Preparación y Evaluación de 99m Tc-etiquetados tridentado Los quelatos de orientación previa Usando Bioorthogonal Química

Resumen

Aquí, describimos un protocolo para el radiomarcaje y las pruebas in vivo de derivados tridentados de quelato-tetrazina de Tc(I) ^99mpara la química bioortogonal y de pre-targeting.

Resumen

La pre-focalización combinada con la química bioortogonal está emergiendo como una forma efectiva de crear nuevos radiofármacos. De los métodos disponibles, la cicloadición de Diels-Alder (IEDDA) de demanda inversa de electrones entre tetrazinas radiomarcadas y transcicloocteno (TCO) unida a una biomolécula ha demostrado ser un enfoque bioortogonal altamente efectivo para obtener imágenes de objetivos biológicos específicos. A pesar de que el tecnecio-99m sigue siendo el isótopo más utilizado en la medicina nuclear diagnóstica, hay una escasez de métodos para preparar tetrazinas marcadas con ^99mTc. En este trabajo se presenta la preparación de una familia de derivados tridentados-quelados-tetrazina y sus complejos Tc(I). Estos compuestos, hasta ahora desconocidos, se marcaron radiológicamente con ^{99 m}de Tc utilizando un método asistido por microondas con un rendimiento radioquímico del 31% al 83%. Los productos son estables en solución salina y PBS y reaccionan rápidamente con los derivados del TCO in vitro. Sus capacidades de pre-focalización in vivo se demostraron utilizando un derivado de TCO-bifosfonato (TCO-BP) que se localiza en regiones de metabolismo óseo activo o lesión. En estudios murinos, las ^99mTc-tetrazinas mostraron altas concentraciones de actividad en las articulaciones de las rodillas y los hombros, lo que no se observó cuando se realizaron experimentos en ausencia de TCO-BP. La absorción general en órganos no diana y la farmacocinética variaron mucho dependiendo de la naturaleza del enlazador y la polaridad del quelato.

Introducción

^99m Tc sigue siendo el radioisótopo más utilizado en medicina nuclear de diagnóstico, con más de 50 millones de procedimientos de imágenes realizadas por año en todo el mundo ^{1, 2, 3.} La mayoría de los agentes de Tc ^99m usados clínicamente son de tipo perfusión radiofármacos. Hay un número limitado de compuestos dirigidos activamente en la que ^99m Tc se dirige para unir un marcador biológico específico a través de la ligación a un constructo de reconocimiento. La creación de ^99m dirigida radiofármacos Tc es a menudo dificultada por la influencia de ^99m complejos de Tc-ligando en la capacidad de la molécula de direccionamiento de obligar a la biomarcador de interés, o los isótopos de vida media no es lo suficientemente largo para su uso con biomoléculas de mayor peso molecular tales como anticuerpos. Este último requiere típicamente varios días antes de las imágenes se adquieren a fin de que la biomolécula para borrar de no diana tiss UES. Pre-focalización ofrece un enfoque alternativo para superar estos desafíos.

Pre-orientación combinada con la química bioorthogonal ha demostrado ser una forma eficaz para desarrollar nuevas sondas de imagen molecular tanto para fluorescencia y radio-formación de imágenes ^{4, 5, 6, 7, 8.} La reacción de la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEDDA) entre 1,2,4,5-tetrazina (Tz) y derivados -cyclooctene trans (TCO), tal como se muestra en la Figura 1, ha demostrado ser particularmente eficaz ^6. La reacción IEDDA con estos componentes puede exhibir cinética rápida en PBS ₍₂ k ≈ 6.000 M ^-1 s ^-1) y una alta selectividad, por lo que es ideal para in vivo de orientación previa aplicaciones ^{9, 10.}

e_content "> El enfoque más común utilizado implica la administración de un vector de orientación TCO-derivado y después de un período de retardo suficiente, se administra una tetrazina radiomarcado. tetrazinas radiomarcados basado en ¹¹ C, ¹⁸ F, ⁶⁴ Cu, ⁸⁹ Zr, y ¹¹¹ En haber sido reportado ^{11, 12, 13, 14, 15.} por el contrario, sólo hay un informe de un marcado ^{con 99mTc} Tz, que se preparó usando un ligando de tipo HYNIC requerir el uso de co-ligandos para prevenir la unión a proteínas y la degradación in vivo ^16. Como alternativa, se presenta aquí la síntesis de ^99m Tc (I) marcado tetrazinas usando una familia de ligandos que forman complejos estables con un tridentados ^[99m Tc (CO) _3] ⁺ núcleo.

Figura 1: La reacción entre IEDDA bioorthogonal tetrazina y -cyclooctene trans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La familia de ligandos preparadas contienen quelatos tridentados que varían en la polaridad y la naturaleza del grupo de enlace entre la región de unión de metal y el Tz (Figura 2). El objetivo fue identificar una ^Tc-99m tetrazina constructo que podría localizar y reaccionar con los sitios marcados con TCO en vivo y rápidamente claro cuando no estén unidas de manera efectiva, a fin de producir alta objetivo a no objetivo proporciones. Para probar los ligandos, se utilizó un TCO-derivado de un bisfosfonato (TCO-BP) ^17. Hemos demostrado previamente que el TCO-BP se localiza en áreas de metabolismo óseo activo y puede reaccionar contetrazinas radiomarcados en vivo ^18. Es un reactivo conveniente para probar nuevos tetrazinas, ya que se puede preparar en un solo paso y los experimentos se puede realizar en los ratones normales, donde la localización se produce principalmente en las articulaciones (rodillas y hombros).

