analizar mejor la función de activación de la autofagia en la patogénesis de enfermedades, recientemente hemos descubierto que el ejercicio es un método fisiológico más potente para inducir la autofagia en un corto período de tiempo 7, 8, 9. En comparación con el hambre, la autofagia se induce de manera efectiva mediante la ejecución de cinta de correr tan rápido como 30 minutos. Por lo tanto, el ejercicio es un enfoque fisiológico conveniente y potente para estudiar el mecanismo de la autofagia en la mediación de beneficios para la salud y la prevención de enfermedades.

Hay varios marcadores de proteínas para la detección de la actividad de la autofagia, incluyendo LC3 y p62. LC3 (proteína asociada a los microtúbulos 1A / 1B-c luzhain 3) es una proteína citosólica (LC3-I de forma) que está conjugado con PE (fosfatidiletanolamina) a la inducción de la autofagia. LC3 lipidada-PE (forma LC3-II) es reclutado en las membranas de autophagosomal y se puede utilizar para visualizar autofagosomas cuando están marcados con GFP. Su translocación desde el citosol a punctata estructuras de autofagosomas bajo microscopía es una indicación de la inducción de la autofagia. p62 es un receptor de carga para sustratos autofagia (tales como proteínas de ubiquitinación), y se incorpora en autofagosomas también. Dado que la proteína se degrada en los lisosomas, junto con autofagosomas, sus niveles se pueden utilizar para medir el flujo la autofagia. Aquí mostramos cómo utilizar estos marcadores para cuantificar la autofagia en diferentes tejidos de ratón inducidos por el ejercicio aeróbico, incluyendo ejercicio forzado (cinta) y el ejercicio voluntario (con ruedas de rodamiento). Los mismos procedimientos se pueden aplicar también a la medición in vivo de la autofagia después del tratamiento de otros inductores.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Northwestern (IACUC).

1. Los modelos de ratones

  1. Utilice los ratones 8-12 semanas de edad, en la práctica de ejercicio. Para detectar la autofagia inducida ejercido in vivo, utilizar los ratones transgénicos GFP-LC3 (C57BL / 6 antecedentes) para estudios de imagen y ratones C57BL / 6 para los análisis bioquímicos.

2. La autofagia inducida por el ejercicio

  1. Configuración cinta de correr - forzado ejercicio
    1. Aclimatarse y entrenar a los ratones en una cinta abierta hacia arriba 10 ° durante 2 días. En el día 1, ejercer los ratones durante 5 min a 8 m / min, y en el día 2, ejercer los ratones durante 5 min a 8 m / min seguido de otro 5 min a 10 m / min 10. Alentar a los ratones a correr por el codazo suave mano.
    2. En el 3er día, dejar que los ratones sometidos a una única serie de correr durante 90 minutos en el 10 ° cinta de correr cuesta arriba, starting a la velocidad de 10 m / min. Después de 40 min, aumentar la velocidad de la cinta a una velocidad de 1 m / min cada 10 min durante un total de 30 min, y luego aumentar la velocidad a la velocidad de 1 m / min cada 5 min hasta que llega a 17 m / min, para un total de 90 minutos de tiempo de ejercicio y 1.070 metros de distancia de funcionamiento.
    3. Ajuste el estímulo eléctrico a una gama de baja intensidad (1,2 Hz), y animar a los ratones a correr para evitar una descarga repetida pie.
    4. Para la recogida de tejidos, la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical inmediatamente después del ejercicio. Otros métodos de eutanasia aprobadas también se pueden utilizar, tal como CO2 o inyección IP de otros anestésicos. no parece ser afectada por el método de eutanasia El nivel de la autofagia.
  2. Configuración de rueda para correr - ejercicio voluntario
    1. Coloque una rueda del ratón-funcionamiento (11,4 cm de diámetro) dentro de una jaula con un alojados solo ratón.
    2. Comprobar la capacidad de funcionamiento utilizando un odómetro de la bicicleta.Configurar el parámetro de la rueda [distancia (en mm) por la rotación completa de la rueda] en 358 (11,4 * π). Medir la distancia recorrida después de 24 horas.
    3. Deje que el ratón funciona de manera voluntaria durante 2 semanas con la rueda de funcionamiento. Para la recogida de tejidos, sacrificar el ratón en la mañana después del período de rodaje.

3. La autofagia Evaluación Flux

  1. Para medir el flujo de autofagia en condiciones de reposo y de ejercicio, el tratamiento de ratones con el inhibidor de la autofagia cloroquina durante tres días y compararlos con los ratones tratados con PBS.
    1. Disolver la cloroquina en PBS (5 mg / ml), e inyectar la cloroquina en ratones por vía intraperitoneal a la dosis de 50 mg / kg / día durante tres días consecutivos. Sacrificar los ratones y recoger tejidos de 3 horas después de la última inyección.
    2. Para los ratones ejercidas, pretratar con cloroquina durante dos días consecutivos a una dosis de 50 mg / kg / día. En el tercer día, se inyecta a los ratones con la misma concentración de cloroquina, y después de90 min dejar correr en la cinta durante otros 90 min.
    3. La eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical. Recoger los tejidos inmediatamente después de ejecutar, de manera que el tiempo total de incubación de la cloroquina es la misma que los ratones (en reposo) de control (3 h).
      NOTA: También puede utilizar una única inyección de cloroquina para determinar el flujo de la autofagia en tejidos de ratón.

