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Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

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DOI:

10.3791/55177

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27 de marzo de 2017

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1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes de células que expresan receptores de proteína verde fluorescente con etiquetas de tipo 1a angiotensina durante la endocitosis iniciados por el tratamiento de la angiotensina II. Esta técnica incluye los lisosomas de etiquetado con un segundo marcador fluorescente, y luego utilizando software para analizar la co-localización de receptor y lisosoma en tres dimensiones con el tiempo.

Resumen

Imágenes de células vivas se utiliza para capturar simultáneamente imágenes con lapso de tiempo de los receptores de angiotensina de tipo 1a (AT 1a R) y los compartimentos intracelulares en células embrionarias humanas transfectadas de riñón 293 (HEK) después de la estimulación con angiotensina II (Ang II). Células HEK se transfectaron transitoriamente con ADN de plásmido que contiene a 1 A R etiquetado con la proteína verde fluorescente (EGFP). Los lisosomas se identifican con un colorante fluorescente rojo. imágenes de células vivas son capturados en un microscopio confocal de barrido con láser después de la estimulación Ang II y se analizaron por software en tres dimensiones (3D, voxels) con el tiempo. imágenes de células vivas permite investigaciones sobre el tráfico del receptor y evita confusiones asociados a la fijación, y, en particular, la pérdida o el desplazamiento artefactual de los receptores de membrana EGFP-etiquetados. Por lo tanto, como células individuales se realiza un seguimiento a través del tiempo, la localización subcelular de los receptores se pueden obtener imágenes y medido. Las imágenes deben ser adquiridos sufficiently rápidamente para capturar el movimiento de vesículas rápida. Sin embargo, a velocidades de formación de imágenes más rápidas, se reduce el número de fotones recogidos. Los compromisos también se deben hacer en la selección de parámetros de imagen como el tamaño de vóxel con el fin de ganar velocidad de formación de imágenes. aplicaciones significativas de imágenes de células vivas son estudiar el tráfico de proteínas, migración, proliferación, ciclo celular, apoptosis, autofagia y la interacción proteína-proteína y la dinámica, por nombrar sólo unos pocos.

Introducción

El objetivo general es obtener evidencia cuantitativa en tiempo y espacio de la colocalización del receptor con orgánulos subcelulares específicos después del tratamiento con un agonista del receptor. Por lo tanto, el objetivo inmediato aquí es capturar de lapso de tiempo imágenes confocales de lisosomas y un transmembrana del receptor en células de riñón embrionario humano (HEK) después de la transfección y de montar y analizar posteriormente los datos de imágenes en 3D para medir cuantitativamente la entrega de receptor a lisosomas. Investigando el tráfico simultáneo de un receptor transmembrana con los lisosomas u otros orgánulos durante la endocitosis cuando son activados por ligando del receptor puede ayudar a determinar cómo el receptor transmembrana está regulado bajo condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.

AT 1a R se presume que está degradado en lisosomas después del tratamiento con Ang II en los sistemas de células modelo, principalmente HEK293 1 aunque la mayoría de receptors se localizan principalmente en los endosomas de reciclaje multivesiculares de reciclado más tarde a la membrana plasmática, mientras que la mayor parte del ligando, Ang II, se degrada en el lisosoma 2, 3, 4, 5. Más recientemente, Li et al. demostrado usando transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y la fluorescencia de imágenes de microscopía de por vida (FLIM) técnicas que colocalizes AT 1a R (en ~ 10 nm escala) con LAMP1, una proteína de membrana lisosomal lo que sugiere que al menos parte del receptor se dirige a y degradado por lisosomas 6. Estos autores observaron que la cloroquina inhibidor lisosomal bloqueado en 1a asociación R-LAMP1 que es consistente con informes previos que sugieren que un efecto de la cloroquina es bloquear la fusión de endosomas tardíos o autofagosomas con lisosomas. Otros enfoques indirectos para determinar en 1a R localization en los lisosomas han utilizado bafilomicina, un inhibidor lisosomal para inferir AT 1a presencia R en los lisosomas 3, 4, 5, 6, 7, 8.

