Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto Drosophila

Resumen

El adulto de Drosophila cerebro es un sistema valioso para el estudio de los circuitos neuronales, las funciones cerebrales superiores, y los trastornos complejos. Un método eficaz para diseccionar el tejido cerebral entera de la cabeza pequeña mosca que facilitará los estudios basados ​​en el cerebro. Aquí se describe un protocolo de disección simple, de un solo paso de cerebros adultos con una morfología bien conservada.

Resumen

Existe un interés creciente en el uso de Drosophila para modelar enfermedades degenerativas del cerebro humano, el mapa circuitería neuronal en el cerebro adulto, y el estudio de las bases moleculares y celulares de las funciones cerebrales superiores. Una preparación de todo el montaje de los cerebros de adultos con una morfología bien conservada es fundamental para este tipo de estudios integrales basados ​​en el cerebro, pero puede ser técnicamente difícil y requiere mucho tiempo. Este protocolo describe un enfoque disección de un paso fácil de aprender, de una cabeza de mosca adulta en menos de 10 s, mientras se mantiene el cerebro intacto unido al resto del cuerpo para facilitar las etapas de procesamiento posteriores. El procedimiento ayuda a eliminar la mayor parte de los tejidos del ojo y traqueales normalmente asociadas con el cerebro que puede interferir con la etapa de formación de imágenes más tarde, y también pone menos demanda de la calidad de los fórceps de disección. Además, se describe un método simple que permite flipping conveniente de las muestras de cerebro montados sobre un cubreobjetos, que es importante para obtener imágenes de ambos lados de la blluvias con intensidad de señal similar y la calidad. Como un ejemplo del protocolo, se presenta un análisis de las neuronas dopaminérgicas (DA) en cerebros adultos de WT ⁽¹¹¹⁸ w) vuela. La alta eficacia del método de disección hace que sea especialmente útil para los estudios basados en el cerebro adulto a gran escala en Drosophila.

Introducción

El organismo modelo Drosophila, comúnmente conocida como la mosca de la fruta, durante mucho tiempo ha sido valorado por sus herramientas genéticas elegantes, tiempos cortos reproductivos, y muy conservadas vías moleculares y celulares. La mosca de la fruta ha sido empleado con éxito para diseccionar las vías de señalización básicos, los mecanismos de modelado de los organismos multicelulares, así como los mecanismos que subyacen en el desarrollo neuronal, funciones, enfermedades y ^1,2. Con los recientes avances en las tecnologías de etiquetado celular y de formación de imágenes, el cerebro mosca de la fruta se ha vuelto especialmente potente en mapeo fino de la circuitería neuronal y en la disección de la base molecular y celular de las funciones cerebrales superiores, como el aprendizaje y la memoria, y el ritmo circadiano ^{1,3, 4.5.6.7.8.}

Una ventaja particular del sistema Drosophila es su tamaño relativamente pequeño, lo que permite todo el montaje preparación y el examen del cerebro usando un compuesto de regular o microscopio confocal. Thicaracterística s permite un análisis detallado anatómicas y funcionales de los circuitos neuronales, o incluso una sola neurona, a nivel celular y subcelular, en el contexto de un tejido de todo el cerebro, lo que proporciona tanto una visión integral del tema estudiado y su geometría exacta dentro del conjunto cerebro. Sin embargo, dado el tamaño miniatura en lugar del cerebro, sino que también presenta un desafío técnico en la disección de una manera eficiente el tejido cerebral intacto fuera de la caja protectora de la cabeza exoesqueleto en una mosca adulta. Varios métodos eficaces y relativamente simples de disección se han descrito en detalle, que por lo general implican cuidado y paso a paso la eliminación de la caja de cabeza y los tejidos asociados incluyendo los ojos, la tráquea, y grasa del cerebro adecuada ^{9, 10.} Estos métodos de disección microquirúrgica menudo imponer exigencias más estrictas sobre la calidad de las pinzas de disección, apoyándose en unas pinzas finas con puntas bien alineados que se pueden dañar fácilmente. Además, como los cerebros disecados son a menudo separated del resto del cuerpo, el cerebro pueden perderse fácilmente durante los subsiguientes procesos de tinción y lavado debido a su pequeño tamaño y su transparencia en el tampón de procesamiento. A continuación, se describe un protocolo de disección de un paso relativamente simple y fácil de aprender, por cerebros adultos que mantienen los cerebros disecados unidos al torso. El proceso de disección a menudo desaparece con facilidad a la mayoría de los tejidos del cerebro asociada tal como el ojo y la tráquea y reduce la demanda de pinza de disección buena calidad.

