El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas

secuenciación de Sanger ha sido tradicionalmente el estándar de oro en las pruebas de ambas mutaciones somáticas conocidos y desconocidos. Una de las limitaciones de secuenciación de Sanger es su límite de detección (~ 10 - 20% de alelo mutante en un fondo de WT) ^1. Este nivel de sensibilidad es apropiado para la detección de mutaciones somáticas bajo nivel que pueden estar presentes en las muestras de los tejidos premalignos o pacientes con pocas células tumorales circulantes, o cuando la médula ósea (BM) es irregular. Esto también hace que la evaluación de la enfermedad residual después de la terapia o la detección de mutaciones de resistencia emergentes durante el tratamiento difícil por secuenciación convencional solo ^2. Mediante la sustitución de PCR convencional con ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo salvaje bloqueo de PCR (WTB-PCR) en la secuenciación de Sanger, sensibilidades de hasta 0,1% alelo mutante en un fondo de WT pueden lograrse ^{2, 3, 4.} EnWTB-PCR, el enriquecimiento para los alelos mutantes se consigue mediante la adición de un corto (~ 10 - 14 NT) de bloqueo (LNA) oligonucleótido que se une preferentemente a ADN WT evitando de este modo la amplificación de ADN WT. El producto enriquecido WTB-PCR mutante puede ser entonces secuenciado. Mediante el bloqueo de DNA WT en lugar de seleccionar para mutaciones específicas WTB-PCR permite el enriquecimiento de ambas mutaciones conocidos y desconocidos presentes en fracciones de células minuto.

Múltiples métodos se utilizan actualmente para la detección de mutaciones en pequeñas fracciones células. Esto incluye PCR, el sistema específico de alelo de amplificación refractario a la mutación (ARMS), desnaturalización cromatografía líquida de alto rendimiento (DHPLC), cuentas, emulsiones, amplificación y magnetismo (BEAMing), la liberación inducida por el campo eléctrico y la medición (Efirm), de alta resolución punto de fusión y otros. Sin embargo, la mayoría de estos métodos están limitados por los falsos positivos y la capacidad de detectar sólo una mutación que el ensayo fue diseñado para ^{4 5, 6.}

Aquí se demuestra el incremento en la sensibilidad alcanzado por WTB-PCR en la detección de mutaciones en la diferenciación mieloide gen del factor 88 como se describe por Albitar et al. Mutatio ³ MYD88ns son importantes factores de diagnóstico y pronóstico en macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM gammapatía monoclonal de significado desconocido (IgM-GMSI), esplénica linfoma de la zona marginal (SMZL), y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). mutaciones MyD88 se encuentran en casi todos los casos de WM y aproximadamente el 50% de los pacientes con inmunoglobulina M (IgM) secretoras de GMSI. En contraste, las mutaciones MyD88 se encuentran en solamente 0-6% de los pacientes con SMZL y están ausentes en el mieloma múltiple ^{7, 8.} Debido a la superposición morfológica, inmunofenotípicos, citogenéticas y las características clínicas entre WM y SMZL o mieloma IgM-múltiple a menudo puede complicar el diagnóstico diferencial, la presencia de una mutación MYD88 puede servir como un factor de identificación útil ^9. MyD88 mutaciones también se han asociado con una mayor carga de la enfermedad en pacientes con DLBCL y la mala supervivencia global después de la terapia ^7, 10. Además, debido a mutaciones MyD88 se encuentran con más frecuencia en DLBCL activado de células B-como (ABC) de centro germinal de células B-como (GCB) DLBCL o linfoma mediastínico de células B primario (PMBL), estado de la mutación MYD88 puede servir como una marcador sustituto para el subtipo ABC ^{11, 12.}

El protocolo detallada proporcionada aquí sirve como una plantilla a partir de la que los nuevos ensayos pueden ser desarrolladas o la mayoría de los ensayos de secuenciación existentes se pueden adaptar fácilmente para detectar con precisión mutaciones de baja frecuencia en varios tipos de muestras. El enfoque también se puede utilizar para el seguimiento y la detección de mutaciones resistentes que se pueden desarrollar en tumores o incluso las bacterias que se pueden desarrollar mientras que los pacientes están siendo tratados con terapia dirigida o antibióticos. Además, que aborda y remedios muchos de los problemas asociados con el enriquecimiento de mutación, en particular en tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE).

