Un sistema de microfluidos con modelar superficie de Investigación de la burbuja de cavitación (s) Interacción -Cell y los Bioefectos resultante en el nivel de celda única

Summary

Se fabricó un chip microfluídico para producir pares de puntos dorados para la generación de burbujas en tándem e islas recubiertas de fibronectina para el patrón unicelular cercano. El campo de flujo resultante se caracterizó mediante velocimetría de imágenes de partículas y se empleó para estudiar varios efectos biológicos, incluida la poración de la membrana celular, la deformación de la membrana y la respuesta al calcio intracelular.

Abstract

En este manuscrito, que primero se describe el protocolo de fabricación de un chip de microfluidos, con puntos de oro y regiones recubiertas de fibronectina en el mismo sustrato de vidrio, que controla con precisión la generación de burbujas en tándem y las células individuales estampadas cerca con ubicaciones y formas bien definidas. a continuación, se demuestra la generación de burbujas en tándem mediante el uso de dos láseres pulsados ​​que ilumina un par de puntos del oro con un tiempo de retardo pocos microsegundos. Visualizamos la interacción de burbuja, la burbuja y la formación de chorro de imágenes de alta velocidad y caracterizar el campo de flujo resultante usando velocimetría de imágenes de partículas (PIV). Por último, se presentan algunas aplicaciones de esta técnica para el análisis de células individuales, incluyendo la formación de poros de la membrana celular con la absorción de macromoléculas, la deformación de la membrana localizada determinado por los desplazamientos de perlas de unión a integrinas unidas, y la respuesta del calcio intracelular a partir de imágenes radiométrica. Nuestros resultados muestran que un flujo de chorro rápido y direccional es proproducida por la interacción de burbujas en tándem, que puede imponer una tensión de corte altamente localizada en la superficie de una célula cultivada en las proximidades. Además, los diferentes efectos biológicos pueden ser inducidos por la alteración de la fuerza de la corriente de inyección ajustando la distancia de separación de la célula a las burbujas en tándem.

Introduction

Hay un creciente reconocimiento de que la heterogeneidad celular, que surge de la expresión de los genes estocástico, proteínas y metabolitos, existe dentro de una población de células grandes y sirve como un principio fundamental en la biología para permitir la adaptación celular y la evolución ^1. Por lo tanto, a menudo es imprecisa y poco fiable para utilizar mediciones a granel basados ​​en la población para comprender la función de las células individuales y sus interacciones. El desarrollo de nuevas tecnologías para el análisis de una sola célula, por tanto, de gran interés en la investigación biológica y farmacológica es, y se puede utilizar, por ejemplo, para comprender mejor las vías de señalización y procesos clave en la biología de células madre y terapia del cáncer ^2-4. En los últimos años, la aparición de plataformas de microfluidos ha facilitado en gran medida el análisis de una sola célula, en el que el posicionamiento, el tratamiento, y la observación de la respuesta de las células individuales se han realizado con estrategias de análisis novedosos ^5.

La cavitación desempeña un papel importante en una amplia gama de aplicaciones biomédicas, incluyendo el tratamiento de cánceres por ultrasonidos de alta intensidad (HIFU) ⁶ enfocada, la fragmentación no invasiva de cálculos renales por litotricia por onda de choque (SWL) ^7, la administración de fármacos o gen por sonoporación ^8, y la destrucción informó recientemente de células o tejidos por hidrodinámico ^9,10 burbuja de cavitación. A pesar de esto, los procesos dinámicos de la burbuja (s) de cavitación interacciones con los tejidos biológicos y las células no han sido bien comprendidos. Esto es debido a la aleatoriedad en la dinámica de iniciación y burbuja de cavitación producidas por ultrasonido, ondas de choque, y la presión hidráulica local; Además, hay una falta de permitir técnicas para resolver las respuestas inherentemente complejos y rápidos de las células biológicas, especialmente en el nivel de una sola célula.

