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Artículo de método

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DOI:

10.3791/55183

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9 de febrero de 2017

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1Biomedical Engineering, Tulane University

En este artículo

Resumen

Angiogénesis implica interacciones multicelulares y multisistémicas que necesitan ser investigadas en un entorno fisiológicamente relevante. El objetivo de este estudio es demostrar la capacidad del modelo de cultivo de mesenterio en rata para realizar comparaciones time-lapse de redes microvasculares intactas durante la angiogénesis.

Resumen

La angiogénesis, definida como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos pre-existentes, implica células endoteliales, pericitos, células de músculo liso, células inmunes, y la coordinación con los vasos linfáticos y nervios. El multi-celda, las interacciones de múltiples sistemas requieren la investigación de la angiogénesis en un entorno fisiológicamente relevante. Por lo tanto, mientras que el uso de los modelos de cultivo celular in vitro han proporcionado ideas mecanicistas, una crítica frecuente es que no se recapitulan la complejidad asociada con una red microvascular. El objetivo de este protocolo es demostrar la capacidad de hacer comparaciones con lapso de tiempo de redes microvasculares intactas antes y después de la estimulación de la angiogénesis en los tejidos mesenterio de rata. tejidos cultivados contienen redes microvasculares que mantienen su jerarquía. marcaje inmunohistoquímico confirma la presencia de células endoteliales, células de músculo liso, pericitos, vasos sanguíneos y los vasos linfáticos. En unddition, el etiquetado de los tejidos con BSI-lectina permite la comparación de lapso de tiempo de las regiones locales de la red antes y después de la estimulación con suero o factor de crecimiento caracterizado por el aumento de la brotación y la densidad de los vasos capilares. En comparación con los modelos de cultivo celular comunes, este método proporciona una herramienta para estudios de linaje de células endoteliales y la evaluación de medicamentos angiogénico específico de tejido en las redes microvasculares fisiológicamente relevantes.

Introducción

Crecimiento de la red microvascular y la remodelación son denominadores comunes para la función del tejido, cicatrización de heridas, y múltiples patologías y un proceso clave es la angiogénesis, que se define como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes 1, 2. Para la ingeniería de tejidos nuevos vasos o el diseño de terapias basadas angiogénicos, la comprensión de la importancia de la dinámica celulares implicados en la angiogénesis es crítica. Sin embargo, este proceso es complejo. Puede variar en lugares específicos dentro de una red microvascular y consiste en múltiples tipos de células (es decir, células endoteliales, células de músculo liso, pericitos, macrófagos, células madre) y sistemas múltiples (redes linfáticas y redes neuronales). Aunque los modelos in vitro han contribuido enormemente a examinar la relación entre las diferentes células implicadas en la angiogénesis 3, su relevancia fisiológica puede ser socavado debido a thei r complejidad limitada y el hecho de que no reflejan estrechamente un escenario en vivo. Para superar estas limitaciones, los sistemas de cultivo tridimensional 3, ex vivo modelos tisulares 4, los sistemas de microfluidos 5, 6, 7 y modelos computacionales se han desarrollado e introducido en los últimos años. Sin embargo, todavía hay una necesidad de un modelo con capacidad de lapso de tiempo para investigar la angiogénesis en las redes microvasculares intactas ex vivo. El establecimiento de nuevos modelos de lapso de tiempo para los estudios de la angiogénesis con ese nivel de complejidad proporcionará una herramienta muy valiosa para comprender los mecanismos subyacentes que regulan la angiogénesis y para mejorar las terapias.

Un posible modelo que permite la investigación ex vivo de la angiogénesis a través de una red microvascular intacto es el modelo de cultivo de mesenterio de rata> 8. En un trabajo reciente, hemos demostrado que las redes microvasculares linfáticos sangre y permanecen viables después del cultivo. Más importante aún, el modelo de cultivo de mesenterio de rata se puede utilizar para investigar las interacciones funcionales de pericitos células endoteliales, la sangre y las conexiones de las células endoteliales linfáticas, y time-lapse. El objetivo de este trabajo es proporcionar a nuestro protocolo para el método de imagen de lapso de tiempo. Nuestros resultados representativos documentan los múltiples tipos de células que se mantienen viables después de la estimulación de la angiogénesis con suero y ofrecen ejemplos del uso de este método para la cuantificación de las respuestas angiogénicas específicos de tejido, así como estudios de seguimiento de células endoteliales.