4. Tejido de cosecha y Fijación

  1. Antes de la cosecha de tejidos preparar una solución salina tamponada con fosfato (PBS) y fresco 4% de paraformaldehído (PFA, precaución: equipo de protección personal requerido) en PBS a un pH final de 7,4. Almacenar ambas soluciones a 4 ° C.
  2. Llenar la jeringa de 30 ml con 15 - 20 ml de PFA al 4% (para los ratones GFP-LC3). Conectar la jeringa con una aguja de 20 G catéter.
  3. Después del ejercicio, la eutanasia a los ratones por inhalación de isoflurano, seguido por dislocación cervical.
  4. Colocar el animal sobre una superficie de trabajo limpia en su back. Cortar y abrir la cavidad torácica por el diafragma de corte para exponer el corazón.
  5. Hacer una pequeña incisión en el hígado para permitir que la sangre salga, e inyectar un total de 15 ml 4% PFA lentamente hacia el ventrículo derecho del corazón a través del catéter, hasta que el pulmón y el hígado se vuelven completamente pálido. Perfundir el ratón inmediatamente después de la sesión de ejercicio, utilizando una bomba de jeringa con un caudal constante de 90 ml / hr.
  6. Después de la perfusión, retire la aguja y recoger tejidos de interés (por ejemplo, el cerebro y el músculo esquelético 11). Para el músculo esquelético, diseccionar el músculo vasto lateral. En pocas palabras, tirar de la piel de la pierna hacia atrás para exponer los músculos, localizar los cuádriceps femoral 12, y diseccionar vasto externo, que es el músculo externo conectado a la parte superior del hueso del fémur.
  7. Para mayor fijación y deshidratación, colocar los tejidos de ratones GFP-LC3 en PFA al 4% durante 24 horas a 4 ° C, y luego transferirlos a 15%sacarosa-PBS a 4 ° C durante la noche o hasta que los tejidos se han establecido y, a continuación, a 30% de sacarosa-PBS a 4 ° C durante la noche o para un almacenamiento más largo. Mantener las muestras en la oscuridad tanto como sea posible, ya que pueden ser sensibles a la luz intensa.
  8. Para el análisis de transferencia de Western congelamiento rápido los tejidos de ratones C57BL / 6 ratones directamente en nitrógeno líquido, y almacenar a -80 ° C.

5. Análisis de Imágenes de GFP-LC3 puntos lagrimales

  1. proceso de tejido
    1. Pre-tratamiento de los tejidos (previamente fijadas en PFA y almacenados en sacarosa al 30%) en medio de inclusión como "compuesto de la temperatura óptima de corte" (OCT) durante unos minutos en una placa de Petri etiquetada pequeña.
    2. Transferir el tejido en un criomolde marcado que contiene suficiente octubre fresca para cubrir el tejido. Oriente la superficie de seccionamiento hacia la parte inferior de la criomolde (sección transversal para el músculo vasto lateral y corte sagital de la hemi-cerebro). Evitar la formación de burbujas.
    3. Freeze las muestras colocando el criomolde durante unos minutos en un enfriador de espuma cubierto con hielo seco, hasta la OCT se vuelve blanco. Envolver las muestras individuales en láminas etiquetados, sellarlos en una bolsa de plástico, y almacenar a -80 ° C durante la noche o más.
    4. Utilice un criostato para cortar secciones de la muestra con un espesor de 10 micras, y montar las secciones en las diapositivas. Almacenar las diapositivas a -20 ° C, y mantener siempre las diapositivas lejos de la luz siempre que sea posible.
  2. preparación de los portaobjetos
    1. Retirar los portaobjetos del congelador y descongelar a temperatura ambiente. Cubrir la sección de tejido con una gota de medio de montaje con DAPI. Colocar un cubreobjetos de tamaño adecuado en la parte superior y evitar la formación de burbujas.
    2. Use esmalte de uñas para sellar los bordes del cubreobjetos, permitir que el esmalte de uñas se seque en la oscuridad a temperatura ambiente, y luego almacenar los portaobjetos en un recipiente hermético a la luz a 4 ° C, o proceder con la captura de imágenes de puntos lagrimales GFP-LC3.
  3. La cuantificación de GFP - LC3 puntos lagrimales mediante microscopía de fluorescencia
    1. Realizar microscopía de epifluorescencia, la captura de imágenes en el mismo estado (ajustes de exposición y) para todas las muestras. Para GFP, utilice una longitud de onda de emisión de 525 nm; para DAPI, utilice 490 nm. Adquirir al menos diez imágenes por muestra usando un objetivo de 60X para vasto lateral y la región de la corteza frontal del cerebro.
    2. Cuantificar el número de puntos lagrimales GFP-LC3 en un área de tejido de 2.500 m 2 en cada imagen para el análisis estadístico, ciego para los grupos experimentales. Calcular el promedio de 10 imágenes de cada muestra, utilizando la función de medición automática de "recuento de objetos". Ajustes para el músculo vasto lateral son: Umbral L = 10, H = 200; 2X liso; 1X limpia, y la configuración de la corteza frontal del cerebro son: Umbral L = 11, H = 200; 2X liso; 1X limpia.