imágenes de células vivas evita posibles efectos de la fijación en el volumen celular, y la pérdida / atenuación / redistribución de los receptores-GFP quimérico. Estudios previos se han basado en células fijadas para determinar la colocalización o co-ocurrencia del receptor con los lisosomas o el uso de células vivas marcadas con sustitutos de unión a receptores tales como β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. imágenes de células vivas de otros GPCRs utilizando confocal de disco giratorio o láser conf punto de exploraciónmicroscopios vecinales equipados con detectores de Gaasp o HYD permitido a los investigadores observar la internalización y el tráfico de receptores en las células individuales fotografiados en z-pilas en intervalos de 30 segundos 9, 10. Sin embargo, incluso cuando las células vivas z-pilas se recogen rápidamente, análisis sólo puede ocurrir después de la selección de un solo plano dentro de cada pila, es decir, en 2D 10. Si bien esto puede ser suficiente para el estudio del GPCR o de la tirosina quinasa del receptor interiorizado de que se trate, las R 1a AT acumula en vesículas que cambian de tamaño y la posición en el tiempo y por lo tanto son inherentemente más difíciles de muestrear adecuadamente usando una rebanada solo representante en cada momento. Para determinar a fondo la ruta del marcado en 1a R a través de la célula y para detectar cada una subpoblación de vesículas que difieren en tamaño y posición, hemos ideado un método para obtener imágenes en 3D y análisis 3D para realizar un seguimiento de estos cambios y para ser se utiliza junto con el etiquetado de diferentes compartimentos intracelulares tales como lisosomas.

Los investigadores pueden utilizar este protocolo para imágenes de células vivas para visualizar directamente el movimiento de AT 1a R en la célula y su transferencia a compartimentos subcelulares después de la estimulación de Ang II. compartimentos subcelulares etiquetados con quimeras de proteínas fluorescentes u otros marcadores fluorescentes. Este protocolo también se puede usar como una primera aproximación para localizar receptores en orgánulos subcelulares con una resolución mínima de 200 nm a fin de comparar mutado en comparación con los receptores de tipo salvaje o para detectar cambios siguientes tratamientos farmacológicos. La técnica es accesible ya que puede llevarse a cabo en cualquier microscopio confocal equipado para imágenes de células vivas. La facilidad relativa de este enfoque contrasta con el aumento de la experiencia y el equipo necesario para llevar a cabo técnicas de FRET Flim / / BRET que detectan interacciones moleculares 6,"xref"> 11. Estas mediciones definen interacciones proteína-proteína en alta resolución (~ 10 nm) y la localización dentro de orgánulos subcelulares se infiere. Estas técnicas más avanzadas se utilizan para el seguimiento y definir con más precisión las interacciones moleculares de interés, en lugar de la aprobación de los receptores a través de los compartimentos subcelulares, y demuestran directamente las interacciones proteína-proteína en momentos y lugares específicos dentro de la célula 11. Flim, una técnica FRET aceptor independiente de la concentración, se realiza con mayor frecuencia en las muestras fijadas desde la adquisición de imágenes es más lenta. Por el contrario, la relación de FRET proporciona una imagen rápida y colocalización de alta resolución de las proteínas que interactúan. La desventaja de la relación de FRET es que las imágenes de campo amplio utiliza epi-fluorescencia para ganar velocidad de formación de imágenes y para incluir toda la célula, lo que resulta en una reducción de la resolución y el contraste de orgánulos 12. la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) es otrotécnica avanzada que se ha aplicado a GPCR para medir la adquisición de proximidad molecular con el tiempo 11. En esta técnica un fluoróforo proteína se divide molecularmente y cada media vinculada a una de las dos proteínas en cuestión. Cuando las dos proteínas de interés se unen entre sí, las partes de la etiqueta quimérico volver a montar para adquirir la fluorescencia y el aumento de la fluorescencia cuantificada con el tiempo.

A continuación, presentamos una técnica sencilla para imágenes de células vivas junto con la cuantificación de imagen para estudiar el tráfico de AT 1a R en la célula tras la estimulación de Ang II y el cambio potencial en la entrega de internalizado a 1 A R a los lisosomas después de la estimulación de Ang II. El uso final para esta técnica es caracterizar las diferencias en el tráfico de membrana comparativa de tipo salvaje y los receptores mutados. Estas diferencias le ayudará a identificar el mecanismo (s) que afectan las actividades fisiológicas de AT 1a R leading a regulación de la presión arterial.

