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Artículo de método

Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes

7.2K vistas

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DOI:

10.3791/55154

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25 de marzo de 2017

 , 
1Department of Chemistry, Boston College

En este artículo

Resumen

Se presenta un protocolo para la síntesis de 1,2-azaborinas y la preparación de sus complejos proteicos con mutantes de lisozima T4.

Resumen

Describimos una síntesis general de 1,2-azaborinas utilizando técnicas estándar de aire libre y preparación de complejos de proteínas con mutantes de lisozima T4 por difusión de vapor. Los compuestos sensibles al oxígeno y a la humedad se preparan y aíslan bajo una atmósfera inerte (N2) utilizando un colector de gas de vacío o una guantera. Como ejemplo de síntesis de azaborina, demostramos la síntesis y purificación del volátil N-H-B-etil-1,2-azaborina mediante una secuencia de cinco pasos que incluye destilación y cromatografía en columna para el aislamiento de productos. Los mutantes de lisozima T4 L99A y L99A/M102Q se expresan con la cepa RR1 de Escherichia coli. Los protocolos estándar para la lisis celular química seguida de purificación mediante una columna de intercambio iónico de carboximetilo proporcionan proteínas de pureza suficientemente alta para la cristalización. La cristalización de proteínas se realiza en varias concentraciones de precipitante a diferentes rangos de pH utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante. La preparación compleja con las moléculas pequeñas se lleva a cabo mediante el método de difusión de vapor bajo una atmósfera inerte. El análisis de difracción de rayos X del complejo cristalino proporciona evidencia estructural inequívoca de interacciones de unión entre el sitio de unión a la proteína y las 1,2-azaborinas.

Introducción

El boro-heterociclos que contienen nitrógeno (es decir, 1,2-azaborines) recientemente han llamado la atención significativa como isosteras de arenos. Este isosterism puede conducir a la diversificación de los motivos estructurales existentes para ampliar el espacio químico 2, 3, 4. Azaborines tienen utilidad potencial para la aplicación en la investigación biomédica 5, 6, 7, 8, especialmente en el área de la química médica en la que los químicos llevar a cabo la síntesis de bibliotecas de moléculas estructuralmente y funcionalmente relevantes. Significativamente, sin embargo, si bien hay numerosas rutas sintéticas bien desarrollados a moléculas que contienen areno-disponibles, se han reportado sólo un número limitado de métodos para la síntesis de azaborines 9, 10, 11, 12, 13. Esto se debe principalmente a un número limitado de opciones para la fuente de boro y el aire y la naturaleza sensible a la humedad de la molécula en la fase inicial de la secuencia sintética.

En la primera parte de este artículo, describiremos una síntesis escala multi-gramo de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3) usando técnicas sin aire estándar. Este compuesto sirve como un intermedio versátil que puede ser además funcionalizado para estructuralmente más complejas moléculas 14, 15. A partir de 3, se describirán la síntesis y purificación de N -H- B etil-1,2-azaborine (5) para su uso en estudios de unión a proteínas. Debido a la volatilidad de 5, su aislamiento eficiente requiere un control preciso de la temperatura de reacción, tiempo, y distillation condiciones.

En la segunda parte, los protocolos para la expresión de proteínas y el aislamiento de mutantes T4 lisozima (L99A y L99A / M102Q) 17, 18, 19, se presentarán 20, seguido de la cristalización de proteínas y la preparación de los complejos de cristal de proteína-ligando. Mutantes de lisozima T4 L99A y L99A / M102Q fueron elegidos como modelo de los sistemas biológicos para examinar la capacidad de enlace de hidrógeno de las moléculas que contienen NH azaborine 17. El uso de un protocolo de biología molecular estándar, la proteína se expresa en la cepa Escherichia coli RR1 y indujo con isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). Purificación de proteínas se lleva a cabo usando cromatografía en columna de intercambio iónico. cristalización de proteínas se lleva a cabo con una solución altamente concentrada y purificada de proteínas (> 95% de pureza por electroforesis en gel) usando el colgantedeje caer método de difusión de vapor. Debido a la sensibilidad de los ligandos de este estudio para el oxígeno, los complejos proteína-ligando se preparan en condiciones libre de aire.