Además, cuando la formación de imágenes del cerebro bajo el microscopio compuesto fluorescente o un microscopio confocal, el lado del cerebro que está lejos de la fuente de luz fluorescente a menudo produce una señal más débil y menos imágenes nítidas debido a que el espesor del cerebro todo el montaje. Aquí, también se describe un método de montaje simple que permite una fácil mover de un tirón de las muestras de cerebro, lo que permite formación de imágenes conveniente de ambos lados del cerebro con intensi señal similarTy y calidad.

Como una prueba de concepto para la aplicación de este método para estudiar el cerebro adulto, hemos examinado aún más la presencia de las neuronas dopaminérgicas en el cerebro de las moscas w ^1118; un genotipo que se utiliza a menudo como la línea parental para la generación de moscas transgénicas y el control de tipo salvaje en muchos estudios de Drosophila.

Protocolo

1. Soluciones utilizadas para el Cerebro La disección y la tinción de inmunofluorescencia

1. Diseccionar el cerebro adulto mosca artificial en el líquido cefalorraquídeo (ACSF): NaCl 119 mM, 26,2 mM _NaHCO3, KCl 2,5 mM, 1 mM NaH ₂ PO _4, 1,3 mM _{de MgCl2} y 10 mM de glucosa. Antes de su uso, el gas de la ACSF con 5% _{de CO2} / 95% de _O2 durante 10 - 15 min y pico con 2,5 mM _{de CaCl2.} Esterilizar la solución LCRa por filtración a través de un filtro de 0,22 micras membrana.
   Nota: tienda LCRa a 4 ° C para evitar la contaminación bacteriana. Fly cerebro también pueden ser diseccionados en una solución tamponada con fosfato salino (PBS), aunque no se han realizado comparaciones detalladas de los efectos de las dos soluciones de disección en la calidad de imagen final de los cerebros disecados.
2. Usar 4% de paraformaldehído (PFA) preparado en 1x PBS como la solución de fijación, que normalmente se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C.
   caution: PFA es tóxico y corrosivo y debe manejarse con cuidado.
3. Utilice 1x PBS para enjuagar la PFA de los cerebros y después de la última etapa de lavado, durante la tinción de inmunofluorescencia de los cerebros disecados. Preparar el PBS 1x PBS 10x de solución madre (1,37 M NaCl, KCl 27 mM, 100 mM de Na ₂ HPO _4, y 18 mM KH ₂ PO _4).
4. Use 0,3% de Tween-20 en PBS 1x (1x PBT) para todas las etapas de lavado posteriores durante la tinción de inmunofluorescencia de los cerebros disecados.

2. La disección microquirúrgica de Jefes de las moscas adultas

Nota: El procedimiento de disección se ilustra en la Figura 1.

1. Anestesiar las moscas adultas con _CO2. Con unas pinzas, recoger una mosca y brevemente desparafinar su cutícula por inmersión en etanol al 70% durante 3 - 5 s. Esto asegura que no hay burbujas se adhieren a la cutícula mosca cuando se sumerge en la solución o LCRa disección 1X PBS.
2. Debajo demicroscopio de disección con una fuente de luz en un ángulo que no será bloqueada por las manos, establezca la lente del objetivo de alcanzar una visión clara de la marcha (ampliación 1.2X). El uso de fórceps con la mano no dominante para inmovilizar al animal y sumerja la mosca en la solución de disección en frío con su abdomen hacia arriba, como se muestra en la Figura 1A.
3. Mantener las pinzas en un 160 - 170 ° ángulo con respecto a la placa de disección, mientras se ejerce una pequeña fuerza sobre el abdomen de la mosca (ilustrado como flechas en la Figura 1A). Este paso inmovilizará la marcha y la fuerza para mover la cabeza hacia atrás para el 15 - 25 ° mientras se extiende la trompa hacia arriba. En el proceso, una región suave y translúcido de la cutícula, por debajo de la trompa, debería ser evidente. Aumentar la ampliación y ajustar el plano focal en esta región.
   Nota: No sostenga la pinza con demasiada fuerza, sino que simplemente lo suficientemente firme como para estabilizarla mosca. El exceso de fuerza hará que los órganos dentro de la rotura en la solución.
4. Utilice la mano dominante para presionar las pinzas de disección de modo que sus puntas están cerrados, lo que generará una fuerza resistente suave en la punta de las pinzas, por lo que el fórceps surgirán abierta cuando se libera la presión de la mano que sujeta. Coloque la pinza perpendicularmente a las pinzas que sostienen la marcha, como se muestra en la Figura 1B.
   1. Pierce las puntas cerradas de los fórceps de disección a través de la región suave y translúcido de la cutícula debajo de la trompa, como se ilustra por la flecha roja en la Figura 1B. Es importante que no penetre el fórceps demasiado profundamente que toque el cerebro. El cerebro adecuada debe ser visible. Mantener un agarre estable de la mosca con la mano no dominante.
5. Rápidamente, pero de manera constante, suelte las puntas de las pinzas de disección por su propia fuerza y ​​se basan en el impulso de esta versión desgarrar tque exoesqueleto que rodea la cabeza de la mosca. Un cerebro intacto adecuada debe ser visible (el tejido blanco inmediatamente por encima de la punta de la pinza inferior en la figura 1C) Sigue una línea imaginaria para guiar el impulso de las puntas de fórceps liberados (ilustrados como las flechas rojas hacia el exterior que se muestran en la Figura 1C). Esto eliminará suavemente el exoesqueleto y la mayoría del ojo cerebro asociada y la tráquea del cerebro. El momento y la fuerza apropiada aplican para abrir el exoesqueleto será dependiente de la experiencia del investigador.
   Nota: Este es el paso más crítico durante la disección. Es importante que depender de la fuerza natural generado a partir del impulso de las pinzas de apertura para eliminar el exoesqueleto, dejando el cerebro expuesto permanece unido al resto del cuerpo.
6. Utilice las pinzas en la mano dominante para retirar cuidadosamente los tejidos remanentes de accesorios, tales como la tráquea que aparece como estructuras de fibras blancas remaining unido al cerebro. Tenga cuidado de no tirar o dañar el cerebro adecuado.