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Protocolo

Todos los experimentos y procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Tulane (IACUC).

1. Procedimiento de configuración quirúrgica

  1. instrumentos quirúrgicos, equipos de autoclave, y suministros de cultivo antes de la cirugía. suministros quirúrgicos para cada rata incluyen: 1 sábana, 1 sábana con orificio precortado (0,5 pulgadas x 1,5 pulgadas) en el centro, gasas, y 1 almohadilla inferior absorbente. Los instrumentos quirúrgicos incluyen: 1 escalpelo con una cuchilla de número 10, 2 pares de pinzas, y un par de tijeras finas. Los suministros de cultivo incluyen: 1 sábana, 1 par de pinzas, y se prepararon para placas de 6 pocillos con filtros de policarbonato.
  2. Esterilizar una plataforma de plexiglás, una etapa quirúrgica y un espacio de mesa quirúrgica con 70% de etanol. Mantenga la etapa quirúrgica en un recipiente estéril hasta su uso.
    1. Crear una etapa quirúrgica mediante la perforación de una de aproximadamente 2 en por 1 en el agujero en el centro de una placa de cultivo de 100 mm. A continuación, utilice papel de lija para suavizarlos bordes afilados y añaden una capa de pegamento de silicona a los bordes del agujero para crear una superficie elevada para los tejidos.
    2. Por otra parte, el diseño de la etapa quirúrgica utilizando software de CAD y hacer un 3-D de impresión (Figura 1).
  3. Coloque una almohadilla inferior absorbente estéril y extienda una plataforma de plexiglás en la parte superior de la misma. Coloque la sábana, sin un agujero pre-corte, a través de una almohadilla caliente al lado de la almohadilla inferior absorbente.
  4. Pre-caliente solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), medios de comunicación y solución salina a 37 ° C. Coloque los medios de comunicación y PBS en placas de cultivo separadas encima de la resistencia de calentamiento y el lugar de solución salina en un tubo cónico de 50 ml al lado de la configuración quirúrgica.
  5. Asegúrese de que todos los paquetes se abren antes del comienzo de la cirugía para asegurar una manipulación estéril de todos los materiales. Una lista completa de las herramientas comunes que se utilizan en este procedimiento se muestran en el Tabla de materiales quirúrgicos y herramientas específicas.

2. MesenterLa recolección de tejidos y

  1. Uso de adultos ratas Wistar machos (350 ± 25 g; 6 - 8 semanas de edad). Otras cepas y edades de las ratas pueden ser sustituidos.
  2. Anestesiar la rata a través de una inyección intramuscular de ketamina (80 mg / kg de peso corporal) y xilazina (8 mg / kg de peso corporal). Confirmar la rata está bajo anestesia apretando entre los dedos para comprobar si hay una respuesta refleja; no debería haber ninguna. analgesia preventiva para este procedimiento terminal no es necesario.
  3. Afeitarse la región abdominal y eliminar el vello restante usando crema de depilación. Limpiar la piel abdominal dos veces con alcohol isopropílico al 70%, seguido de povidona-yodo. Para las toallitas el cirujano debe comenzar en el centro de la zona quirúrgica y se mueven hacia el exterior de la zona preparada de una manera circular para no solapar zonas que han sido lavadas previamente con la misma pieza de gasa estéril o bastoncillo de algodón estéril. A continuación, traslado de los animales a la configuración quirúrgica estéril y colocar encima de la plataforma de plexiglásformar.
  4. El uso de una hoja de bisturí, hacer un 0,75 en - 1,25 en la incisión en el intestino a partir del 1 de debajo del esternón. Tenga cuidado de no perforar el intestino o mesenterio (1 capa de la piel, 1 capa de tejido conectivo, y 1 capa de músculo).
  5. Colocar una sábana con un agujero pre-corte sobre la incisión y colocar una etapa quirúrgica estéril encima de la cortina. Asegúrese de que los alinea con la apertura de la incisión. Utilizar bastoncillos de algodón estériles para localizar y extraer el íleon a través de la boca del escenario quirúrgico.
  6. Tire de 6 - 8 ventanas mesentéricas a través de la fase usando bastoncillos de algodón, y tenga cuidado de no tocar las ventanas (Figura 1). Los tejidos se recogen típicamente de la región del íleon del intestino delgado comenzando cerca del ciego. Mantenga tejidos expuestos húmedo con solución salina estéril calentado según sea necesario con una jeringa estéril a gotear la solución.
  7. La eutanasia a las ratas mediante la inyección intracardíaca de pentobarbital sódico (0,2 ml por rata). Antes de retirar misenteric ventanas, aseguran que la rata se sacrificó palpando el corazón; no debería haber ningún pulso.
  8. Retire los tejidos mesenterio deseados mediante el uso de pinzas para agarrar la almohadilla de grasa y unas tijeras finas para cortar la ventana. Deja un borde de grasa (2 mm) alrededor de la ventana. Lavar los tejidos una vez en PBS estéril calentado y una vez en los medios de comunicación.
  9. Volver íleon exteriorizada a la cavidad abdominal y disponer de animales de acuerdo con las directrices institucionales.