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Protocolo

NOTA: Todas las manipulaciones de oxígeno y sensibles a la humedad se llevaron a cabo bajo una atmósfera inerte (N2), utilizando cualquiera de las técnicas sin aire estándar o una caja de guantes. THF (tetrahidrofurano), Et 2 O (éter dietílico), CH 2 Cl 2 (diclorometano), tolueno, y pentano se purificaron pasando a través de una columna de alúmina neutra en atmósfera de argón. El acetonitrilo se secó sobre CaH 2 (hidruro de calcio) y se destiló bajo atmósfera de nitrógeno antes de su uso. Pd / C (paladio sobre carbono) se calentó a alto vacío a 100 ° C durante 12 h antes de su uso. El gel de sílice (malla 230-400) se secó durante 12 horas a 180 ° C bajo alto vacío. La cromatografía ultrarrápida se realizó con este gel de sílice bajo una atmósfera inerte. Todos los demás productos químicos y disolventes se adquirieron y utilizaron como se recibieron.

NOTA: Precaución, consulte todas las fichas de seguridad pertinentes (MSDS) antes de usar. Varios de los productos químicos utilizados en la síntesis de unare agudamente tóxico y cancerígeno.

1. Preparación de 1,2-Azaborines

NOTA: Los datos de caracterización de todos los compuestos en este estudio se ha informado anteriormente 12, 13, 16.