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Protocolo

Día uno

Siembra 1. celular

  1. Preparar Eagle modificado medio completo de Dulbecco (DMEM). Añadir 50 ml de suero fetal bovino, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml de L-glutamina a 450 ml de DMEM para hacer 500 ml de DMEM completo complementado con suero bovino fetal (10%), penicilina / estreptomicina (1%) y L-glutamina (1%).
  2. Se siembran las células embrionarias humanas de riñón (HEK), número 6-11 pasaje a 50.000 / pocillo en un sistema cubreobjetos 8 y cámaras en DMEM completo.
  3. Mantener la diapositiva cámaras a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO2 durante 24 h.

Día dos

2. La transfección de liposomas

  1. Recién hacer AT plásmidos y liposomas soluciones 1a R-GFP usando condiciones estériles con un gabinete de bioseguridad de nivel 2.
  2. Diluir 2 l de ADN plásmido a 900 ng / l solución madre en 178 l de medio de suero reducido para lograr un concentration de plásmido de ADN de aproximadamente 10 ng / mL.
  3. Diluir 4,5 l de solución de liposomas de valores de 175,5 l de medio de suero reducido para crear una dilución 1:40 de la población.
  4. Añadir la solución de liposomas a la solución de plásmido y se mezcla mediante el uso de una pipeta de 1 ml pipetear arriba y hacia abajo 20 veces para mezclar la solución de transfección.
  5. Incubar la mezcla durante 30 min a temperatura ambiente (25-27 ° C).
  6. Mientras que esta mezcla está incubando, extraiga el soporte lentamente con una pipeta de 1 ml y se añade lentamente 400 l de 1x tampón fosfato salino (PBS) que se pre-calentado a 37 ° C.
  7. Retire suavemente el PBS y reemplazar con 200 l / pocillo de suero reducido medios pre-calentado a 37 ° C.
    NOTA: Tenga cuidado en todos los pasos para lavar las células para evitar el desprendimiento de células del cubreobjetos debido a la enorme tensión inducida por pipeteo.
  8. Mantener las células a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO2 durante 30 min.
  9. Una vez elperíodo de incubación es más, añadir 80 l de mezcla de transfección a cada pocillo e incubar las células durante 4,0 a 4,5 h pero no más de 5 horas a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2.
  10. Después del período de transfección de incubación, retire lentamente los medios de comunicación de las cámaras usando un ml pipeta 1 y reemplazar suavemente con 300 l / pocillo de DMEM completo y se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO 2 .

Día tres

3. privación de suero

  1. Retire los medios de comunicación suavemente con una pipeta de 1 ml y reemplazar lentamente con 300 l de suero libre de DMEM sin rojo fenol.
  2. Mantener la cámara a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante 10-12 h.