Debido a estos desafíos, no es sorprendente que muy pocos estudios han de abejasn informó para investigar las interacciones célula-burbuja en condiciones experimentales bien controlados. Por ejemplo, la poración de la membrana de las células individuales atrapado en suspensión ¹¹ y la gran deformación impulsiva de los glóbulos rojos humanos ¹² se han demostrado usando las burbujas individuales generados por láser en los canales de microfluidos. Esta última técnica, sin embargo, sólo puede producir muy pequeña deformación en células eucariotas, debido a la presencia del núcleo ^13. Por otra parte, es difícil controlar los efectos biológicos aguas abajo en el tratamiento de células en suspensión. En otros estudios, la excitación de ultrasonido de una microburbuja unido a la célula (o agente de contraste de ultrasonidos) para la producción de la poración de la membrana y / o las respuestas de calcio intracelular en las células adherentes individuales ha informado ^8. Membrana poración de células adherentes individuales también puede ser producido mediante el uso de burbujas en tándem generados por láser en una capa de líquido delgada solución de azul de tripano absorbente de la luz ¹⁴ que contiene, opor una burbuja de gas oscilante generado por pulsos de láser microsegundo de irradiación a través de un sustrato ópticamente absorbente en microcámaras ^15. En comparación, el sustrato ópticamente absorción tiene una ventaja sobre la solución de azul de tripano láser de absorción debido a que el último es tóxico para las células. Más importante aún, las burbujas generados por láser son más controlable en términos de tamaño de burbuja y la ubicación de burbujas acústicamente excitados. Sin embargo, en todos estos estudios anteriores, la forma celular, la orientación y las condiciones de adherencia no fueron controlados, lo que puede influir sustancialmente la respuesta de las células y los efectos biológicos producidos por tensiones mecánicas ^16.

Para superar estos inconvenientes en los estudios anteriores, se ha desarrollado recientemente un sistema experimental para la generación de la burbuja, el patrón celular, las interacciones de células de la burbuja de la burbuja, y en tiempo real los bioensayos de la respuesta celular en un chip microfluídico construido mediante el uso de una combinación única de Techn microfabricacióniques. Tres características principales que distinguen a nuestro sistema experimental de otros en el campo son: 1) el patrón de puntos de oro de tamaño micrométrico en el sustrato de vidrio para permitir la absorción del láser localizado para generación de burbujas ^17; 2) el patrón de islas de tamaño micrométrico de la matriz extracelular (ECM) para la adhesión celular en el mismo sustrato para controlar tanto la localización y la geometría de las células individuales; y 3) la compresión de la dimensión del dominio de interacción por células burbuja burbuja de 3D a un espacio cuasi-2D para facilitar la visualización en el plano de las interacciones de burbuja, la burbuja, chorro de campos de flujo, deformación celular, y los efectos biológicos, todos los capturados en una secuencia de imágenes aerodinámico (Figura 1d).

Figura 1: El chip de microfluidos y esquemas de los diferentes ensayos. a) Un chip de microfluidos ensamblado con canales llenos de tinta azul para la visualización. b) una región en el interior del chip de microfluidos con células estampadas y puntos de oro (la distancia entre los dos puntos de oro en la proximidad es 40 micras). Muchos pares de unidades de trabajo pueden disponerse en un canal. c) Primer plano imagen de una sola unidad de trabajo que consiste en un par de puntos de oro y una célula HeLa adherido a la región de la célula-patrón. d) Representación esquemática de la operación del dispositivo. Una sola célula se adhiere y se extiende en la "H" en forma de isla recubiertos con fibronectina. Un par de burbujas de cavitación (burbujas tándem) con oscilación en oposición de fase se produce mediante la iluminación de rayos láser de impulsos en los puntos de oro (véase la figura 4a), que conduce a la generación de un chorro rápido y localizada en movimiento hacia la célula diana cerca. La célula puede ser deformado, porado para la absorción macromolecular, y / o estimulado con una respuesta de calcio, dependiendo de la distancia de separación (S _d) de la célula a la burbuja tándem.f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55106/55106fig1large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esta plataforma puede ser combinado adicionalmente con ensayos de fluorescencia y perlas funcionalizadas unidas a la superficie celular para los efectos biológicos de cavitación inducida. En particular, esta plataforma se abre el camino para ensayos fiables y cuantificables a nivel de una sola célula. Hasta ahora, se ha utilizado el dispositivo para el análisis de inducida por la burbuja tándem deformación de la membrana celular, poración celular y captación intracelular, la viabilidad, apoptosis, y la respuesta del calcio intracelular. En el siguiente protocolo, se describe el proceso de fabricación de chips y el procedimiento para el análisis de los diversos efectos biológicos mencionados anteriormente. Por otra parte, también se describen las operaciones del chip.