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Figura 1: esquema de síntesis de 1,2-azaborines. Los protocolos detallados para la síntesis de cada compuesto (1-5) se describen en la sección de protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparación de N -allyl- N -TBS- B aducto de cloruro de alil (1)
    1. En una caja de guantes, mida 6,70 g (50,0 mmol) triallylborane 22 24/40 en un matraz de 1 L de fondo redondo secado al horno equipado con una barra de agitación y añadir 250 ml de diclorometano. Sellar el matraz con un septum de goma. Fuera de la caja, se enfría la solución a -78 ° C bajo una atmósfera de nitrógeno en un colector de gas de vacío.
    2. Añadir 100 ml de solución 1,00 M de boro tricloruro (100 mmol) en hexano a la solución triallylborane a -78 ° C a través de la transferencia de la cánula. Deje que la mezcla de reacción de agitación a esta temperatura durante 4 h.
      NOTA: Precaución, tricloruro de boro es altamente reactivo con agua.
    3. En un matraz de 100 ml separados, mida 25,7 g de N - (t -butildimetilsililo) - N -allylamine (150 mmol) y se añaden 20,0 ml de diclorometano. Al matraz de reacción de 1 L, añadir esta solución a través de transferencia cánula manteniendo la temperatura de reacción a -78 ° C.
    4. Añadir 21,0 ml de trietilamina (150 mmol) a la reacción. Mantener la agitación bajo un flujo positivo de nitrógeno y deje que se caliente gradualmente a los transbordadoresdurante la noche la temperatura om.
    5. Después de 18 h de agitación, eliminar aproximadamente la mitad del disolvente a través de un colector de gas vacío usando alto vacío (300 a 500 mTorr) con una trampa de nitrógeno líquido.
    6. Tome el matraz de reacción en una caja de guantes y se separa por filtración la sal blanco formado en la mezcla de reacción a través de una frita de porosidad media secado al horno equipado con un adaptador de 24/40 de vacío y un matraz de fondo redondo de 24/40 500 con un revuelo bar. Utilice diclorometano para transferir todos los materiales restantes.
    7. Retire todos los volátiles restantes a partir del filtrado fuera de la caja utilizando un colector de gas de vacío con alto vacío.
    8. En una caja de guantes, la transferencia de la mezcla de reacción se concentró en un horno secados 14/20 100 ml matraz de fondo redondo con una barra de agitación para preparar la destilación. Se tapa el matraz con un septum.
    9. Bajo un flujo de nitrógeno, abrir rápidamente el tabique y añadir hidruro de calcio 200 mg como agente de secado.
    10. Preparar el aparato de destilación mediante la instalación de un horno-secado 14/20 cabeza de destilación unida con un termómetro, un lado con un 14/20 matraz de 50 ml de almacenamiento libre de aire recepción y el otro lado con el matraz de 100 ml que contenía producto bruto. Dotar a la cabeza de destilación con agua fría. (Use grasa para todas las articulaciones del aparato de destilación.)
      NOTA: El producto comienza a destilar cuando la temperatura del vapor alcanza 60 ° C a 300 mTorr.
    11. Continuar recoger el producto elevando la temperatura del baño de aceite hasta que el termómetro cabeza de destilación lee 75 ° C.
      NOTA: El producto es un líquido transparente e incoloro.
    12. Detener la destilación mediante la eliminación de la fuente de calor y enfriar el aparato a la temperatura ambiente antes de su almacenamiento. Después de enfriar, presurizar el aparato con nitrógeno y cerrar herméticamente la válvula de tapón en el frasco de almacenamiento gratuito al aire. Almacenar el producto aislado en un congelador de la guantera.
      NOTA: El rendimiento puede variar de 65% a 84%.
  2. Preparación de N -TBS- B -Cl producto de anillo cerrado (2)
    1. En una caja de guantes, mida 56,0 g N N -allyl- cloruro de -TBS- B alil aducto (1) (217 mmol) en un matraz de 1 L 24/40 de fondo redondo secado al horno con una barra de agitación y añadir 500 tolueno mL.
    2. Mide 1,79 g de catalizador de Grubbs 1 st generación (2,17 mmol).
    3. Añadir la parte a gota a la solución en agitación de 1 a temperatura ambiente en una caja de guantes catalizador. Purgar el cuadro durante la adición para eliminar el gas de etileno formado a partir de la reacción.
      NOTA: La reacción típicamente se completa en 30 minutos de haber cesado la evolución de gas. Como otro indicador de finalización, el color de la reacción habrá cambiado completamente de su inicial púrpura a marrón. En este punto, el producto puede ser aislado utilizando la destilación al vacío; véase la referencia 12 para más detalles. En este protocolo, se describe un solo recipiente, el procedimiento de dos etapas para la síntesis directa de 3.
  3. Preparación de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3)
    1. A la solución de reacción del producto de anillo cerrado (2) en tolueno, añadir 14,0 g de paladio sobre carbono (10% en peso de Pd, 13,2 mmol).
    2. Retirar el matraz de la caja y encajarlo con un condensador de reflujo 24/40 secado al horno que ha sido purgado con nitrógeno y equipado con agua fría.
    3. Calentar la reacción usando un baño de aceite a un reflujo vigoroso a 135 ° C mientras se agitaba.
    4. Después de mantener a reflujo durante 16 h, se enfría la reacción mediante la eliminación de el matraz del baño de aceite. Después de enfriar a temperatura ambiente, retirar una alícuota de 0,5 ml de la mezcla de reacción usando una jeringa equipada con una aguja de bloqueo Luer secado en horno. La transferencia de la alícuota de 0,5 ml a un tubo de RMN con tapa de rosca para analizar a través de 11 B 12 RMN.
      NOTA: El pico del producto deseado aparezca en ca. 35,5 ppm 12, mientras que el mater de partidaial pico aparece en ca. 42,9 ppm 12. Por lo general, en este punto 11 B RMN indica que la reacción es incompleta, con un pico de material de partida menor restante.
    5. Si la reacción es incompleta, llevar el matraz de reacción en una caja de guantes y añadir un adicional de 3,00 g de paladio sobre carbono (10% en peso de Pd, 2,82 mmol).
    6. Resubject la reacción a reflujo condiciones como se describe en 1.3.2 y 1.3.3.
    7. Después de 24 h más a reflujo, analizar otra alícuota de la reacción por 11 B RMN. En este punto, la reacción debe ser completa.
    8. Transferir al matraz de reacción a la guantera y pasar la mezcla de reacción a través de una columna de cromatografía flash desechable lleno de toallitas de papel. Recoger el filtrado de lavado con 50,0 ml de tolueno.
    9. Retire todos los volátiles del filtrado fuera de la caja en un colector de gas de vacío equipado con alto vacío.
      NOTA: La eliminación de los volátiles puede tardar 40 min to 90 min en función de la presión de vacío. Cuando el indicador de vacío lee la presión máxima, indica que la eliminación del disolvente se completa. Si bien la eliminación de disolvente, asegúrese de que el baño de agua por debajo del matraz se mantiene a temperatura ambiente durante la disipación de calor.
    10. En una caja de guantes, transferir la mezcla de reacción se concentró en un horno-seca 24/40 matraz de 250 ml de fondo redondo con una barra de agitación. Se tapa el matraz con un septum.
    11. eliminar rápidamente el tabique y añadir hidruro de calcio 200 mg como agente de secado.
    12. Preparar el aparato de destilación mediante la instalación de una cabeza de destilación 24/40 secado en horno adjunto con un termómetro, un lado con una recepción de 24/40 matraz de 100 ml de almacenamiento libre de aire y el otro lado con el matraz de 100 ml que contenía producto bruto. Dotar a la cabeza de destilación con agua fría. Utilice grasa para todas las articulaciones del aparato de destilación.
      NOTA: El producto empieza a destilar cuando la temperatura del vapor alcanza 65 a 70 ° C en 1000 mTorr con un aceitetemperatura del baño entre 90-100 ° C. El producto es un líquido transparente e incoloro.
    13. Detener la destilación mediante la eliminación de la fuente de calor y enfriar el aparato a la temperatura ambiente antes de su almacenamiento. Después de enfriar, presurizar el aparato con nitrógeno y cerrar herméticamente la válvula de tapón en el frasco de almacenamiento gratuito al aire. Almacenar el producto aislado en un congelador de la guantera a -30 ° C.
      NOTA: El rendimiento de la de un solo recipiente, el procedimiento de dos etapas es 52%.

