Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula
En este artículo
Resumen
Resumen
El sistema nervioso se compone de una enorme gama de tipos neuronales distintas. Estas subpoblaciones neuronales se caracterizan por, entre otras características, sus morfologías dendríticas distintas, sus patrones específicos de conectividad axonal, y sus respuestas de disparo selectivo. Los mecanismos moleculares y celulares responsables de estos aspectos de la diferenciación durante el desarrollo son aún poco conocidos.
A continuación, describimos los protocolos combinados para el etiquetado y la caracterización de la conectividad estructural y la excitabilidad de las neuronas corticales. Modificación del protocolo de electroporación en el útero (IUE) permite el etiquetado de una población escasa de las neuronas. Esto, a su vez, permite la identificación y el seguimiento de las dendritas y axones de las neuronas individuales, la caracterización precisa de la ubicación laminar de proyecciones axonales, y el análisis morfométrico. IUE también se puede utilizar para investigar los cambios en la excitabilidad de lasDe tipo salvaje (WT) o neuronas genéticamente modificadas mediante la combinación con células enteras de grabación de rodajas agudas de cerebros electroporación. Estas dos técnicas contribuyen a una mejor comprensión del acoplamiento de la conectividad estructural y funcional y de los mecanismos moleculares que controlan la diversidad neuronal durante el desarrollo. Estos procesos de desarrollo tienen importantes implicaciones en el cableado axonal, la diversidad funcional de las neuronas, y la biología de los trastornos cognitivos.
Introducción
El desarrollo de estructuras dendríticas y axonales es una faceta importante de la regulación del circuito en el sistema nervioso, incluyendo en la corteza cerebral. Desempeña un papel crítico durante el cableado selectiva de las diversas subpoblaciones neuronales. Varios informes recientes han demostrado que, además de la conectividad, la diversidad molecular de las neuronas se refleja por la adquisición de modos muy específicos de disparo. Sin embargo, los mecanismos que determinan la excitabilidad y la conectividad de los subtipos neuronales distintas durante el desarrollo, así como su grado de coordinación, son aún poco conocidos 1,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los animales procedimientos fueron aprobados por la Comunidad de Madrid Cuidado de Animales y el empleo Comisión, de conformidad con la legislación nacional y europea (PROEX 118/14; 331/15 PROEX). Mantener condiciones estériles durante el procedimiento.
1. La electroporación en el útero
NOTA: Este protocolo para la IUE es una adaptación de otros que han sido previamente publicados 5, 6, 7. Este manuscrito describe un protocolo para la IUE de E15.5 embriones, con modificaciones en la estrategia reportero q....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Para caracterizar los cambios morfológicos de las neuronas en detalle y en todo el desarrollo, es esencial para etiquetar las neuronas escasamente. Un sistema Cre-recombinasa diluido permite la expresión de un gen de interés en una población escasa de las neuronas, de modo que sólo aquellas neuronas que incorporan esta enzima expresan GFP (Figura 1A). Con esta estrategia, la capa II-III está dirigido y etiquetado por IUE en E15.5. CAG-DsRed2 en 1 g / l, es co-electropora.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe con detalle cómo etiquetar las neuronas de la corteza somatosensorial de / 6 ratones C75BL con el fin de analizar su conectividad y su excitabilidad. Con respecto a los métodos existentes, visualiza los aspectos discriminatorios de conectividad, tales como el número de ramas axonales por neurona, su topografía precisa, y su localización anatómica. Mediante la alteración de la posición de los electrodos, es posible apuntar a otras poblaciones de neuronas, tales como la corteza cingulada (mantener .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos a R. Gutiérrez y A. Morales por su excelente asistencia técnica y a LA Weiss para su edición. CGB está financiado por el Ministerio español de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación BBVA y SAF2014-58598-JIN (MINECO) para M. Navarrete y por una beca de la Fundación Ramón Areces y subvenciones SAF2014-52119-R y BFU2014-55738-Redt (de MINECO) a M. Nieto.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmmido Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofeno (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurano (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Ketamina (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xilacina (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidona Yodada Meda | 694109.6 | Pomada | |
| Ocular (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | Gibco de Life Technologies | 24020-091 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Mango de bisturí # 3 - 12 cm | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Hojas de bisturí # 10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Pinzas Adson dentadas - Rectas 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 | |
| Tijeras finas endurecidas - Rectas 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Tijeras Mezenbaum-Nelson Curvadas L=14,5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Puntas curvas finas - Estilo 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Pinzas-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Portaagujas - | Dentado Fino Herramientas | de ciencia 12010-14 | |
| Aplicador de AutoClip | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | ||
| Suturas - Maquinilla de afeitar eléctrica Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Panasonic | ER 240 | ||
| Capilares de vidrio de borosilicato (100 mm, 1,0/0,58 diámetro exterior/interior) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Conjuntos de tubos aspiradores para pipetas microcapilares calibradas | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| Hisopos de algodón (Star Cott) | Albasa-Aguja | ||
| 25 g (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sacarosa | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldehído | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compuesto | Sakura | 4583 | |
| Plato de cultivo de tejidos 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Anticuerpo policlonal | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488 conjugado | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Suero fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Electroporador ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Electrodos de platino 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscopio para imagen fluorescente - MZ10F | Leica-VIP | ||
| 3000 Vaporizador de isofluorano | |||
| Sistema de escaneo láser | Leica-Axiovert | ||
| 200 Microscopio | Zeiss-Cryostat | ||
| - CM 1950 | |||
| micropette | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Análisis de abrazaderas de parche softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Dispositivos | moleculares-Software | |
| de adquisición (MultiClamp 700B Amplifier) | Dispositivos moleculares | DD1440A | |
| Micromanipulador motorizado + Base giratoria | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Mesa de aire | Newport-Bombas | ||
| peristálticas en miniatura | WPI | - |
Referencias
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheri....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