Día cuatro

4. Imágenes de células vivas

  1. Compartimentos intracelulares de manchas (lisosomas en este caso).
    1. About 30 min antes de la imagen lisosomas en las células, añadir 22,5 l de una solución de colorante de la fluorescente 1 M (0,5 l de 1 mM colorante fluorescente diluido en 499,5 l de DMEM libre de suero sin rojo fenol) a cada pocillo para una concentración de colorante final de 75 nM.
    2. Incubar durante 25-30 minutos a 37 ° C en un incubador humidificado con CO2 al 5% y luego retire con cuidado el colorante y se añade lentamente 300 l de DMEM libre de suero fresco sin rojo fenol.
  2. Preparar el microscopio para obtener imágenes.
    1. Ajustar la etapa hacia abajo para evitar daños a la lente durante el inicio de un microscopio automatizado.
    2. Conecte la alimentación del microscopio, de alimentación del escáner, la potencia del láser y luego la emisión láser, y finalmente la lámpara de halogenuros metálicos para la observación visual (ver instrucciones del fabricante del microscopio confocal).
    3. Abra el programa de software de imágenes y en el turno de software en el argón (488 nm) y láser de potencia de hasta un 30-50%. Tenga en cuenta el poder depende deedad de láser. Dentro de los experimentos es crucial para mantener los ajustes constantes.
    4. Activar el láser de emisión roja (por ejemplo, 568 nm o 594 nm).
    5. Formato de imagen establecido con una profundidad de 12 bits.
    6. Ajuste el ojo de aguja para la línea láser de argón de 488 nm y 568 nm para el o 594 nm láser para 1 unidad de disco de Airy. Si la GFP es muy tenue, utilice un ajuste de 2 unidades de disco de Airy, pero que coincida con los canales de forma apropiada.
    7. Cuando se utilizan conjuntos de filtros dicroicos, seleccionar las longitudes de onda de emisión apropiados para GFP y el colorante fluorescente. O bien, establecer la longitud de onda de emisión (Em) a 499-580 nm para GFP y Em 599 - 680 nm para el colorante fluorescente que emite rojo.
    8. Compruebe que sangran y cruzada no se produzcan. Desactivar cada láser a su vez y comprobar los dos canales de emisión para cada uno. Cuando el láser de argón está apagado, la emisión verde debe ser cero. Cuando el láser que emite verde está apagado, el canal de emisión roja debe ser cero.
      NOTA: El método más seguro es que cada imagen en pistas separadas (lentejcial).
    9. Incluir un canal de campo claro si se desea. Evitar imágenes de contraste diferencial (DIC), ya que puede sesgar mediciones colocalización.
    10. Para imágenes en vivo, seleccione secuencial de línea en lugar de marco secuencial.
  3. Seleccione las celdas para la imagen.
    1. Utilizar un objetivo 1,4 apertura numérica (NA), tal como un 63X / 1,4 NA objetivo aceite a las células de imagen (o 40X / 1.4 NA). Centrar el objetivo y añadir una gota de alta viscosidad, aceite de baja autofluorescencia de inmersión en el objetivo.
    2. La transferencia de la cámara con las células transfectadas de la incubadora a la platina del microscopio. Tenga cuidado de mantener las diapositivas plana y asegurarse de que la cámara está bien asentado y restringido de movimiento.
    3. Mueva el objetivo arriba hasta que la gota de aceite apenas toca el fondo de la corredera; el plano focal derecha se encuentra cerca de esta posición. En los microscopios automáticos, guardar esta posición, así como la posición bajada a utilizar para el retiroainder del experimento de formación de imágenes para facilitar el cambio de las muestras.
    4. Elija células tenues. Las células que sobreexpresan AT 1a R-GFP se desviar el receptor en la célula e interrumpir la función normal.
    5. Confirmar que el contorno de la célula, que se define por la membrana plasmática, es visible y preferiblemente no se solapan con otras células.
    6. Enfocar y centrar la célula en el campo de visión.
    7. Cambiar al modo confocal.
    8. Seleccionar un modo de imagen rápida. Con una mano en el control de enfoque y la otra en el control XY etapa, enfocar y centrar la célula de interés visualizado en el monitor.
    9. Confirmar que la célula de interés está muy difundido y su lado inferior o ventral yuxtapuestos en estrecha colaboración con el cubreobjetos, centrándose arriba y hacia abajo a través de la célula.
  4. Establecer los parámetros z-escenario para una imagen de células en 3D.
    1. Seleccione el botón de encendido para la tapa Z-pila y de diálogo inferior (o equivalente) y se centran en la parte inferior de la cell continuación, presione "iniciar". A continuación, se centran en la parte superior de la celda y pulse "final". Volver a comprobar que toda la célula está incluido en el z-pila.
    2. Establecer el tamaño de Z a paso a 1,0 micras.
  5. Defina los ajustes de imagen.
    1. Seleccione Zoom 2, dependiendo de la lente, de modo que el tamaño final de píxel es de aproximadamente 0,279 m x 0,279 m a 0,14 m x 0,14 m en la dimensión XY.
    2. Para las células HEK en este experimento, ajustar la velocidad de escaneado a aproximadamente 1 microsegundo por voxel y seleccione 2 promediar o 2 acumulaciones por línea, dependiendo de la luminosidad de las células.
    3. Ajusta la intensidad del láser y ganar para obtener imágenes de las buenas prácticas agrarias y el colorante fluorescente. En general, contratinciones serán mucho más brillante y por lo tanto el detector fotomultiplicador (PMT) y fosfuro de arseniuro de galio no (Gaasp) o detectores híbridos (HYD) debe ser utilizado para este segundo canal de color, mientras que los detectores de jadear y HYD son necesarios para el canal de GFP. Si el HyD o Gaasp detectanORS se utilizan para el tinte fluorescente, ejercer precaución y se inicia con el láser con una potencia extremadamente baja.
    4. Establece la duración de la exploración y la frecuencia de exploración, por ejemplo, cada 30-60 s durante 25 minutos o más para ver la orientación de AT 1a R-GFP a los lisosomas.
    5. Ajuste el enfoque automático para mantener la estabilidad en el plano focal a través del tiempo.
  6. Comenzar el experimento de imágenes.
    1. Preparar con antelación Ang II stock 100x a 5 g / l (4,7793 mM) y añadir 2,1 l de este medio de 998 l (10 mM).
    2. Comience la estimulación de ligando mediante la adición de 3 l de una solución de reserva de 100x de ligando (Ang II) al pocillo que contiene 300 l inmediatamente antes de la imagen (concentración final 100 nM).
    3. Haga clic en Inicio y la imagen en 3D para el tiempo y la frecuencia deseada.
    4. Antes de terminar el trabajo en el microscopio, se recoge una pila Z para su uso posterior en la sustracción del fondo durante el análisis. En el modo de recuento de fotones, esto no esnecesario ya que el fondo es esencialmente 0. Con iluminación encendido y todas las demás condiciones de formación de imágenes de la misma, pero con ninguna muestra tomar una imagen de muestra. Ver sustracción de fondo (abajo) bajo análisis.