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Figura 2: 11 B espectros de RMN para la formación de seguimiento de N -TBS- B -Cl-1,2-azaborine (3). A) N -Allyl- N -TBS-B-alil cloruro de aducto (1), el material para el anillo de metátesis de cierre de partida. B) La oxidación después de 16 h. (Producto de anillo cerrado que no ha reaccionado N -TBS- B -Cl (2) y isomerizado producto B vinil de anillo cerrado (2 ') junto con N-TBS-B-Cl-1,2-azaborine se muestran (3).) C) La oxidación después de 24 h adicionales. D) producto aislado (3) después de la purificación por destilación a vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparación de N -H- B OBu-1,2-azaborine (4)
    1. En una caja de guantes, mida 4,00 g de N- TBS -B- Cl-1,2-azaborine (3) (17,6 mmol) en un matraz de 100 ml de fondo redondo secado al horno con una barra de agitación y añadir 35 ml de acetonitrilo. Mide 1,14 g acetamida (19,3 mmol) y transferir al matraz de reacción. Sellar el matraz con un septum de goma.
    2. Retirar el matraz de reacción de la caja y en forma de una juntaven-seca 24/40 condensador de reflujo que ha sido purgado con nitrógeno y equipado con agua enfriada.
    3. La reacción se calienta a reflujo a 85 ° C en un baño de aceite con agitación.
    4. Después de 3 h a reflujo, se enfría la reacción mediante la eliminación de el matraz del baño de aceite. Después de enfriar a temperatura ambiente, eliminar el disolvente en un colector de gas de vacío equipado con alto vacío.
    5. Después de retirar los volátiles bajo vacío, volver a disolver el residuo de la reacción en 15,0 ml de THF. A esta solución añadir 3,21 ml de n-butanol (35,1 mmol).
    6. Se agita la reacción a temperatura ambiente durante 1 h.
    7. Eliminar el disolvente en un colector de gas de vacío equipado con alto vacío para obtener el producto bruto.
    8. En una caja de guantes, aislar el producto por cromatografía en columna de gel de sílice, utilizando una mezcla de pentano y éter dietílico (5: 1) como eluyente. Eliminar los volátiles de las fracciones que contienen el producto utilizando un colector de gas de vacío equipado con alto vacío para obtener el producto puro comoun sólido blanco.
      NOTA: El rendimiento puede variar de 82% a 87%.
  2. Preparación de N -H- B etil-1,2-azaborine (5)
    1. En una caja de guantes, mida 1,00 g de N- H -B- OBu-1,2-azaborine (4) (6,62 mmol) en un matraz de 100 ml de fondo redondo secado al horno con una barra de agitación y se añaden 25 ml de Et 2 O. Seal el matraz con un septum de goma y de lugar en N 2 en un colector de gas de vacío.
    2. En un matraz de 100 ml de fondo redondo secado al horno separado, añadir 26,5 ml de solución de etil-litio (0,5 M en benceno / ciclohexano, 13,2 mmol) en atmósfera de nitrógeno. Retirar la mezcla del disolvente (benceno / ciclohexano) a partir del reactivo etil-litio para evitar problemas con el aislamiento del producto deseado azaborine. Se vuelve a disolver el etil-litio sólido en 13,0 ml de Et 2 O.
      NOTA: Precaución: reactivos de organolitio son pirofóricos (inflamable en contacto con el aire o el agua). El producto deseado (5 ) Es particularmente volátil (PM = 106,96). Por lo tanto, se requiere la eliminación del disolvente de benceno / ciclohexano de reactivo etil-litio para el aislamiento eficaz del producto puro debido a la volatilidad similar con el producto deseado.
    3. Se enfría el matraz de reacción que contiene 4 a -30 ° C con un baño de enfriamiento.
    4. Añadir la solución de etil-litio al matraz de reacción a través de transferencia cánula a -30 ° C. Mantener la agitación a esta temperatura durante 1 h y dejar que se caliente lentamente a temperatura ambiente.
    5. Controlar la reacción en un 11 B RMN. (El pico intermedio deseado aparece a aproximadamente 39,8 ppm).
    6. Tras la finalización de la reacción, se enfría la reacción a -30 ° C y añadir una solución de HCl 6,62 ml (2,0 M en Et2O, 13,2 mmol). Agitar la reacción durante 1 h, mientras que lo que le permite calentar lentamente a temperatura ambiente.
    7. Eliminar el disolvente en un colector de gas de vacío equipado con un vacío bajo (20 a 25 Torr) para obtener la mezcla de producto en bruto.
    8. En una caja de guantes,aislar el producto mediante cromatografía en columna de gel de sílice, usando 2-metilbutano como eluyente. Retire el volátil en un colector de gas de vacío equipado con un vacío atenuada para obtener el producto puro como un líquido incoloro.
      NOTA: El rendimiento es del 56%.

