Un sistema de microfluidos con modelar superficie de Investigación de la burbuja de cavitación (s) Interacción -Cell y los Bioefectos resultante en el nivel de celda única

Summary

Se fabricó un chip microfluídico para producir pares de puntos dorados para la generación de burbujas en tándem e islas recubiertas de fibronectina para el patrón unicelular cercano. El campo de flujo resultante se caracterizó mediante velocimetría de imágenes de partículas y se empleó para estudiar varios efectos biológicos, incluida la poración de la membrana celular, la deformación de la membrana y la respuesta al calcio intracelular.

Abstract

En este manuscrito, que primero se describe el protocolo de fabricación de un chip de microfluidos, con puntos de oro y regiones recubiertas de fibronectina en el mismo sustrato de vidrio, que controla con precisión la generación de burbujas en tándem y las células individuales estampadas cerca con ubicaciones y formas bien definidas. a continuación, se demuestra la generación de burbujas en tándem mediante el uso de dos láseres pulsados ​​que ilumina un par de puntos del oro con un tiempo de retardo pocos microsegundos. Visualizamos la interacción de burbuja, la burbuja y la formación de chorro de imágenes de alta velocidad y caracterizar el campo de flujo resultante usando velocimetría de imágenes de partículas (PIV). Por último, se presentan algunas aplicaciones de esta técnica para el análisis de células individuales, incluyendo la formación de poros de la membrana celular con la absorción de macromoléculas, la deformación de la membrana localizada determinado por los desplazamientos de perlas de unión a integrinas unidas, y la respuesta del calcio intracelular a partir de imágenes radiométrica. Nuestros resultados muestran que un flujo de chorro rápido y direccional es proproducida por la interacción de burbujas en tándem, que puede imponer una tensión de corte altamente localizada en la superficie de una célula cultivada en las proximidades. Además, los diferentes efectos biológicos pueden ser inducidos por la alteración de la fuerza de la corriente de inyección ajustando la distancia de separación de la célula a las burbujas en tándem.

Introduction

Hay un creciente reconocimiento de que la heterogeneidad celular, que surge de la expresión de los genes estocástico, proteínas y metabolitos, existe dentro de una población de células grandes y sirve como un principio fundamental en la biología para permitir la adaptación celular y la evolución ^1. Por lo tanto, a menudo es imprecisa y poco fiable para utilizar mediciones a granel basados ​​en la población para comprender la función de las células individuales y sus interacciones. El desarrollo de nuevas tecnologías para el análisis de una sola célula, por tanto, de gran interés en la investigación biológica y farmacológica es, y se puede utilizar, por eje....

Protocol

1. La microfabricación

NOTA: Todos los procedimientos de microfabricación se llevan a cabo en una sala limpia. Una máscara de cromo está diseñado antes de la microfabricación, véase la Figura 2.

Figura 2: Esquema del diseño de canal en el chip microfluídico y las dimensiones de las unidades de trabajo. a) El diseño de la máscara de los microcanales alineados PDMS (verde) y los patrones en el sustrato de vidrio (azul y rojo). b) ....

Results

La plataforma de microfluidos se describe en este trabajo se puede utilizar para investigar las interacciones de burbuja, la burbuja y para analizar una variedad de efectos biológicos de cavitación inducida a nivel de una sola célula. A continuación, presentamos varios ejemplos para demostrar una variedad de estudios experimentales y ensayos biológicos que se pueden realizar en nuestro sistema experimental. Primero Ilustraremos las interacciones transitorias de burbujas en tándem con la .......