día cinco

Análisis 5. Imagen

  1. Exportar imágenes en formato TIFF.
    1. Haga clic derecho sobre el nombre del archivo de imagen para ver los menús y seleccione Exportar o haga clic en Archivo | exportación | importar.
    2. Exportar a tiff para su posterior análisis asegurándose de exportar el RAW, los datos de 12 bits [no el "Rojo Verde Azul '(RGB) de conversión utilizado para imágenes de calidad de la publicación]. No exportar a formato jpeg.
    3. Tenga en cuenta la X, Y, Z del voxel dimensiones y el tamaño z-paso para su uso posterior durante el análisis de imagen. Por ejemplo, usando un 40X / 1.4. NA de la lente objetivo de estos valores podrían ser 0.138 m x 0,138 m con 1 m de tamaño z a paso (ver datos en la sección de resultados representativos).
  2. Crear pila de imágenes para su análisis.
    1. La cuantificación de software Abrir imagen (Figura 2)
    2. Use "Acción | Crear Nuevo | Imágenes de la secuencia seleccionada" para generar una imagen en fila india a partir de secuencias importadas individuales (Figura 2, flecha # 1).
    3. Introduce el número de canales, el número de secciones z, y el número de puntos de tiempo.
    4. Dependiendo de la estructura de los archivos .tiff *, seleccione, por ejemplo, canales, plano z, y tiempos que en el orden de los planos de imagen. Compruebe que la pila imagen final representa correctamente los canales de color, z-pila, y los puntos de tiempo de la imagen original.
    5. Seleccione el nombre de la imagen (Figura 2, el nombre del archivo resaltado a la izquierda, la flecha # 2). Haga clic derecho sobre la imagen y / o el campo de imagen, y una de las opciones en la parte inferior de la lista seleccione "Propiedades". En el píxel micras para (X) (Y) y el tamaño (Z), entran en las correctas Características de la imagen se ha indicado anteriormente.
  3. Restar fondo antes del análisis de imágenes. Corrección de fondo se puede realizar en cualquier software de análisis de imágenes. Restar fondo utilizando una de las dos opciones.
    1. Opción 1: Seleccionar "Acción | Crear Nuevo | sustracción de fondo" (Figura 2, flecha # 1). Utilice la imagen de fondo adquirida obtenida al final de la sesión de imágenes descrito anteriormente como la imagen "de referencia oscuro" en "Herramientas | Reste fondo".
    2. Opción 2: Inspeccionar las áreas más oscuras de las imágenes donde no hay muestra, calcular la media o máximo brillo de los píxeles en esa región, haciendo caso omiso de los píxeles inusualmente brillantes que podrían ser espuria fluoróforo, un píxel brillante al azar, o algún otro fenómeno. Seleccione "Acciones | Crear Nuevo | sustracción de fondo". Utilice este brillo de los píxeles (hecho negativo) como el offset.
  4. Compruebe si hay registro de color y corregir si es necesario.
    1. El uso de un control positivo como microperlas fotografiados, o, colocalizó vesículas y que contiene colorante fluorescente GFP (Figura 3) evaluar la necesidad de corrección por el cambio, ya sea el canal de color rojo o verde apagado y encendido. Visualmente, si el registro está desactivado de incluso 1 pixel, es evidente a la vista.
    2. Generar una corrección del registro seleccionando "Acciones | Crear Nuevo | corrección del registro" (Figura 2, flecha # 1) y utilice el cuadro de diálogo para realizar ajustes. Una vez completado un nuevo elemento de carpeta aparecerá titulado "corrección del registro".
    3. Aplicar el registro de una o más de las imágenes de interés haciendo clic en el nombre de la imagen (Figura 2, el nombre del archivo resaltado a la izquierda, flecha # 2) y luego seleccionando "Herramientas | Registro correcta" (botón de la herramienta adyacente a acciones).
