Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Resumen

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ _Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 ^+), lo que les permite dar forma Ca ²⁺ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca ²⁺ absorción y ΔΨ _m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Resumen

Aparte de su papel esencial en la generación de ATP, las mitocondrias también actúan como amortiguadores de calcio locales para regular fuertemente la concentración intracelular ^de Ca2 ⁺ (Ca2 ^+). Para hacer esto, mitocondrias utilizan el potencial electroquímico a través de su membrana interna (ΔΨ _m) para secuestrar Ca ^{2 +.} La afluencia de Ca2 ⁺ en la mitocondria estimula tres deshidrogenasas que limitan la velocidad del ciclo del ácido cítrico, el aumento de la transferencia de electrones a través de la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) complejos. Esta estimulación mantiene ΔΨ _m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial.

Se describe aquí un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca ²⁺ absorción y ΔΨ _m en células vivas mediante microscopía confocal. Por permeabilización de las células, Ca ^{2 +} mitocondrial puedemedirse utilizando el Ca ^{2 +} indicador fluorescente Fluo-4 AM, con la medición de ΔΨ _m usando el colorante fluorescente tetrametilrodamina, éster metílico, el perclorato (TMRM). El beneficio de este sistema es que hay muy poco solapamiento espectral entre los colorantes fluorescentes, lo que permite una medición precisa de Ca ^{2 +} mitocondrial y ΔΨ _m simultáneamente. Uso de la adición secuencial de Ca ²⁺ alícuotas, Ca ^{2 +} mitocondrial captación pueden ser monitoreados, y la concentración a la que Ca2 ⁺ induce la transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la pérdida de ΔΨ _m determinado.

Introducción

Las mitocondrias juegan un papel importante en la regulación de la concentración intracelular de Ca2 ^+, actuando como locales Ca ^{2 +} buffers ^1. Ca ²⁺ entra en la mitocondria a través de la uniporter Ca2 ^+, un proceso impulsado por el gradiente electroquímico que existe a través de la membrana interna mitocondrial (ΔΨ _m) ^2. Una vez dentro de la matriz mitocondrial, Ca ²⁺ puede activar la fosforilación oxidativa mediante la estimulación de tres deshidrogenasas limitantes de la velocidad del ciclo del ácido cítrico ^3. Esta estimulació....

Protocolo

1. Preparación de las células

1. Se cultivan las células en 10 cm placas de cultivo celular o 75 cm ² frascos en medios de cultivo [10 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1 x penicilina / estreptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Para cosechar las células, retirar el medio por aspiración, luego se lava con 5 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS 1x). Eliminar 1x PBS por aspiración, a continuación, añadir 1,5 ml 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a 37 ° C / 5% de _CO2 durante 2 min. Toque pl....

Resultados

Hemos utilizado este protocolo para examinar los efectos de una mutación de MT-ND5 en la capacidad de las mitocondrias de células 143B para amortiguar los aumentos en el calcio ^12. En el ejemplo que se muestra aquí, las células 143B de control se cargaron con TMRM y Fluo-4 AM antes de permeabilización con digitonina. Después de 5 min de formación de imágenes, ocho adiciones secuenciales de un 1: se hicieron dilución 100 de 40 mM CaCl ₂ exógenos.......

Discusión

El calcio juega un papel fundamental en muchos procesos celulares, incluyendo la contracción muscular, la señalización neuronal y la proliferación celular ^13. Los aumentos en las concentraciones de calcio de células se asocian a menudo con la demanda de energía, con el calcio capaz de estimular directamente la fosforilación oxidativa mitocondrial para aumentar la generación de ATP ^3. Por tanto, es esencial que tengamos la capacidad de controlar con eficacia la acumulación .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher	10566016
suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher
1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicilina/estreptomicina (p/s)	ThermoFisher	15140122
0,25 % de tripsina/0,25 % de EDTA	ThermoFisher
cubreobjetos de 8 pocillos	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malato	Sigma-Aldrich	M1000
glutamato	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ libre Hank' s solución salina tamponada (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamilo	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoximetimetil éster (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimetilsulfóxido (DMSO)	ThermoFisher	D12345
cianuro de carbonilo p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonina	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hematitómetro	VWR	631-0925
placas de cultivo celular de 10 cm	Corning	COR430167
matraces de cultivo celular de 75 cm2	Corning	COR430641

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