Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes

Resumen

Se presenta un protocolo para la síntesis de 1,2-azaborinas y la preparación de sus complejos proteicos con mutantes de lisozima T4.

Resumen

Describimos una síntesis general de 1,2-azaborinas utilizando técnicas estándar de aire libre y preparación de complejos de proteínas con mutantes de lisozima T4 por difusión de vapor. Los compuestos sensibles al oxígeno y a la humedad se preparan y aíslan bajo una atmósfera inerte (N₂) utilizando un colector de gas de vacío o una guantera. Como ejemplo de síntesis de azaborina, demostramos la síntesis y purificación del volátil N-H-B-etil-1,2-azaborina mediante una secuencia de cinco pasos que incluye destilación y cromatografía en columna para el aislamiento de productos. Los mutantes de lisozima T4 L99A y L99A/M102Q se expresan con la cepa RR1 de Escherichia coli. Los protocolos estándar para la lisis celular química seguida de purificación mediante una columna de intercambio iónico de carboximetilo proporcionan proteínas de pureza suficientemente alta para la cristalización. La cristalización de proteínas se realiza en varias concentraciones de precipitante a diferentes rangos de pH utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante. La preparación compleja con las moléculas pequeñas se lleva a cabo mediante el método de difusión de vapor bajo una atmósfera inerte. El análisis de difracción de rayos X del complejo cristalino proporciona evidencia estructural inequívoca de interacciones de unión entre el sitio de unión a la proteína y las 1,2-azaborinas.

Introducción

El boro-heterociclos que contienen nitrógeno (es decir, 1,2-azaborines) recientemente han llamado la atención significativa como isosteras de arenos. Este isosterism puede conducir a la diversificación de los motivos estructurales existentes para ampliar el espacio químico ^{2, 3, 4.} Azaborines tienen utilidad potencial para la aplicación en la investigación biomédica ^{5, 6, 7, 8,} especialmente en el área de la química médica en la que los qu....

Protocolo

NOTA: Todas las manipulaciones de oxígeno y sensibles a la humedad se llevaron a cabo bajo una atmósfera inerte _(N2), utilizando cualquiera de las técnicas sin aire estándar o una caja de guantes. THF (tetrahidrofurano), Et ₂ O (éter dietílico), CH ₂ Cl ₂ (diclorometano), tolueno, y pentano se purificaron pasando a través de una columna de alúmina neutra en atmósfera de argón. El acetonitrilo se secó sobre CaH ₂ (hidruro de calcio) y se destiló bajo atmósfera de nitrógeno antes de su uso. Pd / C (paladio sobre carbono) se calentó a alto vacío a 100 ° C durante 12 h antes de su uso. El gel de sílice (malla 230-400....

Resultados

La vía de síntesis esquemático para 1,2-azaborines se muestra en la Figura 1. Este protocolo se aplica a la síntesis de cinco moléculas de nitrógeno que contiene boro diferentes. La Figura 2 representa los espectros de ¹¹ B NMR medida durante el curso de la etapa 1.3 para monitorizar la formación del producto deseado (3). Purificación de proteínas se realizó mediante el uso de sistema de cromatografía de baja presión y un crom.......

Discusión

En la primera parte de este protocolo, se describe una síntesis modificada de 1,2-azaborines basadas en métodos reportados previamente ^{12, 13.} Triallylborane ²² fue utilizado como un sustituto de las rutas usando allyltriphenyl estaño o de potasio allyltrifluoroborate para preparar N -allyl- N -TBS- B alil aducto de cloruro de (1). Este método permite un enfoque más átomos-económica y respetuosa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tetrahidrofurano (THF), sin inhibidores, para HPLC, ≥ 99.9%	Sigma Aldrich	34865
Éter dietílico (Et2O), para HPLC, ≥ 99.9%, sin inhibidores	Sigma Aldrich	309966
cloruro de metileno  (CH2Cl2), (Estabilizado/Certificado ACS)	Fisher	D37-20
Tolueno	Fisher	T290-4
Pentano, HPLC	Fisher	P399-4
Acetonitrilo	Fisher	A21-4
Hidruro de calcio (CaH2), grado reactivo, 95%	Sigma Aldrich	208027	Paladio pirofórico
sobre carbón activado (Pd/C), 10 % en peso de Pd	Strem	46-1900
1,0 M Solución de tricloruro de boro en hexano	Sigma Aldrich	211249	Trietilamina altamente tóxica/pirofórica
, ≥ 99.5%	Sigma Aldrich	471283
Grubbs 1st generación de catalizadores	materia	C823
Acetamida	Sigma Aldrich	A0500
n-Butanol, anhidro, 99.8%	Sigma Aldrich	281549
solución de etilitio, 0.5  M en benceno/ciclohexano	Sigma Aldrich	561452	altamente tóxico/pirofórico
, 2.0 M en Et2O	Sigma Aldrich	455180
2-metilbutano, anhidro, ≥ 99%	Sigma Aldrich	277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani y Chalmers (ATCC® 31343™)	ATCC	31343
T4 lisozima WT* (L99A)	Addgene	18476
T4 lisozima mutante (S38D, L99A, M102Q, N144D)	Addgene	18477
Ampicilina, sal sódica	Sigma Aldrich	A0166
isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)	Invitrogen	AM9464
Fosfato de sodio monobásico anhidro	Fisher	BP329
Fosfato de sodio dibásico anhidro	Fisher	BP332
Cloruro de sodio	Fisher	S642212
Ácido etilendiaminotetraacético	Fisher	BP118
Cloruro de magnesio	Sigma Aldrich	M4880	Corrosivo
Perforación termocientífica DNaseI	Fisher	PI-90083
GE Healthcare  Medios de intercambio catiónico de flujo rápido Sepharose	Fisher	45-002-931
Tris-base	Fisher	BP152-500
Azida sódica	TCI	S0489
2-Mercaptoetanol	Fisher	ICN806443
Sartorius  Vivaspin 20 Concentradores centrífugos	Fisher	14-558-501
Fosfato de potasio monobásico	Sigma Aldrich	P5379
2-disulfuro de hidroxietilo	Sigma Aldrich	380474
N-paratono	Hampton Research	HR2-643
4 RC Tubo de membrana de diálisis 12,000 a 14,000 Dalton MWCO	Pescador	08-667E
CryoLoop	Hampton Research		tubo criogénico en forma de bucle
CryoTong	Pinza criogénica	Thermo Fisher
Coot			Las imágenes de densidad de electrones se generan a partir del software

Solución de HCl , , altamente tóxico