2. Preparación y cristalización de proteínas de mutantes de lisozima T4

  1. expresión y purificación de proteínas
    1. Se cultivan las células E. coli RR1 transformado con los plásmidos subclonados (L99A o L99A / M102Q) 17, 20 en 200 ml de LB (caldo de lysogeny) suplementado con 40,0 mg de ampicilina a 37 ° C durante 12 h.
      NOTA: La composición de los medios LB es 12 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, cloruro de sodio 10 g, y 1 g de glucosa por 1 LH 2 O.
    2. Inocular 4.00 medios L LB (suplementado con 800 mg de ampicilina) con 160 ml de cultivo de una noche y se incuba a 37 ° C a 240 rpm con un filteresuministro de aire d.
    3. Cuando la densidad óptica alcanza 0,7 a 600 nm, enfriar el cultivo bacteriano a la temperatura ambiente mediante la eliminación de la incubadora.
    4. Medir 695 mg de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) (concentración final de 0,7 mM) en un tubo de centrifugación cónico y añadir 4 ml de medio LB a disolverse.
    5. Añadir la solución de IPTG al cultivo para inducir la expresión de la proteína. Se incuban los cultivos a 110 rpm durante 21 horas a 25 ° C.
    6. Se centrifuga el cultivo a 4.412 xg durante 30 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 300 ml de fosfato de sodio 0,1 M (pH 6,6), 0,2 M NaCl y añadir 30,0 ml de ácido 0,5 M etilendiaminotetraacético (EDTA) (pH 8,0). Se agita la suspensión durante 17 horas a 4 ° C.
    7. Añadir 30,0 ml de 1,0 M MgCl 2 y 0,500 ml de desoxirribonucleasa I (ADNasa I) a la suspensión y se agita a temperatura ambiente durante 8 h.
    8. Centrifugar la suspensión de células lisadas a 30.913 xg durante 30 min a 4 76; C. Recoger el sobrenadante que contiene proteína expresada y desechar el sedimento.
    9. Se dializa el lisado frente a fosfato 20 mM de sodio (pH 6,5 para L99A y pH 6,3 para L99A / M102Q) a 4 ° C durante la noche.
    10. Lavar y equilibrar 20,0 ml de perlas de intercambio de iones de carboximetilo con tampón de equilibrado (Tris 50 mM, EDTA 1 mM (pH 7,3)) en una columna. Cargar la proteína solución que contiene sobre las perlas y se lava la columna con 100 ml del tampón de equilibrado. Eluir la columna con un gradiente de 600 ml lineal de NaCl 300 mM en el tampón de equilibrado.
    11. Utilice un sistema de cromatografía de baja presión para la purificación en columna. Utilice una velocidad de bombeo de 1 ml / min y recoger fracciones de 10 ml. Reunir las fracciones que contienen proteína pura.
      NOTA: Durante la elución, controlar la densidad óptica (DO) a 280 nm para verificar la presencia de la proteína. Determinar la pureza de cada fracción por SDS-PAGE y recoger solamente las fracciones más puras.
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Figura 3: Los resultados representativos para la purificación de proteínas de la T4 lisozima mutante L99A / M102Q. A) cromatograma que muestra la absorbancia UV medido en AU a 280 nm (línea azul) y la conductividad en mS / cm (línea roja). Las fracciones 20-23 se combinaron y la pureza se determinó por SDS-PAGE. B) 15% de gel de SDS-PAGE que muestra la presencia de proteína purificada de las fracciones 20-23 en 18,6 kDa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. cristalización de proteínas
    1. Transferir la solución de proteína purificada a un tubo de membrana de diálisis (12.000 a 14.000 MWCO). Colocar el tubo de diálisis en un vaso de precipitados que contiene 4,00 l de fosfato de sodio 100 mM, NaCl 550 mM, 0,02% NaN 3 (pH 6,5 para L99A y pH 6,3 para la L99A / M102). Se agita la solución de 4 L noche a 4 ° C.
    2. Añadir 2-mercaptoetanol (concentración final de 5 mM) a la muestra dializada y se concentra para ~ 40,0 mg / ml usando un concentrador centrífugo (10.000 MWCO). Determinar la concentración de proteínas mediante la medición de la absorción a 280 nm. Eliminar cualquier precipitado por centrifugación antes de la cristalización.
    3. Utilice el método de la gota pendiente vapor de difusión para la cristalización de proteínas. Mezclar 5,00 l de la solución de proteína concentrada con 5,00 l de la solución de reserva (2,0 a 2,2 / M de fosfato de sodio de potasio, pH 6.7 a 7.1, 50 mM 2-mercaptoetanol, 50 mM 2-hidroxietil disulfuro) en un portaobjetos de cubierta de vidrio siliconado.
    4. Equilibrar la caída de mezcla contra 1,00 ml de la solución de depósito mediante la colocación de la tapa deslizante boca abajo encima de la solución de depósito que contiene cada pocillo. Utilice grasa para sellar herméticamente cada pocillo con la corredera. Configurar varias condiciones utilizando una placa de 24 pocillos con solución de depósito mencionado en el punto 2.2.3.Almacenar la placa a 4 ° C para el crecimiento de cristales.
      NOTA: Los cristales crecen normalmente dentro de 1-2 semanas en el búfer completo equilibrado en la tapa deslizante. precipitación inmediata durante la mezcla solución de proteína con la solución de depósito en el paso 2.2.3 indica el fracaso de la cristalización.