Declaración de Ética: Todas las pruebas de muestras humanas se llevó a cabo después de obtener la aprobación Institutional Review Board (IRB).

1. Extracción de ADN a partir de FFPE de tejido, sangre periférica y la médula ósea Aspirar

1. Para el hueso tejido FFPE ósea con el kit de extracción de ADN FFPE
   1. Comienza con el tejido FFPE a partir de diapositivas no teñidas (5 - 10 secciones a 5 - 10 espesor m).
      NOTA: Si comienzo con virutas de tejido, el uso del 3 - 6 secciones a las 5 - espesor de 10 micras y vaya al paso 1.1.6.
   2. Colocar los portaobjetos en una cesta portaobjetos y preparar cuatro depósitos de lavado (dos para Xileno y dos para 100% de alcohol). Añadir un volumen mínimo de 600 ml de solución para cada cesta.
   3. Desparafinar las diapositivas haciendo un lavado xileno 5 min en la primera bandeja. Transferir los portaobjetos al segundo depósito de lavado xileno durante 5 min adicionales.
   4. Después de la desparafinación, lavar los portaobjetos con alcohol 100% durante 5 min. Transferir los portaobjetos a la segundadepósito de lavado con alcohol para un 5 minutos adicionales.
   5. Permitir que las diapositivas se sequen por completo bajo una campana antes de raspar con una hoja de afeitar en un tubo de microcentrífuga.
      NOTA: Si un tobogán H & E con la región del tumor indicado está disponible, alinee las diapositivas y raspar solamente la región del tumor.
   6. Continúe con las instrucciones del fabricante folleto incluido en el kit.
2. Para BM aspirado y sangre periférica
   1. Extracto de acuerdo con las instrucciones del fabricante folleto con estas especificaciones.
      NOTA: Hay numerosos kits y métodos para la extracción de ADN a partir de células y tejidos FFPE disponibles comercialmente. Prácticamente, todos pueden ser utilizados. Utilizar un método que se establece en el laboratorio.
      1. Utilice 200 sangre l periférica (PB) o 100! L BM + 100! L de PBS.
      2. Usar 4 l de RNasa una solución madre.
      3. Se eluyó con tampón de elución 100 l.
3. Cuantificación de ADN
   1. Medir las concentraciones de ADN utilizando un espectrofotómetro asegurar a / 280 nm relación de 260 nm de aproximadamente 1,8 (para el ADN puro). Si la relación es apreciablemente menor, puede indicar la presencia de proteína, fenol, u otros contaminantes que pueden interferir con las aplicaciones posteriores.
   2. Ajustar las concentraciones de ADN a aproximadamente el 50 - 100 ng / l con tampón de elución apropiado.