  5. Crear secuencia de medición para analizar AT vesícula 1a R-GFP y la intensidad de células enteras siguientetratamiento con Ang II.
    1. Seleccione una imagen (Figura 2, el nombre del archivo resaltado a la izquierda, flecha # 2) y dibujar una región de interés (ROI) en torno a una sola celda con la función freestyle región (Figura 2, flecha # 3). Utilice el modo de enfoque extendido (2D, en el menú desplegable en la parte superior izquierda) para observar la célula como la herramienta de recorte sólo funciona en la visualización 2D.
    2. Haga clic derecho en la imagen y seleccionar "Recortar a la selección" y se genera un nuevo elemento de imagen.
    3. Seleccione la celda recortada haciendo clic en su nombre y luego seleccione la pestaña "medición" de arriba (Figura 2, flecha # 4).
    4. Para definir y medir las vesículas internalizadas para GFP, arrastre "Encuentra objetos" en "Finding" (Figura 2, flecha # 5) en la caja de la secuencia (Figura 2, flecha # 6).
    5. Set "Encuentra objetos" de Canal para el canal GFP.
    6. Abrir configuración (icono de la rueda en el cuadro de diálogo, la flecha # 6) y establecer4; Umbral usando: "a SD y" límite inferior "a 6. Conjunto" tamaño del objeto mínimo "a 0 m 3.
      NOTA: El límite inferior SD dependerá de los experimentos individuales. Confirmación visual de que los objetos correctos están de umbral se hace mediante el examen de diferentes puntos de tiempo (Figura 2, flecha 7 #). La "Medida | Opciones de comentarios del" cuadro de diálogo se utiliza para elegir la forma en que se seleccionan los objetos de umbral se visualizan (Figura 2, flecha # 8).
    7. Haga clic en "medida" en el cuadro de diálogo "Buscar objetos" (Figura 2 flecha # 6) y seleccionar el canal y el tipo de mediciones. Normalmente, seleccione "Todos los canales" y "intensidad y el volumen de mediciones".
    8. Para definir el umbral y filtros para la identificación de toda la célula y para medir la intensidad total de GFP, repita los pasos anteriores (5.5.4 - 5.5.8) utilizando los siguientes parámetros: SD 0 y "Tipo de objeto mínimo" a 2 μ; m 3 en el segundo cuadro de diálogo "Buscar objetos" para identificar las células que utilizan GFP (Figura 2, flecha # 9)
    9. Arrastre "Población de filtro" en "Filtrado" a la caja de secuencia bajo la población 2 (el segundo cuadro de "encontrar objetos", la figura 2, la flecha # 9). Seleccione "Volumen (m 3> 100).
    10. Visualmente asegurar que se identifica un solo objeto. La célula entera debe thresholded y todos los demás objetos por filtración. El parámetro "Filtro" (s) puede necesitar un ajuste si la célula es pequeño, por ejemplo.
    11. Una vez que la medición ha sido estandarizado, guardar el protocolo haciendo clic derecho en la imagen y selecciona "Guardar Protocolo" con el fin de volver a utilizar ( "Restaurar Protocolo"). El protocolo también se puede exportar a proporcionar un registro en el mismo subdirectorio como la imagen.
    12. Vaya a "Hacer Medición" seleccionando "Mediciones | Hacer Punto de medición" (Figura 2 , flecha # 8) o clic derecho en la imagen y seleccionar "Hacer medición" y "Todos los puntos de tiempo".
    13. Introduzca el nombre de la medición correcta (copiar y pegar de la imagen es conveniente) y el código de análisis o la fecha (una adición útil para el mantenimiento de registros) y seleccione "Todos los puntos de tiempo". Un nuevo elemento de la hoja se creará debajo de la imagen. Mantener los nombres de archivo concisa.
  6. Analizar y exportar los datos.