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Figura 4: imagen representativa de los cristales de lisozima T4 L99A mutante antes de la formación de complejos con ligandos. Los cristales son en el licor madre (2,1 M / fosfato de sodio de potasio, pH 6,9, 50 mM 2-mercaptoetanol, 50 mM 2-hidroxietil disulfuro). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. preparación de complejo
    1. Recoger los cristales utilizando una forma en un bucle de tubo criogénico (ver Lista de Materiales) ycolocarlos en un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Añadir 50,0 l de licor madre al tubo para evitar la sequedad y preservar los cristales.
      NOTA: la selección de cristal único es ayudada por el uso de un microscopio.
    2. Transferir el tubo que contiene cristales en una caja de guantes. Tome 5,00 l de ligando azaborine (5) y el lugar en el interior del complemento tapón del tubo. Tapa y almacenar el tubo en un refrigerador (4 ° C) en el interior de la guantera durante 2-7 días para el equilibrado por la difusión del vapor.
      NOTA: Las propiedades físicas (alta volatilidad y solubilidad en solución acuosa) del ligando azaborine (5) permite la formación de complejos con los cristales de proteína preformados mediante el método de difusión de vapor.
    3. La transferencia de los cristales utilizando una forma en un bucle a un portaobjetos de vidrio que contiene una gota de N-Paratone antes de flash-congelación en nitrógeno líquido tubo criogénico. Recoger el cristal protegido con N-Paratone y rápida de flash-congelación al sumergirse en el cristalbucle en un dewar que contiene nitrógeno líquido. Montar el cristal en bucle mediante el uso de una tenaza criogénico.
    4. Reunir conjuntos de datos de un solo cristal utilizando radiación sincrotrón. Realizar la sustitución molecular utilizando estructuras publicadas 20, 24; verificar la existencia de ligando en el sitio de unión de proteínas por una mancha-un modelo de densidad de electrones.

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Figura 5: modelos atómicos de mutante L99A T4 lisozima bolsillo de unión con la densidad de electrones. A) L99A cavidad con una gota de densidad de electrones no-modelado en el sitio de unión. B) L99A cavidad con el ligando azaborine modelada 5 en dos confórmeros alternativos. Por favor, click aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

La vía de síntesis esquemático para 1,2-azaborines se muestra en la Figura 1. Este protocolo se aplica a la síntesis de cinco moléculas de nitrógeno que contiene boro diferentes. La Figura 2 representa los espectros de 11 B NMR medida durante el curso de la etapa 1.3 para monitorizar la formación del producto deseado (3). Purificación de proteínas se realizó mediante el uso de sistema de cromatografía de baja presión y un crom...