3. Mesenterio cultivo tisular para estudios con lapso de tiempo

  1. Transferencia de suministros de cultivo tratadas en autoclave (ver sección 1.1) y los tejidos a una campana de flujo laminar estéril.
  2. Use pinzas para transferir cada tejido encima de una membrana de filtro de policarbonato. tejidos para discapacitados cerca de la almohadilla de grasa para evitar daños en el sistema vascular.
  3. propagar rápidamente el tejido usando la almohadilla de grasa, teniendo cuidado de no tocar la ventana. Invertir el inserto con el tejido en la parte inferior de una placa de 6 pocillos y cubrir con 3 ml de medio (Figura 1 ). medios típicos utilizados para este procedimiento incluye medio esencial mínimo (MEM) con 1% de penicilina estreptomicina (PenStrep) y 10% de suero bovino fetal (FBS). Los medios pueden complementarse con otros sueros y / o factores de crecimiento para estimular la angiogénesis.
  4. Repita los pasos 3.2 a 3.3 para cada tejido y la cultura en condiciones estándar de la incubadora (5% CO2, 37 ° C) durante un máximo de 5 días.

4. Time-lapse de Mesenterio Tissue

  1. En el día de formación de imágenes, complementar los medios de comunicación en cada pocillo con conjugado BSI-lectina y se incuba bajo condiciones de cultivo estándar para 30 min. Lavar tejidos dos veces con medio libre de lectina. BSI-lectina mancha permanecerá visible en el tejido del mesenterio para un máximo de 3 días de cultivo.
  2. La transferencia de la placa a una platina del microscopio. Identificar los vasos sanguíneos y linfáticos en función de su estructura de la morfología y de la red.
  3. Localizar una región de red deseada en cada tejido y tomar imágenes. Tomar nota de la proyección de imagenubicación para garantizar la misma región será capturado por las imágenes subsiguientes. Si se utiliza una plataforma motorizada, documentar las coordenadas.
  4. Devolver los tejidos a la incubadora y continuar con la cultura hasta el punto final deseado. Repita los pasos 4.1 a 4.3, según sea necesario en función de los puntos de tiempo experimentales deseados.