    1. Haga clic en el nombre del archivo de hoja de cálculo y seleccione la ficha "Analizar". Determinar si los voxels saturados están presentes si selecciona la opción "limitar el análisis a:" seleccione la Población 2 (la célula).
    2. Haga clic derecho en el campo bajo la pestaña "Analizar" y en el cuadro de diálogo en "Analizar estos datos:" seleccionar "Max ([canal de color GFP])"; bajo "resume en:" seleccione "Media ([canal de color GFP]"; y en "Organizar los datos de:" y "Fila" seleccionar "Timepoint" y click "OK".
      NOTA: Si los datos contiene píxeles saturados (por ejemplo, 65.536 de 16 bits o 4096 para 12 bits), el análisis no será precisa (se subestime contenido de la vesícula). Haga caso omiso de esa célula para su análisis. Si no saturado, proceder al siguiente paso.
    3. A continuación, en la pestaña "crudo" y luego en la pestaña "Análisis" y clic derecho en los datos se encuentran "limitar el análisis a:" a continuación, seleccione la Población 1 de vesículas o Población 2 para toda la célula.
    4. En "Analizar estos datos:" seleccione "Suma" (canal de color GFP); bajo "resume en:" seleccionar "Sum"; y, en "Organizar los datos de:" y "Fila" seleccionar "Timepoint" o "tiempo relativo" y haga clic en "OK". selecciones de análisis se pueden guardar y volver a utilizar.
    5. Seleccionar y copiar / pegar directamente desde el software de imagen cuantificación de una hoja de cálculo en blanco o exportar los datos de hoja de cálculo haciendo clic derecho en el datuna y seleccionando guardar como archivo .csv. Toda la medición de la intensidad de células se incluirá con las mediciones de cada vesícula en la población, así que asegúrese de identificar y separarla de las vesículas.
      NOTA: Después de graficar los datos, el aumento de la fluorescencia total GFP contenida dentro de las vesículas se eleva rápidamente. Photobleaching, si se produce, se detecta como la pérdida de la intensidad total de GFP de células con el tiempo.
  7. Crear secuencia de medición para analizar GFP presente en los lisosomas.
    1. En los encontrar objetos (población 1), ajuste "Encuentra objetos" canal para el canal rojo y en el icono de rueda dentro de ese cuadro de diálogo que indica la flecha # 6 (Figura 2) conjunto "Umbral usando:" a SD y "límite inferior" a 6. Conjunto "tamaño del objeto mínimo" a 0.017 m 3.
      NOTA: El límite inferior SD dependerá de los experimentos individuales. confirmación visual de que los objetos correctos están siendo thresholded debe ser hecha por el examenIning diferentes puntos de tiempo. La "Medida | Opciones de comentarios del" cuadro de diálogo se utiliza para elegir la forma en que se seleccionan los objetos de umbral se visualizan (Figura 2, flecha # 8).
    2. Haga clic en "Medida" en "Buscar" Objetos "de diálogo (Figura 2 flecha # 6) y seleccione los canales y tipos de mediciones. Por lo general," se seleccionan todos los canales "y" intensidad y el volumen de mediciones ".
    3. Para la población 2, la configuración de uso idéntica a la utilizada para identificar el conjunto de células transfectadas que expresan AT 1a R-GFP (5.5.9).
    4. Si múltiples células (incluyendo células no transfectadas con vesículas de tinte-positivas fluorescentes) están presentes, de cultivo de la célula en la primera etapa del análisis es crítico. Alternativamente, el uso de "Compartimentar" debe utilizarse para limitar la identificación de los lisosomas dentro de la célula transfectada que expresan AT 1a R-GFP. Los lisosomas sólo debe ser identificado dentro de la célula y las buenas prácticas agrariasno desde las células cercanas, sin transfectar.
    5. Analizar y exportar datos que el anterior.
      NOTA: Un ejemplo de células de umbral y vesículas se muestra en la Figura 4.