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Discusión

En la primera parte de este protocolo, se describe una síntesis modificada de 1,2-azaborines basadas en métodos reportados previamente 12, 13. Triallylborane 22 fue utilizado como un sustituto de las rutas usando allyltriphenyl estaño o de potasio allyltrifluoroborate para preparar N -allyl- N -TBS- B alil aducto de cloruro de (1). Este método permite un enfoque más átomos-económica y respetuosa...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos en este manuscrito.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud NIGMS (R01-GM094541) y Boston College.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tetrahidrofurano (THF), sin inhibidores, para HPLC, ≥ 99.9%Sigma Aldrich34865
Éter dietílico (Et2O), para HPLC, ≥ 99.9%, sin inhibidoresSigma Aldrich309966
cloruro de metileno  (CH2Cl2), (Estabilizado/Certificado ACS)FisherD37-20
ToluenoFisherT290-4
Pentano, HPLCFisherP399-4
AcetonitriloFisherA21-4
Hidruro de calcio (CaH2), grado reactivo, 95%Sigma Aldrich208027Paladio pirofórico
sobre carbón activado (Pd/C), 10 % en peso de PdStrem46-1900
1,0 M Solución de tricloruro de boro en hexanoSigma Aldrich211249Trietilamina altamente tóxica/pirofórica
, ≥ 99.5%Sigma Aldrich471283
Grubbs 1st generación de catalizadores materiaC823
AcetamidaSigma AldrichA0500
n-Butanol, anhidro, 99.8%Sigma Aldrich281549
solución de etilitio, 0.5  M en benceno/ciclohexanoSigma Aldrich561452altamente tóxico/pirofórico
, 2.0 M en Et2OSigma Aldrich455180
2-metilbutano, anhidro, ≥ 99%Sigma Aldrich277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani y Chalmers (ATCC® 31343™)ATCC31343
T4 lisozima WT* (L99A)Addgene18476
T4 lisozima mutante (S38D, L99A, M102Q, N144D)Addgene18477
Ampicilina, sal sódicaSigma AldrichA0166
isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) InvitrogenAM9464
Fosfato de sodio monobásico anhidroFisherBP329
Fosfato de sodio dibásico anhidroFisherBP332
Cloruro de sodioFisherS642212 
Ácido etilendiaminotetraacéticoFisherBP118
Cloruro de magnesioSigma AldrichM4880Corrosivo
Perforación termocientífica DNaseIFisherPI-90083
GE Healthcare  Medios de intercambio catiónico de flujo rápido SepharoseFisher45-002-931
Tris-baseFisherBP152-500 
Azida sódicaTCIS0489
2-MercaptoetanolFisherICN806443 
Sartorius  Vivaspin 20 Concentradores centrífugosFisher14-558-501
Fosfato de potasio monobásicoSigma AldrichP5379
2-disulfuro de hidroxietiloSigma Aldrich380474
N-paratono Hampton ResearchHR2-643
4 RC Tubo de membrana de diálisis 12,000 a 14,000 Dalton MWCO Pescador08-667E
  CryoLoopHampton Researchtubo criogénico en forma de bucle
CryoTongPinza criogénicaThermo Fisher
CootLas imágenes de densidad de electrones se generan a partir del software
Solución de HCl , , altamente tóxico