Protocol

1. La microfabricación

NOTA: Todos los procedimientos de microfabricación se llevan a cabo en una sala limpia. Una máscara de cromo está diseñado antes de la microfabricación, véase la Figura 2.

Figura 2: Esquema del diseño de canal en el chip microfluídico y las dimensiones de las unidades de trabajo. a) El diseño de la máscara de los microcanales alineados PDMS (verde) y los patrones en el sustrato de vidrio (azul y rojo). b) Imagen ampliada del diseño de la máscara en una sección representativa de las matrices de la unidad de trabajo. c) Representación esquemática de una unidad de trabajo que muestra un patrón de células (azul) y un par de puntos de oro (rojo). Todas las escalas de longitud se muestran en la parte inferior derecha. Haga clic aquí para ver una larger versión de esta figura.

1. Patrones de punto de oro
   NOTA: El área de cada punto de oro está diseñado para ser dentro de 25 a 30 micras ^2, de modo que es lo suficientemente grande para absorber la energía láser para la generación de la burbuja, pero lo suficientemente pequeño para evitar las células individuales que se adhieren a ella. Un diagrama esquemático para la fabricación de puntos de oro se muestra en la Figura 3a.
   1. Limpieza portaobjetos de vidrio (en una campana química)
      1. Enjuague el portaobjetos de vidrio con acetona y luego alcohol isopropílico (IPA), y luego secarlo con _una corriente de _N2.
      2. Remojar el portaobjetos en solución Piranha (H ₂ SO ₄ H ₂ O ₂ = 4: 1) durante 10 minutos.
      3. Sacar la corredera, enjuagarlo con agua DI, y luego secarlo con _una corriente de _N2.
      4. Hornear el portaobjetos de vidrio sobre una placa caliente a 120 ° C durante 10 minutos.
      5. El tratamiento de la diapositiva en un Asher plasma a 100 W durante 90 s.
   2. Recubrimiento por centrifugación (campana de spin-coating)
      1. Encienda una placa caliente y esperar hasta que la temperatura es estable a 95 ° C.
      2. Siga el procedimiento de revestimiento:
         1.000 rpm durante 5 s con a / s rampa de 500 rpm;
         entonces 3.000 rpm durante 30 s con una / s rampa de 1.000 rpm.
      3. Fijar el portaobjetos de vidrio limpiado en la recubridora de rotación mediante la aplicación de un vacío.
      4. Cubrir la superficie de deslizamiento con P-20 y comenzar la receta de recubrimiento.
      5. Repita el proceso de recubrimiento de resina fotosensible NFR-negativo.
      6. Hornear el portaobjetos a 95 ° C durante 60 s y esperar a que se enfríe a temperatura ambiente.
   3. Fotolitografía
      1. Montar la máscara de cromo en el alineador de máscara y asegurarse de que el modelo lado se encuentra hacia abajo hacia la diapositiva.
      2. Establecer la receta para la fotolitografía modo de exposición dura con 9 s de la exposición UV y rápidamente alinear el sustrato de vidrio con la máscara.
      3. Después de llevar a cabo la exposición UV, hornear el portaobjetos a 956; C durante 1 min, y luego dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
   4. Desarrollo
      1. Desarrollar el patrón en la diapositiva en la solución de revelado durante 60 s.
      2. Retire el porta del desarrollador, lavarlo con agua DI, y secarlo con _una corriente de _N2.
      3. Compruebe el patrón de la geometría en el microscopio, y medir y registrar el tamaño de la característica.
   5. Deposición de oro (evaporación por haz de electrones) y de elevación inicial
      1. Hornear la diapositiva a 120 ° C durante 5 minutos, y dejar que se enfríe a temperatura ambiente.
      2. Limpiar el portaobjetos con plasma en la máquina de grabado iónico reactivo (RIE) durante 90 s a 500 Torr y 100 W.
      3. Depósito 5 nm de Ti y 15 nm de Au sobre el portaobjetos utilizando un evaporador de haz de electrones ^17.