2. Wild-Type bloqueo PCR

1. Diseño de cebadores
   1. Diseño y obtener cebadores para genes de interés de acuerdo con la anteriormente describen directrices generales de PCR primer diseño ^13. Incluir M13-cebadores directo e inverso de secuenciación universales en los cebadores de PCR.
      NOTA: El ensayo MYD88 fue desarrollado para amplificar el exón 5 de MYD88 (G259 - N291) y 110 nucleótidos situada en la región 5' intrónica para cubrir el sitio de empalme y parte del intrón 4. El cebadores directo e inverso se diseñaron con un 5' -M13 secuencia (M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-inverso: cag gaa aca gct atg acc) para permitir la hibridación de los cebadores de secuenciación complementarios (véase Materiales Tabla).
2. Diseño de oligonucleótidos nucleico cerrado Ácido
   1. Diseñar el oligonucleótido de bloqueo a ser de aproximadamente 10 - 15 bases de longitud y complementario a la plantilla WT donde se desea el enriquecimiento de mutantes.
      NOTA: Un oligo más corto mejorará la discriminación desajuste. Para lograr una alta especificidad de la diana, es importante no usar demasiado nucleótidos de bloqueo ya que esto puede dar lugar a un oligonucleótido muy "pegajosa". El contenido y la longitud y el nucleótido de bloqueo debería ser optimizar de acuerdo con el nucleótido específico que necesitan ser bloqueado. Es importante para lograr una alta especificidad de unión sin comprometer la estructura secundaria y el riesgo de auto-complementariedad.
   2. Diseñar el oligo de bloqueo para tener una T _m 10 - 15 ° C por encima de la temperat extensiónUre durante el termociclado. Ajuste el T _m por adición o eliminación de bases de bloqueo o por sustitución de bases de bloqueo para el ADN, evitando largos tramos (3 - 4 bases) de bloqueo de G o C bases.
      1. Vaya al sitio web herramientas de oligo (véase la Tabla de Materiales) y seleccione la función "bloqueo Oligo Tm Predicción".
      2. Pegar la secuencia de la plantilla WT que se desea para ser bloqueado en el cuadro "Oligo Secuencia". Añadir "+" delante de las bases para indicar las bases de bloqueador.
      3. Seleccione el botón "Calcular" para determinar la aproximado _Tm del híbrido de ADN-bloqueante.
   3. Diseñar el oligo de bloqueo para evitar la formación de estructuras secundarias o auto-dímeros.
      1. Vaya al sitio web herramientas de oligo (véase la Tabla de Materiales) y seleccione la función "bloqueo Oligo Optimizer".
      2. Pegar la secuencia de la plantilla WT que se desea para ser bloqueado en el cuadro. Añadir "+" delante de las bases para indicar las bases de bloqueo.
      3. Seleccione las dos cajas para "Estructura Secundaria" y "Propio". Pulse el botón Analizar para revisar el oligo de estructuras secundarias potencialmente problemáticos o auto-dímeros.
         NOTA: Las puntuaciones representan cálculos muy aproximados de la _Tm 's de las estructuras secundarias y auto-dímeros. Las puntuaciones más bajas son, por tanto óptima y se pueden conseguir mediante la limitación de emparejamiento bloqueador-bloqueante. El oligonucleótido de bloqueo para MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] fue diseñado para cubrir los aminoácidos Q262-I266 y cuenta con un extremo 3 'invertida dT para inhibir tanto la extensión por la ADN polimerasa y la degradación por exonucleasa 3 '. Este oligo bloqueo específico es un 17 mer con 10 bases de bloqueo que se indican como "+ N". Los 7 bases restantes son nucleótidos de ADN ordinarios.
3. Configuración WTB-PCR y termociclado
   1. Preparar una WTB-PCR mi masterx (MMX) usando 2,5 l PCR tampón de reacción 10x w / 20 mM de _MgCl2, 250 mM dNTPs, 0,2 M hacia delante y cebador inverso, 1,2 M MYD88blocker, y DNAsa, libre de RNasa, H ultra-pura ₂ O para crear una final volumen de solución de 21,75 l por reacción.