5. Tejido Immunolabeling

  1. Etiquetado BSI-lectina
    1. Incubar los tejidos durante 30 min a 37 ° C con 1:40 lectina conjugada con FITC en los medios (2,5 ml solución de anticuerpo por pocillo en placa de 6 pocillos), seguido de dos lavados con medios de comunicación. Para enjuagues, añadir medios y luego vuelva a colocar inmediatamente.
  2. Etiquetado Live / Dead
    1. Incubar los tejidos durante 10 min a 37 ° C con 1: 500 de etidio 2 mM homodímero-1 y 1: 500 1 mM de calceína AM en los medios (2,5 ml solución de anticuerpo por pocillo en placa de 6 pocillos), seguido de dos lavados con medios de comunicación.
  3. BSI-lectina / Etiquetado NG2
    1. tejidos separadas en un microscopio deslizaronE (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa.
    2. Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min).
    3. Para el etiquetado de anticuerpo primario incubar tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: anticuerpo policlonal de conejo y de NG2 100 5% de suero de cabra normal (NGS). Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min).
    4. Para el etiquetado de anticuerpo secundario se incuba tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 de cabra anti-conejo conjugado con CY2 anticuerpo (GAR-CY2) y 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min).
    5. Incubar los tejidos durante 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina conjugada con FITC en PBS seguido de dos lavados con PBS. Para enjuagues, añadir PBS y luego reemplace inmediatamente.
    6. Para montar las diapositivas, con cobertura de tejidos 50:50 PBS y solución de glicerol y el cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas.
  4. LYVE-1 / Etiquetado PECAM
    1. Difundir los tejidos en un portaobjetos de microscopio (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa.
    2. Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    3. Para el etiquetado de anticuerpo primario incubar tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: monoclonal biotinilado anticuerpo CD31 200 del ratón y 1: 100 de conejo policlonal LYVE-1 de anticuerpos en + 0,1% de saponina + 2% de albúmina de suero bovino PBS (BSA) + 5% NGS . Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    4. Para el etiquetado de anticuerpo secundario, se incuban los tejidos durante 1 h a temperatura ambiente con 1: anticuerpo de estreptavidina 500 conjugado con Cy3 y 1: 100 GAR-CY2 en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    5. Para montar diapositivas, tejidos cubierta con 50:50 solución de PBS y glicerol y colocar un cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas.
  5. BrdU / BSI-lectina de etiquetado
    1. Añadir 1 mg / ml de BrdU a los medios de comunicación y la sustitución de los medios de tejido con una solución de BrdU. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
    2. Difundir los tejidos en un portaobjetos de microscopio (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa.
    3. Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS (3 x 10 min).
    4. Desnaturalizar el ADN de tejidos en HCl 2 M durante 1 hora a 37 ° C. Lavar los tejidos en PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    5. Para el marcaje del anticuerpo primario, se incuban los tejidos durante 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 de ratón monoclonal anti-BrdU en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    6. Para el etiquetado de anticuerpo secundario, se incuban los tejidos durante 1 h a temperatura ambiente con 1: anticuerpo 100 de cabra anti-ratón conjugado con Cy3 (GAM-Cy3) en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    7. Incubar tejidos para 30 min a temperatura ambiente con una y cuarenta lectina conjugada con FITC en PBS seguido de dos lavados con PBS.
    8. Para montar las diapositivas, los tejidos de la cubierta con PBS 50:50 y solución de glicerol y el cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas.
  6. BSI-lectina etiquetado / CD11b
    1. Difundir los tejidos en un portaobjetos de microscopio (1 - 2 tejidos / diapositiva) y dejar secar. Eliminar el exceso de grasa con un bisturí presionando firmemente para extirpar la grasa.
    2. Para reparar tejidos en metanol frío durante 30 minutos a -20 ° C. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    3. Para el etiquetado de anticuerpo primario incubar tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 de ratón anti-rata CD11b en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS + 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    4. Para el etiquetado de anticuerpo secundario se incuba tejidos para 1 h a temperatura ambiente con 1: 100 GAM-Cy3 en PBS + 0,1% de saponina + 2% BSA + 5% NGS. Lavar los tejidos con PBS+ 0,1% de saponina (3 x 10 min).
    5. Incubar los tejidos durante 30 min a temperatura ambiente con 01:40 lectina conjugada con FITC en PBS seguido de dos lavados con PBS.
    6. Para montar las diapositivas, los tejidos de la cubierta con PBS 50:50 y solución de glicerol y el cubreobjetos en la parte superior. Sellar los bordes de diapositivas utilizando el esmalte de uñas.

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Resultados

Después de 3 días de cultivo, los tejidos se marcaron con un kit de viabilidad / citotoxicidad en vivo / muerto para demostrar la viabilidad de la microvasculatura en el mesenterio de rata modelo de cultivo (Figura 2A). La mayoría de las células presentes en el mesenterio se mantuvo viable en la cultura en la que las células endoteliales fueron identificados en base a su ubicación en segmentos microvasculares. Proliferación de células endoteliales también se confirmó por...