      4. Remojar el portaobjetos durante la noche en un vaso de precipitados de vidrio que contiene removedor fotorresistente disolvente para eliminar el reposo de oro en la parte superior de la NFR resistir.
      5. Recuperar la diapositiva, i rast con acetona seguido por el IPA, y se seca con _una corriente de _N2.
      6. Secar el portaobjetos en una placa caliente a 115 ° C antes de limpiarlo en el Asher plasma de oxígeno a 100 W durante 90 s.
2. Molecular conjunto de patrones de despegue (MAPL)
   Nota: El área de cada isla recubiertos de fibronectina está configurado para estar dentro de 700 a 900 micras ² para facilitar la adecuada difusión de células HeLa en una región cuadrada y reducir al mínimo las posibilidades de múltiples células de agregación en la isla. Un diagrama esquemático para la preparación de islas de células de modelado se muestra en la Figura 3b.
   1. Recubrimiento por centrifugación
      1. Repita el paso 1.1.2, pero el uso de fotoprotector S1813-positiva y una temperatura de 115 ° C.
   2. fotolitografía alineado
      1. Montar la máscara de cromo en el alineador de máscara y asegúrese de que el lado con el patrón esté orientada hacia abajo hacia la corredera con elpuntos de oro.
      2. Establecer la receta para la fotolitografía modo de exposición dura con 9 s de la exposición UV.
      3. Alinear la máscara de la parte superior con la corredera inferior con marcas de alineación, situadas alrededor del borde de la máscara, como una referencia espacial.
      4. Compruebe la parte central de la máscara y compruebe que las operaciones de matriz están alineados correctamente.
      5. Completar la exposición UV sin post-horneado.
   3. Desarrollo
      1. Repita el paso 1.1.3, pero con 45 s de desarrollo antes de secar sobre una placa calefactora y preservar en N ₂ de almacenamiento.
3. Tratamiento químico
   1. Preparar la solución de pasivación: 0,5 mg / ml PLL-g-PEG en tampón HEPES 10 mM.
   2. Recuperar la diapositiva a partir de N ₂ de almacenamiento y limpiarlo utilizando RIE con el ajuste de parámetros: de 500 Torr presión, potencia 100-W, y 90 s de duración.
   3. Pipeta una gota de solución de pasivación sobre un pedazo de lámina de parafina.
   4. Emparedado la solución con la película y la corredera, asegurándose de que el lado con el patrón de características se encuentra hacia abajo hacia la película; evitar la formación de burbujas.
   5. Esperar durante 45 minutos antes de retirar el porta la película.
   6. Remojar la diapositiva de forma consecutiva en removedor de resina fotosensible, removedor de resina fotosensible y agua DI (1: 1), y agua DI, y agitar en un baño de ultrasonidos durante 90 s para cada remojo.
   7. Se seca la diapositiva sobre una placa caliente para eliminar la humedad antes de sellarlo en un desecador y su almacenamiento en un refrigerador.
4. ensamblaje de chips
   1. Repita los pasos 1.1.1-1.1.4, pero con fotoprotector SU8-2025-negativo y el ajuste de los parámetros que se refiere el protocolo llamado Microchem ^18, para preparar un molde de silicona con una máscara fotográfica.
   2. Fabricar un microcanal PDMS (40 mm x 25 mm x 5 mm, L x W x H) y una pequeña losa de PDMS (800 micras estructura de ranura-ancho) usando litografía blanda.
   3. Perforar el microchannel para los puertos de acceso de fluido y limpio con cinta adhesiva y luego con IPA.
   4. Escudo del área modelada del sustrato de vidrio con la losa de PDMS, y aplicar RIE (100 W, 500 mTorr, 60 s) para eliminar PLL-g-PEG de la zona periférica.
   5. Se trata el microcanal con una dosis reducida de RIE (25 W, 500 mTorr, 25 s), y luego alinearla al sustrato de vidrio impreso (con la pequeña losa de PDMS eliminado); llevar el microcanal y el sustrato de vidrio impreso en contacto conforme en un estereoscopio.