6. Análisis Western Blot en la autofagia Marcadores

  1. proceso de Tejidos
    1. Preparar el tampón de lisis: 50 mM Tris-HCl; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% Triton X-100; inhibidor de la proteasa y el inhibidor de fosfatasa (recién añadido).
    2. Eliminar el tejido de los ratones C57BL / 6 de -80 ° C de almacenamiento. Cortar el tejido muscular en pequeños trozos con una cuchilla de afeitar antes de la siguiente proceso. Añadir 800 l (por hemi-cerebro) o de 500 l (por vasto lateral) de tampón de lisis frío a la muestra. Homogeneizar la muestra a 4 ° C con un homogeneizador a una velocidad media.
    3. lisar completamente la mezcla se homogeneizó durante otros 30 minutos a 1 hora a 4 ° C con rotación.
    4. Centrifugar el homogeneizado a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, desechar el sedimento, y recoger el sobrenadante en un nuevo tubo.
  2. análisis de la autofagia
    1. Determinar la concentración de proteína de lisados ​​de tejido utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Normalizar cada muestraa la misma concentración.
    2. Combinar la muestra con el tampón de muestra 2x Laemmli en una proporción 1: 1, hervir a 95 ° C durante 5 a 10 min, y proceder con el análisis de transferencia Western en la autofagia marcadores 13, 14, tales como p62 anticuerpo anti-p62 (, dilución 1: 500) y LC3 anticuerpo anti-LC3 (, 1: 500 dilución). Hervir las muestras inmediatamente después de la adición del tampón de muestra, como de incubación más largo en el hielo puede generar múltiples bandas degradadas de LC3.
    3. Cuantificar p62 y LC3 bandas por análisis de densitometría utilizando ImageJ, y normalizar el valor de la banda de actina correspondiente.

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Resultados

Este protocolo describe dos métodos diferentes para inducir la autofagia en tejidos de ratón de ejercicio aeróbico: un total de 90 minutos de ejercicio en una cinta rodante forzada de varios carriles precedida por dos días de aclimatación; o dos semanas de ejercicio voluntario en una rueda de funcionamiento utilizado por los ratones alojados individualmente. En cada protocolo de ejercicio, podemos medir el flujo autofagia mediante microscopía de fluorescencia y análisis de Western blot e...

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Discusión

La autofagia es un proceso catabólico que proporciona energía y reduce la citotoxicidad por la degradación lisosomal de los componentes del citoplasma o orgánulos dañados. El estudio de la autofagia es importante comprender la regulación de la homeostasis celular y los mecanismos de respuesta al estrés. Nuevos modelos y metodologías están emergiendo en el campo de investigación de 15, para estudiar cómo la autofagia alterada contribuye a numerosos procesos patológicos

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Agradecemos al Laboratorio de Histología y Fenotipado de Ratones de la Universidad Northwestern por su apoyo técnico y asistencia, y a Noboru Mizushima (Universidad de Tokio) por proporcionar ratones transgénicos GFP-LC3. A. R. y C. H. fueron apoyados por los fondos iniciales de la Universidad Northwestern y la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (DK094980).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cinta de correrColumbus Instruments150-RM Exer 3/6
Rueda de correr MouseSuper Pet100079365diámetro 11,4 cm
CuentakilómetrosBellDASHBOARD 100
Bomba de jeringaKD ScientificKDS100
Microscopio de fluorescenciaNikonModelo: microscopio invertido ECLIPSE
CryostatLeicaCM 1850UV
HomogeneizadorIKA 003737001/ Modelo: T10 Basic S1
ChloroquineCAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
ParafolmaldehyeSIGMA-ALDRICHP6148Se requiere equipo de protección personal. Este producto puede liberar gas formaldehído, una sustancia química conocida por causar cáncer.
Medios de montajeVector LaboratoriesH-1200
p62 anticuerpoBD Biosciences610833
anticuerpo LC3Novus BiologicalsNB100-2220
2x Laemmli SampleBuffer Bio-Rad Laboratories161-0737
ImageJNIH

Referencias

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