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Discusión

Este protocolo se documenta un método para utilizar el modelo de cultivo de mesenterio de rata como una herramienta ex vivo para time-lapse de crecimiento de la red microvascular. El trabajo previo en nuestro laboratorio ha establecido el uso de nuestro modelo para 1) la angiogénesis 8, 2) linfagiogénesis 8, 3) la interacción de células endoteliales de pericitos-8, y 4) las pruebas de drogas anti-angiogénico 9. La ca...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención 5-P20GM103629 de los Institutos Nacionales de Salud a WLM y el Centro para el Envejecimiento de Tulane. Nos gustaría agradecer a Matthew Nice por su ayuda con la edición del texto del protocolo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
CortinaCardinal Health401212" x 12" Envolturas de esterilización regular Bio-Shield
Mango de bisturíInstrumento quirúrgico RobozRS-9843Mango de bisturí, # 3; Sólido;
Cuchilla quirúrgica estéril deCincinnati Surgical0110acero inoxidable; Plato de cultivo de tamaño 10
(60 mm)Thermo Scientific13018110/
Pinza de Graefe de manguito (pinzas curvas)Instrumento quirúrgico RobozRS-5135Pinzas de microdisección; Dentado; Ligera curva; Ancho de la punta de 0,8 mm;
Pinza Graefe de 4" de longitud (pinzas rectas)Instrumento quirúrgico RobozRS-5130Pinzas de microdisección; aserrado, recto; Ancho de la punta de 0,8 mm; 4" de longitud
Noyes Micro ScissorRoboz Surgical InstrumentRS-5677Noyes Micro Disecting Spring Scissors;
Puntas rectas, afiladas y romas; filo de corte de 13 mm; 0.25 mm Ancho de la punta, 4 1/2" de longitud total
Almohadillas de gasaFisherBrand13-761-52Esponjas de gasa de algodón no estériles; 4" x 4" Aplicadores
de 12 capas con punta de algodónFisherBrand23-400-1246" de largo; Eje de madera;
Placa de 6 pocillosFisher Scientific08-772-49Fondo plano con tapa de baja evaporación; Poliestireno;
Jeringa estéril no pirogénica 5 mLFisher Scientific14-829-45Luer-Lok Tip
Sterile Bowl MedicalAction Industries Inc.01232Bolsa de cáscara de 32 oz; Azul; Insertos estériles
de placa de 6 pocillos de un solo uso (insertos CellCrown)SIGMAZ681792-3EA;
membrana filtrante de policarbonatoSIGMATMTP04700filtro de membrana de isoporo; Policarbonato; Hidrofílico; 5.0  y micro; m, 47 y nbsp; mm, Blanco Llano <
fuerte>NombreEmpresa>Número de catálogoComentarios/Descripción
BeuthanasiaSchering-Plough Animal Health Corp. Union (Pedido de MWI Veterinary Supply)MWI #: 011168Ingrediente activo: Por 100 mL, 390 mg de pentobarbital sodio, 50 mg de fenitoína sódica 
KetaminaFort Dodge Animal Health (Pedido de MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Kateset 100 mg/mL
XilacinaLLOYD. Inc. (Pedido de MWI Veterinary Supply)MWI #: 000680Anased 100 mg/mL
Solución salinaBaxter2F7122
PBSInvitrogen14040-133
MEMInvitrogen11095080
PenStrepInvitrogen15140-122
FBSInvitrogen16000-044
BSAJackson ImmunoResearch001-000-162
Saponin SIGMAS7900-100G
Alcohol isopropílicoFisher ScientificS25372
Povidonayodada Operando82-226
Ácido clorhídricoSIGMA320331
MetanolFisher Scientific67-56-1
GlicerolFisher Scientific56-81-5
Conjugado por FITC LectinaSIGMAL9381-2MG
Anti-NG2 Sulfato de condroitina Anticuerpo ProteoglicanoSIGMAAB5320
PECAM (CD31) AnticuerpoBD Biosciences555026
LYVE-1 AnticuerpoAngioBio Co.11-034
Anticuerpo conjugado Cy2 anti-conejo de cabraJackson ImmunoResearch111-585-144
Anticuerpo conjugado Cy3 anti-ratón de cabraJackson ImmunoResearch115-227-003
Anticuerpo conjugado con estreptavidina Cy3Jackson ImmunoResearch016-160-084
Kit de Viabilidad/Citotoxicidad Vivo/Muerto InvitrogenL3224
Suero de cabra normal Jackson ImmunoResearch005-000-121
5-Bromo-2'-DesoxiuridinaSIGMAB5002
Ratón Monoclonal Anti-Bromodeoxyuridina                                              Clon Bu20aDakoM074401-8
ratón anti-rata CD11b AbD SerotecMCA275R
4" de longitud de un solo uso Insertos de placa de 6 pocillos no estéril

Referencias

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