Figura 3: Diagramas esquemáticos para la microfabricación y el chip de montaje. a) patrón de puntos de oro sobre el sustrato de vidrio. b) Preparación del sustrato de vidrio para el patrón celular a través de MAPL. c) Montaje del canal de microfluidos con la unión de plasma. Ver la Lista de materiales para las definiciones of las abreviaturas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. La unión celular
   NOTA: células HeLa se mantuvieron rutinariamente en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico solución / antimitótico en un incubador de cultivo celular. Un diagrama esquemático para la fijación de montaje de chips y la célula se muestra en la figura 3c.
   1. Primer el chip con PBS durante 30 min a 1 l / min, y luego la inyección de solución de fibronectina (50 mg / ml en PBS, 1 l / min) durante 45 min.
   2. Mientras espera, trypsinize cultivo de células con 0,25% de tripsina-EDTA, lavarlos en medio de cultivo, las células individuales de centrífuga, y reconstituir la suspensión celular en pre-calentado (37 ° C) medio de cultivo a 5x10 ⁶ células / ml.
   3. Vuelva a colocar la solución de fibronectina con PBS y lavar el chip a 10 l / min durante 5 min.
   4. Inyectarla suspensión celular preparada en el chip, detener el flujo, la abrazadera de la salida, y mantener el chip en una incubadora de cultivo celular durante 30 min.
   5. Soltar la salida y lavar el chip con medio de cultivo celular a 10 l / min durante 5 min. Reducir la tasa de flujo de perfusión del medio de cultivo a 0,75 l / min y mantener el cultivo de células durante 2 h en la incubadora.

2. generación de burbujas y la visualización de flujos

NOTA: Un diagrama esquemático de la configuración experimental se muestra en la figura 4a para generación de burbujas tándem y la interacción del flujo resultante con una sola célula crecido cerca en un canal microfluídico.

1. Generación de burbujas tándem con dos láseres y de control de temporización
   1. Coloque el chip de microfluidos en el escenario de un microscopio invertido y alinear los focos de dos pulsos de láser Nd: YAG (λ = 532 nm, duración del pulso de 5 ns) en un par de puntos del oro con dibujos separados by 40 micras.
   2. Utilizar un generador de retardo digital para activar los dos láseres con un retardo de tiempo alrededor de 2,5 mu s para producir dos burbujas iniciadas en los puntos del oro.
   3. Ajustar la energía de salida del láser (~ 10 mu J) para producir un diámetro máximo de las burbujas dentro de 50 ± 2 m.
   4. Sincronizar una cámara de alta velocidad (exposición de 200 ns y 2 millones de fotogramas por segundo (fps)) para los láseres y capturar la dinámica de la expansión de la burbuja, el colapso, la interacción de burbuja, la burbuja, y la formación de chorro.
2. La cuantificación de la velocidad del chorro
   1. Registrar la posición de la punta del chorro (J ₁₎ en el extremo proximal de la primera burbuja (B ₁₎ y el extremo distal de B _1, a partir de la generación de la segunda burbuja (B ₂₎ y terminando con la toma de contacto de J ₁ hacia el extremo distal de B _1; ver el esquema de la Figura 5a.
   2. ajustarse linealmente el curso temporal de la posición de both proximal (punta del chorro) y los extremos distales. Calcular la pendiente de la posición de la punta respecto a la curva de tiempo para el extremo proximal para determinar la velocidad del chorro. La intersección de las dos líneas indica el tiempo chorro de toma de contacto. Más detalles se pueden encontrar en la referencia 19.
3. La visualización del campo de flujo de burbuja, inducida tándem
   1. Preparar 1 m de poliestireno (PS) suspensión de perlas en agua DI (2,6% w / v) e inyectar las perlas en el chip microfluídico.
   2. Generar burbujas en tándem como se describe en el paso 2.1.1-2.1.3.
   3. Registrar la dinámica de burbujas tándem utilizando una cámara de vídeo de alta velocidad a una velocidad de encuadre 5 M fps con un tiempo de exposición de 100 ns.
   4. Sube la secuencia de imágenes adquiridas en un software comercial PIV.
   5. Divide cada imagen en pequeñas ventanas de interrogación de 16 x 16 pixeles (px) con un solapamiento de 75%.
   6. Aplicar iteración de pasos múltiples y filtros regionales para reducir los errores en el cálculo campo de velocidades, ysalida de los resultados en un mapa del vector de velocidad.

Figura 4: Esquema del montaje experimental y la grabación de imágenes. a) Montaje experimental para la generación de burbujas tándem. b) la secuencia de tiempo utilizado para diferentes tipos de adquisiciones de imágenes. FL: microscopía de fluorescencia, BF: campo claro, IFT: tiempo entre tramas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Una sola célula Análisis y Bioefectos

NOTA: La burbuja tándem se produce junto a las células diana, y los efectos biológicos resultantes son estudiados de manera dependiente de la distancia enfrentamiento. La secuencia de tiempo para diferentes tipos de adquisiciones de imágenes se representa en la Figura 4b.