3. Inmunofluorescencia La tinción de los cerebros

1. Fijar las muestras de cerebros disecados con sus torsos asociados en aproximadamente 1 ml de PFA al 4% durante 40 - 60 min.
   Nota: Para éste y los siguientes pasos, mantenga los tubos o placas con las muestras en un nutator para mezclar adecuadamente las muestras en la solución.
2. Enjuague con 1 ml de PBS 1x pipeteando la solución hacia arriba y abajo 3 veces. Tenga cuidado de no aspirar los cerebros de distancia.
3. Lavar 5 veces con 1x PBT de 5 min cada uno. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación.
4. Se incuban con anticuerpos primarios a una dilución apropiada de O / N a 4 ° C.
5. Al día siguiente, eliminar los anticuerpos primarios, y lavar las muestras 5 veces con 1x PBT. Deje las muestras durante 5 - 10 min en la solución 1x PBT entre cada lavado. Mantener las muestras en el nutator durante la incubación.
6. Incubar la lavamuestras de anticuerpos secundarios apropiados con la dilución y el tiempo de incubación sugerido.
7. Lavar las muestras seis veces con 1x PBT con una incubación de 10 min entre cada lavado.
   Este paso es crítico para la eliminación de los anticuerpos secundarios unidos de forma no específica de la muestra.
8. Incubar en una dilución 1: 10000 de 1 mg / ml 4 ', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) en solución PBT 1x durante 30 min. DAPI es un tinte de ADN que se une a las regiones de AT de ADN y se puede utilizar para revelar la morfología general del cerebro.
9. Enjuague tres veces con PBS 1x.
10. Transferir las muestras a un plato de disección, y se separan los cerebros de los órganos en una placa de disección con unas pinzas.
11. Después de las etapas de tinción y lavado, montar los cerebros en entre dos cubreobjetos y colocar el cubreobjetos en la parte superior de un portaobjetos de montaje. De esta manera, las muestras de cerebro se pueden bascular con facilidad de modo que ambos lados del cerebro se pueden obtener imágenes con una intensidad de señal similar.
    Nota: Montaje del cerebro en el cubreobjetos en lugar de directamente sobre el portaobjetos de montaje permite mover de un tirón de la orientación de la muestra libremente. El proceso de montaje se explica con más detalle a continuación.
    1. Colocar un cubreobjetos de 18 x 18 mm en la parte superior de un portaobjetos de montaje. Ensanchar la abertura de una punta de pipeta con una cuchilla y utilizarla para transferir los cerebros en la solución de PBS 1x en la 18 x 18 mm cubreobjetos.
    2. Coloque los cerebros en el centro del cubreobjetos, eliminar el líquido alrededor de los cerebros con una punta de pipeta fina, y luego añadir otro 20 - 40 l de medio de montaje anti-fade (0,2% (w v) n-propil galato / en 99,5 ACS% de glicerol de grado) en los cerebros.
       Nota: La cantidad de montaje añadido medio depende del número de cerebros examinados.
    3. Suavemente separa los sesos al desplazar el medio de montaje viscoso hacia el exterior. Colocar un segundo 18 x 18 mm cubreobjetos en la parte superior de los cerebros mediante la reducción de la diapositiva primero de un lado hasta que haga contacto conla superficie de la hoja de montaje y, a continuación, reducir poco a poco el otro lado para minimizar el contacto cerebro con burbujas de aire.
       Nota: No hay necesidad de utilizar un espaciador entre los dos cubreobjetos, como el volumen del medio de montaje y el cerebro deben proporcionar un espacio suficiente para separar los dos cubreobjetos.
    4. Deje que los portaobjetos para establecerse. Retire el líquido excesivo que salen de los lados de las tiras con un pañuelo de papel de laboratorio.
    5. Para evitar que los cubreobjetos con los cerebros montados caiga fuera de la diapositiva de montaje durante el transporte, utilizar un pequeño trozo de cinta adhesiva para unir los cubreobjetos al portaobjetos de montaje.
       Nota: Los cerebros montan entre las diapositivas se pueden visualizar inmediatamente o se conservaron a 4 ° C durante un máximo de una semana sin pérdida significativa de la señal fluorescente, sin necesidad de utilizar ningún sellador para sellar las diapositivas. Para la conservación a largo plazo de los cerebros manchadas, el lado de los dos resbalones se puede sellar wITH esmalte de uñas y se almacena en un congelador a -20ºC, aunque cerebros manchados podrían perder sus señales a través del tiempo. Esto no es recomendable.
12. Utilizar un microscopio compuesto fluorescente apropiada o un microscopio confocal para la imagen de los cerebros.
    1. En primer lugar, adquirir la imagen del lado del cerebro más cerca del objetivo, y luego la vuelta con cuidado el cubreobjetos tener las muestras intercaladas en el medio. Este paso facilita la adquisición de la imagen del otro lado de la misma cerebro.
    2. Utilice un microscopio vertical compuesto fluorescente y una lente objetivo 20X en la imagen de conjunto del cerebro (ejemplos en la Figura 2) y un objetivo de 40X a imagen regiones más pequeñas del cerebro, tales como las neuronas DA en la región de clúster Paired anterior medial (PAM) (ejemplos en la Figura 3).