      NOTA: Trabajar concentraciones son para el volumen de reacción final de 25 l (después de la adición de la plantilla de ADN y la polimerasa). Convencional PCR MMX se prepara simplemente omitiendo la adición de bloqueador. Todos los pasos del protocolo permanecen idénticas tanto para WTB y PCR convencional. Esto se puede utilizar en la validación y la determinación de enriquecimiento obtenido mediante la adición de bloqueador.
      1. Al calcular la cantidad de MMX para preparar asegurarse de dar cuenta de 3 reacciones adicionales (controles positivos y negativos y un control no plantilla para comprobar la contaminación) y al menos 1 de reacción adicional para el error de pipeteado.
   2. Vortex MMX a fondo. El MMX se puede almacenar a -80 ° C durante un máximo de Ayoreja.
   3. Añadir 0,25 l de Taq ADN polimerasa por reacción a la MMX e invierta para mezclar. Una vez que la polimerasa se ha añadido a la MMX, mantener en hielo.
   4. Poner una nueva placa de PCR 96 en un plato frío y la pipeta 22 l de MMX con polimerasa a cada pocillo de reacción.
   5. Añadir 3 l de ADN genómico (50 - 100 ng / l a cada uno de los pocillos que contienen el MMX con polimerasa.
   6. Sellar la placa y centrifugar brevemente para asegurar que la solución alcance la parte inferior de cada pocillo.
   7. Cargar la placa de PCR en un termociclador.
      1. Establecer las condiciones de termociclado para la reacción de WTB-PCR como sigue: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 6 min; 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, el cebador de recocido a 56 ° C durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 1 min 20 s; extensión final a 72 ° C durante 10 min.
         NOTA: La mejor práctica consiste en completar el resto del protocolo en una zona físicamente separada para evitar la contaminación amplicón in futuras configuraciones.
4. Realizar electroforesis en gel de acuerdo con los protocolos descritos previamente ¹⁴ con el fin de determinar si WTB-PCR fue un éxito y para confirmar la falta de amplificación en el control no plantilla.
5. La purificación del producto de PCR por perlas magnéticas
   1. Eliminar perlas magnéticas de 4 ° C y llevar a temperatura ambiente.
   2. Transferir 10 producto l PCR a una nueva placa de PCR.
   3. Vortex las perlas magnéticas vigorosamente para resuspender completamente de las partículas magnéticas.
   4. Añadir 18! L de perlas magnéticas a cada pocillo en la placa nueva. Pipeta de mezcla 10 veces.
   5. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   6. Coloque la placa de PCR sobre la placa de imán bordeado lateral durante 2 min a perlas separadas de la solución.
   7. Aspirar el sobrenadante con una pipeta multicanal, evitando el sedimento de perlas.
   8. Dispensar 150! L 70% de etanol en cada pocillo y se incuba a temperatura ambiente for al menos 30 s. Aspirar el etanol con una pipeta multicanal y desechar consejos. Repita este procedimiento de lavado una vez más.
   9. Usando una pipeta multicanal 20 l aspirar el etanol restante de cada pocillo y desechar consejos.
   10. Una vez los pocillos están secos (~ 10 min), retirar de la placa de imán y añadir 40 l de agua libre de nucleasa a cada mezcla bien y pipeta de 15 veces o vórtice suavemente.
   11. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
   12. Coloque la placa de PCR sobre la placa de imán para 1 min a perlas separadas de la solución.
   13. Transferencia de 35 l de producto purificado a una nueva placa de PCR. Esto es producto de PCR purificado está ahora listo para proceder con la secuenciación bidireccional o se puede almacenar a -20 ° C hasta que se necesite.
       NOTA: En el desarrollo de un nuevo ensayo, puede ser necesaria la cuantificación del producto de PCR purificado. De 1 - 3 ng / ADN amplicón l es óptima para la secuenciación bidireccional. Si la concentración es consistentemente baja, aumentar de productos y magnéticos perlas de PCR proportionalmente (1: 1,8). Si la concentración es siempre alta, se eluye con un mayor volumen de agua.