1. Poración de la membrana y la absorción macromolecular
   NOTA: La captación de macromoléculas extracelulares en la célula diana se caracteriza por la progresiva difusión de yoduro de membrana impermeable de propidio (PI) a través del sitio de poración en la membrana celular.
   1. Después de la etapa 1.5, sustituir el medio de cultivo regular (es decir, DMEM) con una solución de PI (100 g / ml en DMEM) que se ejecuta a una velocidad de flujo de perfusión de 0,5 l / min durante todo el experimento.
   2. Programar el software de control de microscopio para seleccionar automáticamente el cubo fluorescente PI en la torreta giratoria y sincronizar la temporización de la cámara CCD con la excitación de fluorescencia PI para capturar imágenes de fluorescencia con un tiempo de exposición de 200 ms.
   3. Después de los dos focos de láser están alineados con un par de puntos de oro junto a una célula diana, ficha tanto de campo brillante (BF) y las imágenes de fluorescencia (FL) antes del tratamiento burbuja tándem.
   4. Utilice el software de control microscopio para inmediatamenteiniciar un lapso de tiempo de grabación de imágenes de fluorescencia de la célula diana, poco después de la etapa 2.1 para capturar la historia de la captación de PI.
2. la deformación de la membrana
   1. Preparar 1-micras perlas (1% w / v, activados con carbodiimida soluble en agua) y funcionalizar con péptido-2000 (100 g / ml en PBS).
   2. Después de la etapa 1.5, se incuban las células unidas con las perlas funcionalizadas a una densidad de 1x10 ⁹ perlas / ml a 37 ° C durante 30 min.
   3. Repita el paso 2.1 para producir burbujas en tándem junto a la célula diana y registrar la deformación celular con una cámara de ultra alta velocidad funcionando a una velocidad de encuadre de 5 millones fps.
   4. Identificar una tríada de 3 cuentas que permanecen en el plano de la imagen a lo largo del experimento y compilar sus posiciones como (x _1, y ₁₎ (x _2, y _2), y (x _3, y ₃₎ en el experimento de coordenadas.
   5. Calcular el área de la tríada antes y afTer el tratamiento de la burbuja tándem utilizando la fórmula:
      
   6. Calcular la cepa de interés como:
      
   7. Sobre la base de las coordenadas de los tres vértices antes y después del tratamiento de la burbuja en tándem, el cálculo de la tensión y la principal área cepa local siguiendo los protocolos establecidos ^20,21.
3. La viabilidad y la apoptosis
   NOTA: FITC Anexina V etiquetas de células, incluidas las apoptóticos, a través de la externalización de la fosfatidilserina (fluorescencia verde). PI etiquetas de los núcleos de las células necróticas (fluorescencia roja). de imágenes de campo claro se utiliza para documentar la morfología celular y para ayudar en la identificación de la viabilidad celular y la apoptosis.
   1. Registrar la posición de cada célula tratada en el canal de microfluidos (facilitado por las etiquetas de dirección en el canal, véase la Figura 2b
   2. Se incuban las células tratadas en el medio de cultivo celular durante otras 2 h antes de la perfusión del chip con una solución de FITC Anexina V durante 15 min. Las células positivas muestran una fluorescencia verde.
   3. Repita el paso 3.3.2 24 h después del tratamiento burbuja tándem para estudiar los efectos biológicos a largo plazo en las células diana.
4. respuesta de calcio
   1. Mezclar 3 l de fura-2 a.m. solución madre (1 mg / ml en DMSO) con 3 l de 10% w / v de Pluronic F-127 en 500 l de medio de suero reducido para preparar la solución de etiquetado final (6 M).
   2. Después de la etapa 1.5, sustituir el medio de cultivo celular con la solución de etiquetado y se incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 40 min (1 l / min velocidad de perfusión).
   3. Vuelva a llenar el canal con el medio de suero reducido (0,75 l / min velocidad de perfusión) antes de comenzar el experimento celular.
   4. Iniciar la proyección de imagen radiométrica (longitud de onda: 340/380 nm, la exposición de 50 ms)de la célula diana utilizando el sistema de PTI comercial.
   5. Después de 10 s de imagen radiométrica de la célula al nivel de reposo, producir burbujas en tándem como en el paso 2.1; primero registro con un tiempo entre tramas (IFT) de 0,1 s para 1 min, a continuación, aumentar la IFT a 1 s para otro min, y un aumento adicional de 5 s después de 2 min.
   6. Utilice el software PTI para calcular la relación R = F340 / F380 en la región de interés (ROI), que es proporcional a la concentración de calcio intracelular.

