Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes de células que expresan receptores de proteína verde fluorescente con etiquetas de tipo 1a angiotensina durante la endocitosis iniciados por el tratamiento de la angiotensina II. Esta técnica incluye los lisosomas de etiquetado con un segundo marcador fluorescente, y luego utilizando software para analizar la co-localización de receptor y lisosoma en tres dimensiones con el tiempo.

Resumen

Imágenes de células vivas se utiliza para capturar simultáneamente imágenes con lapso de tiempo de los receptores de angiotensina de tipo 1a (AT _1a R) y los compartimentos intracelulares en células embrionarias humanas transfectadas de riñón 293 (HEK) después de la estimulación con angiotensina II (Ang II). Células HEK se transfectaron transitoriamente con ADN de plásmido que contiene a ₁ A R etiquetado con la proteína verde fluorescente (EGFP). Los lisosomas se identifican con un colorante fluorescente rojo. imágenes de células vivas son capturados en un microscopio confocal de barrido con láser después de la estimulación Ang II y se analizaron por software en tres dimensiones (3D, voxels) con el tiempo. imágenes de células vivas permite investigaciones sobre el tráfico del receptor y evita confusiones asociados a la fijación, y, en particular, la pérdida o el desplazamiento artefactual de los receptores de membrana EGFP-etiquetados. Por lo tanto, como células individuales se realiza un seguimiento a través del tiempo, la localización subcelular de los receptores se pueden obtener imágenes y medido. Las imágenes deben ser adquiridos sufficiently rápidamente para capturar el movimiento de vesículas rápida. Sin embargo, a velocidades de formación de imágenes más rápidas, se reduce el número de fotones recogidos. Los compromisos también se deben hacer en la selección de parámetros de imagen como el tamaño de vóxel con el fin de ganar velocidad de formación de imágenes. aplicaciones significativas de imágenes de células vivas son estudiar el tráfico de proteínas, migración, proliferación, ciclo celular, apoptosis, autofagia y la interacción proteína-proteína y la dinámica, por nombrar sólo unos pocos.

Introducción

El objetivo general es obtener evidencia cuantitativa en tiempo y espacio de la colocalización del receptor con orgánulos subcelulares específicos después del tratamiento con un agonista del receptor. Por lo tanto, el objetivo inmediato aquí es capturar de lapso de tiempo imágenes confocales de lisosomas y un transmembrana del receptor en células de riñón embrionario humano (HEK) después de la transfección y de montar y analizar posteriormente los datos de imágenes en 3D para medir cuantitativamente la entrega de receptor a lisosomas. Investigando el tráfico simultáneo de un receptor transmembrana con los lisosomas u otros orgánulos durante la endocitosis cuando son ....

Protocolo

Día uno

Siembra 1. celular

1. Preparar Eagle modificado medio completo de Dulbecco (DMEM). Añadir 50 ml de suero fetal bovino, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de L-glutamina a 450 ml de DMEM para hacer 500 ml de DMEM completo complementado con suero bovino fetal (10%), penicilina / estreptomicina (1%) y L-glutamina (1%).
2. Se siembran las células embrionarias humanas de riñón (HEK), número 6-11 pasaje a 50.000 / pocillo en un sistema cubreobjetos 8 y cámaras en DMEM completo.
3. Mantener la diapositiva cámaras a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de _CO2 durante 24 h.

Resultados

En este conjunto representativo de los experimentos, las células HEK fueron transfectadas con receptor de angiotensina tipo 1a (AT _1a R-GFP) construcción (E1,2,3 _AT-1a R) clonado en el plásmido pEGFP-N2 ^13. Imágenes con lapso de tiempo de HEK fueron adquiridas y se reproducen como una película (Ver imágenes de células vivas 1 y 2 imágenes de células vivas películas). Las películas y fotografías muestran que d.......

Discusión

Los experimentos preliminares presentados aquí ilustran que durante un transcurso de tiempo bastante corto de 24 min, no se produjo ningún cambio apreciable en la entrega de AT _1a R-GFP a los lisosomas. En general, la entrega de los receptores internalizados a los lisosomas podría ocurrir tan pronto como 15-20 min. Este experimento es consistente con la hipótesis de que la mayor parte de la internalizado AT _1a R está dirigido a los endosomas grandes, perinuclear. La evidencia de que al menos alguno.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Angiotensina II (Ang II)	Sigma-Aldrich	A9525
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)	Gibco -ThermoFisher Scientific	11960-044	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Penicilina Estreptomicina (Pen Strep)	Gibco -ThermoFisher Scientific	15140-122	Calentar en 37 ° C baño de agua antes
de usar L-Glutamina 200 mM (100x)	Gibco (life technologies)	25030-081	Caliente en 37 ° C baño de agua antes
de usar Riñón embrionario humano (HEK)-293 células Colección de	cultivo tipo americano (ATCC)	CRL-1573	Pasaje número 5 - 12
Nunc Lab-Tek II con cámara 1.5 Sistema de cubreobjetos alemán	Sigma-Aldrich	155409
Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección	ThermoFisher Scientific	11668019	Almacene a 4 & grados; C
Opti-MEM, Suero Reducido Medio	Gibco- ThermoFisher Scientific	31985-070	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar PBS 10x	Fisher BioReagents	BP3994	Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar el medio Dulbecco's Modified Eagle (DMEM 1x)	Gibco -ThermoFisher Scientific	31053-028	Cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
LysoTracker Red DND-99	sondas moleculares -ThermoFisher Scientific	L7528	Almacene las alícuotas en la oscuridad a -20 & grados; C .
Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenes	PerkinElmer	Módulos de visualización y cuantificación	Para el análisis de imágenes 3D de pilas de imágenes
Leica SP8 AOBS	Microscopio confocal de barrido láser	Leica Microsystems	Para la recogida de imágenes
Microscopio confocal de barrido láser	Zeiss LSM 880	Carl Zeiss	Para la recogida de imágenes