Referencias

  1. Ducruix, A., Giége, R. Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, A Practical Approach. , IRL Press. Oxford, UK, New York. (1992).
  2. Bosdet, M. J. D., Piers, W. E. B-N as a C-C substitute in aromatic systems. Can. J. Chem. 87 (1), 8-29 (2009).
  3. Campbell, P. G., Marwitz, A. J., Liu, S. -Y. Recent Advances in Azaborine Chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 51 (25), 6074-6092 (2012).
  4. Wang, X. -Y., Wang, J. -Y., Pei, J. B. N. Heterosuperbenzenes: Synthesis and Properties. Chem. Eur. J. 21 (9), 3528-3539 (2015).
  5. Zhou, H. -B., et al. Elemental isomerism: a boron-nitrogen surrogate for a carbon-carbon double bond increases the chemical diversity of estrogen receptor ligands. Chem. Biol. 14 (6), 659-669 (2007).
  6. Ito, H., Yumura, K., Saigo, K. Synthesis, characterization, and binding property of isoelectronic analogues of nucleobases, B(6)-substituted 5-aza-6-borauracils and -thymines. Org. Lett. 12 (15), 3386-3389 (2010).
  7. Vlasceanu, A., Jessing, M., Kilburn, J. P. BN/CC isosterism in borazaronaphthalenes towards phosphodiesterase 10A (PDE10A) inhibitors. Bioorg. Med. Chem. 23 (15), 4453-4461 (2015).
  8. Rombouts, F. J., Tovar, F., Austin, N., Tresadern, G., Trabanco, A. A. Benzazaborinines as Novel Bioisosteric Replacements of Naphthalene: Propranolol as an Example. J. Med. Chem. 58 (23), 9287-9295 (2015).
  9. Culling, G. C., Dewar, M. J. S., Marr, P. A. New Heteroaromatic Compounds. XXIII. Two Analogs of Triphenylene and a Possible Route to Borazarene. J. Am. Chem. Soc. 86 (6), 1125-1127 (1964).
  10. White, D. G. 2-Phenyl-2,1-borazarene and Derivatives of 1,2-Azaboracycloalkanes. J. Am. Chem. Soc. 85 (22), 3634-3636 (1963).
  11. Ashe III, A. J., Fang, X. A Synthesis of Aromatic Five- and Six-Membered B−N Heterocycles via Ring Closing Metathesis. Org. Lett. 2 (14), 2089-2091 (2000).
  12. Marwitz, A. J. V., Matus, M. H., Zakharov, L. N., Dixon, D. A., Liu, S. -Y. A Hybrid Organic/Inorganic Benzene. Angew. Chem. Int. Ed. 48 (5), 973-977 (2009).
  13. Abbey, E. R., Lamm, A. N., Baggett, A. W., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Protecting Group-Free Synthesis of 1,2-Azaborines: A Simple Approach to the Construction of BN-Benzenoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12908-12913 (2013).
  14. Rudebusch, G. E., Zakharov, L. N., Liu, S. -Y. Rhodium-catalyzed boron arylation of 1,2-azaborines. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (35), 9316-9319 (2013).
  15. Brown, A. N., Li, B., Liu, S. -Y. Negishi Cross-Coupling Is Compatible with a Reactive B-Cl Bond: Development of a Versatile Late-Stage Functionalization of 1,2-Azaborines and Its Application to the Synthesis of New BN Isosteres of Naphthalene and Indenyl. J. Am. Chem. Soc. 137 (28), 8932-8935 (2015).
  16. Knack, D. H. BN/CC Isosteric Compounds as Enzyme Inhibitors: N- and B-Ethyl-1,2-azaborine Inhibit Ethylbenzene Hydroxylation as Non-Convertible Substrate Analogs. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (9), 2599-2601 (2013).
  17. Eriksson, A. E. Response of a Protein Structure to Cavity-Creating Mutations and Its Relation to the Hydrophobic Effect. Science. 255 (5041), 178-183 (1992).
  18. Eriksson, A. E., Baase, W. A., Wozniak, J. A., Matthews, B. W. A cavity-containing mutant of T4 lysozyme is stabilized by buried benzene. Nature. 355 (6358), 371-373 (1992).
  19. Morton, A., Baase, W. A., Matthews, B. W. Energetic Origins of Specificity of Ligand Binding in an Interior Nonpolar Cavity of T4 Lysozyme. Biochemistry. 34 (27), 8564-8575 (1995).
  20. Wei, B. Q., Baase, W. A., Weaver, L. H., Matthews, B. W., Shoichet, B. K. A Model Binding Site for Testing Scoring Functions in Molecular Docking. J. Mol. Biol. 322 (2), 339-355 (2002).
  21. Lee, H., Fischer, M., Shoichet, B. K., Liu, S. -Y. Hydrogen Bonding of 1,2-Azaborines in the Binding Cavity of T4 Lysozyme Mutants: Structures and Thermodynamics. J. Am. Chem. Soc. 138 (37), 12021-12024 (2016).
  22. Brown, H. C., Racherla, U. S. Organoboranes. 43. A Convenient, Highly Efficient Synthesis of Triorganylboranes via a Modified Organometallic Route. J. Org. Chem. 51 (4), 427-432 (1986).
  23. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  24. Liu, L., Baase, W. A., Matthews, B. W. Halogenated Benzenes Bound within a Non-polar Cavity in T4 Lysozyme Provide Examples of I.S and I.Se Halogen-bonding. J. Mol. Biol. 385 (2), 595-605 (2009).

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Síntesis de 1,2-Azaborines y la preparación de sus complejos de proteínas con lisozima T4 Mutantes
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