Results

La plataforma de microfluidos se describe en este trabajo se puede utilizar para investigar las interacciones de burbuja, la burbuja y para analizar una variedad de efectos biológicos de cavitación inducida a nivel de una sola célula. A continuación, presentamos varios ejemplos para demostrar una variedad de estudios experimentales y ensayos biológicos que se pueden realizar en nuestro sistema experimental. Primero Ilustraremos las interacciones transitorias de burbujas en tándem con la ...

Discussion

El análisis de una sola célula, en combinación con imágenes de células vivas, ha mejorado en gran medida nuestra comprensión de los procesos dinámicos y con frecuencia variable en las células individuales, tales como la aparición del fenotipo y la respuesta inmune ^23. En contraste con el cultivo celular convencional en placas o matraces, los sistemas microfluídicos permiten un control preciso del microambiente, hasta el nivel de una sola célula, en tiempo real. En consecuencia, los avances en la tecnología de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo/Materiales
75 mm x 38 mm Portaobjetos de microscopio	liso Corning	2947-75X38
Acetona	Sigma Aldrich, Co.	320110	Reactivo ACS, ≥ 99.5%
Alcohol isopropílico	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥ 99.7%, FCC, FG
Ácido sulfúrico	Sigma Aldrich, Co.	320501	Reactivo ACS, 95.0-98.0%
Peróxido de hidrógeno	Sigma Aldrich, Co.	216763	30 % en peso en H2
O Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR fotorresistente	JSR	NFR016D2
Photomask	Photoplotstore	N/A	4x4 Máscara de escritura directa
MF-319 Revelador	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Removedor fotorresistente	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-metil-2-pirrolidinona a base
S1813 fotorresistente	Shipley (Rohm and Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Película de parafina	HACH 251764
SU-2025 fotorresistente	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Tubo de Microdiámetro	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Pasadores metálicos	New England Tubo pequeño	NE-1300-01	Tubo cortado (recto), 0.025" Diámetro exterior x 0,017" ID x 0.50" Células HeLa largas
Instalación	cultivo celular	de Duke(307-CCL-2) HeLa, p.148
Tampón DPBS (1x)	ThermoFisher Scientific	14190144
medio de cultivo DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronectina Proteína bovina, plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Yoduro de propidio	ThermoFisher Scientific	P21493
Microesferas de carboxilato 1.00  μ m	Polysciences, Inc	08226-15
Microesferas de carboxilato 2.00  μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo)carbodiimida)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Anexina V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 y micro; m filtrado (solución al 10% en agua)
Medios séricos reducidos	ThermoFisher Scientific	11058021
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Equipment
Plasma asher	Emitech	K-1050X	O2 / Ar incineración de plasma de fotorresistente y otros materiales orgánicos
alineador de mascarillas	SUSS MicroTec	Karl Suss MA6/BA6
Evaporador de haz E	CHA Industries CHA Industries	Solución E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(óxido / nitruro / polímero)
grabado estereoscopio	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Microscopio estereoscópico
Bomba de jeringa	Chemyx Inc	NanoJet
incubadora de cultivo celular	NuAire	AutoFlow NU-8500 Camisa de agua CO2 Incubadora
Cabinas de seguridad biológica	NuAire	NU-425-400
Baño de agua	Centrífuga VWR	1122s
IEC		Centra CL2
Microscopio	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG láser  (láser 1)	Investigación de la Nueva Ola	Tempestad
Nd:YAG láser  (láser 2)	de Orión de investigación de nuevas		olas
	Berkeley Nucleonics	BNC 565-8c
Lámpara de flash	Dyna-Lite	ML1000 cámara de alta velocidad con tubo
	DRS Hadland	Cámara de alta velocidad Imacon 200
	Cámara de alta velocidad Shimadzu	HPV-X
	Vision Research	Phantom V7.3
Software PIV	Cámara LaVision	DaVis 7.2
	Software Zeiss	AxioCam MRc 5
Sistema	PTI Zeiss	AxioVision
Horiba		S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software	Horiba	Easy Ratio Pro 2	versión 2.3.125.86
63&veces; objetivo	Zeiss	LD Plan Neofluar