Resultados

La Figura 1 ilustra los principales procedimientos para la disección cerebro adulto, como se describe anteriormente Las figuras 2 y 3 son imágenes representativas de 3 días de edad WT. (Genotipo: w ¹¹¹⁸⁾ mosca adulta cerebros, que fueron costained con un anticuerpo contra tirosina hidroxilasa (TH , coloreado en rojo en la figura 2 y blanco en la figura 3), un marcador comúnmente utili...

Discusión

Con un creciente interés en el uso de adultos Drosophila cerebro para estudiar enfermedades humanas, los circuitos neuronales del cerebro y las funciones cerebrales superiores, es necesario desarrollar métodos simples y rápidos para obtener cerebros de moscas intactas para análisis de todo el montaje, lo cual es especialmente importante para a gran escalar las pantallas basadas en el cerebro. Nuestro método proporciona una forma sencilla y fácil de aprender enfoque para diseccionar una cabeza de mosca (a menudo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
w*;   parquey Delta; 21/TM3,  P{GAL4-Kr.C}DC2,  P{UAS-GFP. S65T}DC10,  Sb1	Bloomington Drosophila Stock Center	51652	El equilibrador se cambió a TM6B
PBac{WH}parkf01950	Exelixis en la Facultad de Medicina de Harvard	f01950	El equilibrador se cambió a TM6C
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
Bicarbonato de sodio (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-003-990
Cloruro de potasio (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Fosfato de sodio, monobásico monobásico (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-004-198
Cloruro de magnesio (MgCl2)	Fisher Scientific	02-003-265
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G	Reemplaza la glucosa
Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
EMD Millipore  Filtros de membrana de PVDF Durapore: hidrófilos: 0,22 y micro; m Tamaño de poro	Fisher Scientific	GVWP14250
Solución de formol, 10% (histológico)	Fisher Scientific	SF98-20
Fosfato de potasio, dibásico, polvo, biorreactivo ultrapuro	Fisher Scientific	02-003-823
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Excelta Pinzas de precisión con puntas muy finas	Fisher Scientific	17-456-055	El protocolo no requiere puntos muy finos.
Anticuerpo anti-tirosina hidroxilasa	Pel-Freez Biologicals	P40101
Rat-Elav-7E8A10	Anti-Elav Los Estudios del Desarrollo Hibridoma Banco	Clon 7E8A10
Anticuerpo secundario anti-rata IgG (H+L) contra cabras, conjugado Alexa Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-21247
Anticuerpo secundario anti-Rabbit IgG (H+L) para cabras, conjugado Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11037
Solución DAPI (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Polvo de galato de propilo	Sigma-Aldrich	P3130-100G
Glicerol ACS reactivo, ≥ 99.5%	Sigma-Aldrich	G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1	Zeiss	Quote
Zeiss Apotome.2	Zeiss	Quote
Zen lite software		Quote