3. La secuenciación de WTB-PCR Producto

1. La secuenciación bidireccional
   NOTA: El siguiente protocolo es una forma modificada de las instrucciones del fabricante que ha sido optimizado para utilizar menos reactivos.
   1. Preparar adelante y atrás reacción de secuenciación se mezcla con 0,25 l Ready mezcla de reacción, 1,88 l Sequencing Buffer, 1,78 mu M M13-F o M13-R cebadores de secuenciación y añadir y ADNasa, libre de ARNasa, H ultra-pura ₂ O para crear una solución final volumen de 9 l por reacción. Esta mezcla de reacción de secuenciación se puede almacenar a -20 ° C durante un máximo de un año.
   2. Pipetear 9 l de la mezcla de reacción de secuenciación hacia adelante en cada pocillo de una nueva placa de PCR de 96 para la reacción de secuenciación hacia adelante. Repetir en una placa separada para la reacción de secuenciación inversa.
   3. Añadir 1 l de la purificado WTB-PCR producto to cada pocillo tanto en el avance y placas inversa.
   4. Sellar la placa y centrifugar brevemente para asegurar que la solución alcance la parte inferior de cada pocillo.
   5. Cargar la placa de PCR en un termociclador.
      1. Establecer las condiciones de termociclado para la reacción de secuenciación de la siguiente manera: 96 ° C durante 1 min; 30 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 50 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 4 min; mantener a 4 ° C hasta que esté listo para la purificación.
2. Purificar los productos de secuenciación
   1. Preparar una solución fresca 01:25 de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 100% de etanol.
   2. Se prepara una solución fresca de etanol al 70%.
   3. Añadir 30 l de acetato de sodio / 100% de solución de etanol a cada pocillo de ambos el avance y retroceso placas de secuenciación y mezcla de pipeta de 5 veces.
   4. Volver a sellar la placa y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min.
   5. Centrifugar la placa a 2.250 xg durante 15 min.
   6. Quitar el sellador de placas y se invierte sobre un desperdicioenvase.
      NOTA: Invertir sólo una o la pastilla puede aflojarse de los fondos de los pocillos.
   7. Coloque la placa invertida sobre una toalla de papel limpia y centrifugar a 150 xg durante 1 min.
   8. Añadir 150! L 70% de etanol a cada pocillo.
   9. Volver a sellar la placa y centrifugado a 2250 xg durante 5 min.
   10. Repita los pasos 3.2.6 y 3.2.7.
   11. Si los pozos no están completamente secos, permitir que se seque al aire a temperatura ambiente. Asegúrese de que las muestras se protegieron de la luz durante el secado.
   12. Añadir 10 l formamida a cada pocillo y pipeta de mezcla 10 veces. Volver a sellar la placa.
   13. Desnaturalizar en termociclador a 95 ° C durante 3 min, seguido de 4 ° C durante 5 min.
   14. Después de la desnaturalización, reemplazar el sellador de placas con un septos y la secuencia en la plataforma de secuenciación de acuerdo con las instrucciones del fabricante ^15.

4. Análisis de los resultados de la secuenciación

1. Visualizar trazas de secuenciación usando un dat secuenciaciónun software de análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante ¹⁶ y alinear a las respectivas secuencias de referencia. Alinear MYD88 a secuencia de referencia NCBI "NM_002468".

Una visión general conceptual de WTB-PCR durante la extensión se presenta en la Figura 1. Debido a que un único desajuste de nucleótidos en el híbrido bloqueador-DNA disminuye en gran medida su temperatura de fusión (? T m = 20 - 30 ° C), la amplificación del alelo WT está bloqueada mientras que el ADN plantilla mutante es libre para completar la extensión 17. De esta manera, el ADN mutante se amplifica exponencialmente mientras que el ADN WT se amplifica linealmente.

Una demostración del enriquecimiento mutante logrado por WTB-PCR se presenta en la Figura 2. El ADN genómico de pacientes con y sin mutaciones fueron probados por tanto convencionales como WTB-PCR y luego secuenciados para demostrar el enriquecimiento típico alcanzable por WTB-PCR y la falta de falsos positivos en el ADN WT. La concentración de trabajo de bloqueador que se usa en WTB-PCR MMX debe ser determinada por experimentos y s de titulaciónhould lograr el nivel deseado de enriquecimiento mutante mientras que no resulta en falsos positivos o el bloqueo de la amplificación del ADN WT completo. El análisis de secuenciación de producto WTB-PCR demuestra el enriquecimiento para el alelo mutante y un límite de detección en exceso de 0,5% alelo mutante en un fondo de WT en comparación con el 16% en PCR convencional 3.