Discussion

El análisis de una sola célula, en combinación con imágenes de células vivas, ha mejorado en gran medida nuestra comprensión de los procesos dinámicos y con frecuencia variable en las células individuales, tales como la aparición del fenotipo y la respuesta inmune ^23. En contraste con el cultivo celular convencional en placas o matraces, los sistemas microfluídicos permiten un control preciso del microambiente, hasta el nivel de una sola célula, en tiempo real. En consecuencia, los avances en la tecnología de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reactivo/Materiales
75 mm x 38 mm Portaobjetos de microscopio	liso Corning	2947-75X38
Acetona	Sigma Aldrich, Co.	320110	Reactivo ACS, ≥ 99.5%
Alcohol isopropílico	Sigma Aldrich, Co.	W292907	≥ 99.7%, FCC, FG
Ácido sulfúrico	Sigma Aldrich, Co.	320501	Reactivo ACS, 95.0-98.0%
Peróxido de hidrógeno	Sigma Aldrich, Co.	216763	30 % en peso en H2
O Primer P-20	Microchem	MCC Primer 80/20
NFR fotorresistente	JSR	NFR016D2
Photomask	Photoplotstore	N/A	4x4 Máscara de escritura directa
MF-319 Revelador	Shipley (Rohm and Haas)	Microposit MF-319
1165 Removedor fotorresistente	Dow Chemical, Co.	DEM-10018073	1-metil-2-pirrolidinona a base
S1813 fotorresistente	Shipley (Rohm and Haas)	S1813
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
Película de parafina	HACH 251764
SU-2025 fotorresistente	Microchem	SU-2025
PDMS	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Tubo de Microdiámetro	Saint-Gobain PPL Corp.	S-54-HL
Pasadores metálicos	New England Tubo pequeño	NE-1300-01	Tubo cortado (recto), 0.025" Diámetro exterior x 0,017" ID x 0.50" Células HeLa largas
Instalación	cultivo celular	de Duke(307-CCL-2) HeLa, p.148
Tampón DPBS (1x)	ThermoFisher Scientific	14190144
medio de cultivo DMEM	ThermoFisher Scientific	11995065
Fibronectina Proteína bovina, plasma	ThermoFisher Scientific	33010018
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	ThermoFisher Scientific	25200056
Yoduro de propidio	ThermoFisher Scientific	P21493
Microesferas de carboxilato 1.00  μ m	Polysciences, Inc	08226-15
Microesferas de carboxilato 2.00  μ m	Polysciences, Inc	18327-10
EDC (Clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo)carbodiimida)	ThermoFisher Scientific	22980
Sulfo-NHS	Sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinimida)	24510
Peptite-2000	Advanced BioMatrix	5020-5MG
FITC Anexina V	ThermoFisher Scientific	A13199
Fura-2, AM	ThermoFisher Scientific	F1221
DMSO	Sigma Aldrich, Co.	D2650
F-127	invitrogen	P6866	0.2 y micro; m filtrado (solución al 10% en agua)
Medios séricos reducidos	ThermoFisher Scientific	11058021
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
>Equipment
Plasma asher	Emitech	K-1050X	O2 / Ar incineración de plasma de fotorresistente y otros materiales orgánicos
alineador de mascarillas	SUSS MicroTec	Karl Suss MA6/BA6
Evaporador de haz E	CHA Industries CHA Industries	Solución E-Beam
RIE	Trion Technology	Trion Technology Phantom II	(óxido / nitruro / polímero)
grabado estereoscopio	AmScope	American Scope SM-4TZ-FRL	Microscopio estereoscópico
Bomba de jeringa	Chemyx Inc	NanoJet
incubadora de cultivo celular	NuAire	AutoFlow NU-8500 Camisa de agua CO2 Incubadora
Cabinas de seguridad biológica	NuAire	NU-425-400
Baño de agua	Centrífuga VWR	1122s
IEC		Centra CL2
Microscopio	Zeiss	Axio Observer Z1
Nd:YAG láser  (láser 1)	Investigación de la Nueva Ola	Tempestad
Nd:YAG láser  (láser 2)	de Orión de investigación de nuevas		olas
	Berkeley Nucleonics	BNC 565-8c
Lámpara de flash	Dyna-Lite	ML1000 cámara de alta velocidad con tubo
	DRS Hadland	Cámara de alta velocidad Imacon 200
	Cámara de alta velocidad Shimadzu	HPV-X
	Vision Research	Phantom V7.3
Software PIV	Cámara LaVision	DaVis 7.2
	Software Zeiss	AxioCam MRc 5
Sistema	PTI Zeiss	AxioVision
Horiba		S/N: 1705 RAM-X
EasyRatio software	Horiba	Easy Ratio Pro 2	versión 2.3.125.86
63&veces; objetivo	Zeiss	LD Plan Neofluar