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Resultados

En este conjunto representativo de los experimentos, las células HEK fueron transfectadas con receptor de angiotensina tipo 1a (AT 1a R-GFP) construcción (E1,2,3 AT-1a R) clonado en el plásmido pEGFP-N2 13. Imágenes con lapso de tiempo de HEK fueron adquiridas y se reproducen como una película (Ver imágenes de células vivas 1 y 2 imágenes de células vivas películas). Las películas y fotografías muestran que d...

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Discusión

Los experimentos preliminares presentados aquí ilustran que durante un transcurso de tiempo bastante corto de 24 min, no se produjo ningún cambio apreciable en la entrega de AT 1a R-GFP a los lisosomas. En general, la entrega de los receptores internalizados a los lisosomas podría ocurrir tan pronto como 15-20 min. Este experimento es consistente con la hipótesis de que la mayor parte de la internalizado AT 1a R está dirigido a los endosomas grandes, perinuclear. La evidencia de que al menos alguno...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

El trabajo de investigación presentado en este manuscrito fue apoyada por conceder R01 HL121456-01A1 a Kathryn Sandberg. Este trabajo fue apoyado además por la disponibilidad de una Leica SP8 AOBS en el Microscopía e Imagen recurso compartido (MISR) en Georgetown University Medical Center, en parte financiado por P30-CA051008 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de América. Agradecemos la ayuda de imágenes Leica SP8 por Peter Johnson, y el uso de la Zeiss LSM880 en el laboratorio de Thomas Coate, Departamento de Biología de la Universidad de Georgetown, con la ayuda de imágenes proporcionada por Alma Arnold de Carl Zeiss Microscopía LLC. El contenido de este manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Angiotensina II (Ang II)Sigma-AldrichA9525 
Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar 
Suero fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF2442Warm in 37 ° C baño de agua antes de usar
Penicilina Estreptomicina (Pen Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Calentar en 37 ° C baño de agua antes
de usar L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco (life technologies)25030-081Caliente en 37 ° C baño de agua antes
de usar Riñón embrionario humano (HEK)-293 células Colección decultivo tipo americano (ATCC) CRL-1573Pasaje número 5 - 12
Nunc Lab-Tek II con cámara 1.5 Sistema de cubreobjetos alemánSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 Reactivo de transfecciónThermoFisher Scientific11668019Almacene a 4 & grados; C 
Opti-MEM, Suero Reducido MedioGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar PBS 10x Fisher BioReagentsBP3994Warm in 37 ° C baño de agua antes
de usar el medio Dulbecco's Modified Eagle (DMEM 1x) Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
LysoTracker Red DND-99sondas moleculares -ThermoFisher ScientificL7528Almacene las alícuotas en la oscuridad a -20 & grados; C . 
Volocity versión 6.3 Software de análisis de imágenesPerkinElmerMódulos de visualización y cuantificaciónPara el análisis de imágenes 3D de pilas de imágenes
Leica SP8 AOBSMicroscopio confocal de barrido láserLeica MicrosystemsPara la recogida de imágenes
Microscopio confocal de barrido láserZeiss LSM 880Carl ZeissPara la recogida de imágenes

Referencias

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