Los efectos de este aumento de la sensibilidad en los ensayos clínicos pueden variar dependiendo de la cantidad relativa de células neoplásicas en las muestras ensayadas. En un estudio de comparación de métodos, el ensayo WTB-PCR descrito aquí ha demostrado que 64% de las mutaciones MyD88 se perdió por las pruebas convencionales de los pacientes con WM o GMSI 3.

Una característica caída en la intensidad de la señal (Figura 3) se ve a menudo si una concentración demasiado alta de bloqueador se utiliza o si post-PCR Purificación no pudo eliminar bloqueador antes de la secuenciación bidireccional. Este último se demuestra cuando purificación perla magnética está sustituido para la purificación enzimática. Aunque la purificación enzimática es una opción atractiva cuando se trabaja con números de muestra mayores, no es apropiado para su aplicación con WTB-PCR, ya que no puede quitar bloqueador de la solución antes de la secuenciación.

Un ejemplo de artefactos secuencia que se encuentra con frecuencia en el ADN derivado de FFPE como resultado de citosina desaminación (C: G> T: A) se presentan en la Figura 4 3, 18, 19, 20. Aunque las causas reales de desaminación de citosina, son poco conocidos, cualquier ensayo basado en la PCR que enriquece para alelos mutantes detectará estos artefactos de baja frecuencia 21, 22. Los falsos positivos debido a la DEAminación es mejor evitar partiendo de material de la plantilla de alta calidad; en los muchos casos en que esto no sea posible, el tratamiento con uracilo DNA glicosilasa (UDG) durante la extracción puede ayudar en limitar la frecuencia y la intensidad de los artefactos de desaminación. tratamiento con UDG de tejido FFPE durante la extracción (como parte del kit de ADN FFPE) sisas desaminados residuos de citosina evitando de este modo C inducida artificialmente: G> T: A mutaciones. Sin embargo, los residuos de 5-metilcitosina que con frecuencia se producen en los dinucleótidos CpG son desaminados a timina, que no puede ser escindido por UDG. Los artefactos de secuenciación resultantes son bastante reconocible y, a menudo aparecen como mutaciones en tándem como se ve en la Figura 4. Si ya se han extraído muestras, tratamiento con UDG se puede implementar en una extracción secundaria con la pérdida relativamente baja de ADN.

Figura 1: Conceptual Overview de WTB-PCR. A falta de coincidencia de un solo nucleótido en el híbrido Bloqueador de ADN-T disminuye m hasta 30 ° C. Mediante el diseño del oligonucleótido de bloqueo para tener una Tm de 10 - 15 ° C por encima de la temperatura durante la extensión, la amplificación de ADN WT está bloqueado al tiempo que permite la amplificación del ADN mutante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El ADN genómico de pacientes con y sin mutaciones fueron probados por tanto convencionales como WTB-PCR y luego secuenciados para demostrar el enriquecimiento típico alcanzable por WTB-PCR. Se seleccionó la concentración final de bloqueador que se usa para lograr WTB-PCR para lograr la máxima enriquecimiento mutante sin causar falsos positivos en el ADN WT o bloquear amplificación de WT ADN por completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Característico caída en la intensidad de la señal se ve cuando se utiliza enzimática de purificación de PCR en lugar de perlas magnéticas. Esto es probablemente porque la purificación enzimática no puede quitar bloqueador antes de la secuenciación bidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: C: G> T: v surgen A artefactos de secuenciación en el tejido FFPE cuando citosina o citosina metilada se desaminania formalina fijación en uracilo o timina, respectivamente. Uracil ADN glicosilasa (UDG) se puede escindir uracilo antes de WTB-PCR ayudando a reducir los artefactos de secuenciación. Sin embargo, timina resultante de desaminado 5-metilcitosina, que se produce con frecuencia en las islas CpG, no puede ser escindido por UDG. La disminución de la concentración de bloqueador que se usa en WTB-PCR puede ayudar a reducir la aparición de artefactos de secuenciación que no se remedian por tratamiento con UDG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.