Protocolo

Los estudios con animales fueron aprobados por el Consejo de Ética de Experimentación Animal de la Universidad McMaster, de acuerdo con el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) directrices.

1. El radiomarcado de ligandos Tz-tridentado con ^99m Tc

PRECAUCIÓN: Los siguientes procedimientos requieren el uso de compuestos radiactivos. El trabajo sólo debe hacerse en un laboratorio autorizado con el cumplimiento de las normas de seguridad y eliminación. reacciones de microondas se deben realizar en un horno de microondas diseñado específicamente para la síntesis química.

1. Síntesis de ^[99m Tc (CO) _{3 (H2O) 3]} ^{+ 19, 20}
   1. En un vial para microondas, combinar 8 mg K ₂ [BH ₃ CO _2], 15 mg Na ₂ CO _3, 20 mg Na ₂ B ₄ O ₇ · 10H ₂ O, y 25 mg KOCO [CH (OH)]₂ COONa · 4H ₂ O. Purgar el vial durante 10 minutos con gas argón.
   2. Añadir 4 ml de ^99m TcO ₄ ^- (~ 1.100 MBq, ~ 30 mCi) en 0,9% de solución salina al vial.
   3. La reacción se calienta en un microondas durante 3,5 min a 110 ° C después de 10 s de agitación para asegurar la mezcla completa de los reactivos.
   4. Ajustar el pH de la solución a 3,5 a 4 utilizando ~ 400 l de HCl 1 M. Comprobar el uso de papel de pH.
2. El radiomarcado de tetrazina ligandos 1-5
   1. Disolver 2 mg de cada ligando (compuestos 1-5) en 250 ml de MeOH ^21.
   2. Añadir 250 l de ^[99m Tc (CO) _{3 (H2O) 3]} ⁺ (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) a cada solución.
   3. Se calienta la mezcla de reacción usando un horno de microondas durante 20 min a 60 ° C.
      NOTA: Este paso fue idéntica para los 5 tetrazinas.
   4. Para los compuestos 2 a 5, se evapora el disolvente y se re-DISSOLve los productos resultantes en 1 ml de 1: 1 v / v DCM: TFA.
   5. Calentar los productos de reacción disueltos (2-5) a 60 ° C en un microondas durante 6 min (2-4) o 10 min (5).
   6. Después de enfriar a temperatura ambiente, se evapora el disolvente usando un evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) y se disuelve el compuesto se seca en 1: 1 ACN: H ₂ O o 1: 1 MeOH: H ₂ O, antes de la purificación por HPLC.
   7. Purificar los compuestos marcados con Tc ^99m (1-5), que incluyen la separación del producto etiquetado de ligando no marcado tetrazina, usando HPLC _(C18 de fase inversa). Típicamente, usar un gradiente de elución de 30:70 ACN: H ₂ O (ambos con 0,1% de TFA) a 40:60 ACN: H ₂ O durante 20 min (18 min) y una columna de 4,6 x 100 mm analítica C _18. Usar tanto UV (254 nm) y detección gamma.
      1. Tomar una pequeña muestra de cada producto marcado y comparar su tiempo de retención HPLC a la de un co-injeja, no radiactivo, estándar marcado con Re (0,125 mg en 20% de metanol-H ₂ O). El estándar Re-marcado se identifica en la traza de HPLC UV, y eluir en el mismo tiempo que el compuesto marcado con Tc ^99m en la traza de γ-HPLC. Esta co-inyección de muestra picos a tiempos de retención comparables, lo que confirma la identidad del compuesto ^99m Tc-etiquetados.
   8. Se evapora el disolvente de las fracciones de HPLC utilizando un evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm).
   9. Formular el compuesto purificado a una concentración de 7,4 kBq / l en PBS, que contenía 0,5% de BSA y 0,01% de Tween-80.
   10. Para garantizar los compuestos marcados son estables, realice un estudio in vitro de la estabilidad en. Incubar el compuesto formulado a 37 ° C durante 1, 4 y 6 h, la inyección de una pequeña cantidad (3,7 MBq) de la mezcla en la HPLC en cada punto de tiempo para evaluar la estabilidad.

2. Pre-Estudios dirigidos biodistribución

1. Preparación de los animales
   1. Utilizando, ratones Balb / c hembras de 7-9 semanas de edad (n = 3), administrar TCO-BP formulado en solución salina (20 mg / kg) (5 mg / l), a través de la cola de inyección venosa.
   2. Coloque el ratón en el dispositivo de restricción física, e identificar las venas situadas en las superficies laterales de la cola y limpie con un algodón con alcohol. En aproximadamente 2 cm desde el extremo de la cola, insertar una aguja de calibre 30 con un ángulo pequeño, en paralelo a la vena. Presione lentamente el émbolo para inyectar, retire la aguja y aplicar esponja de gasa limpia en el sitio de la inyección con una ligera presión hasta que el sangrado se detenga.
   3. A 1 h después de la inyección de TCO-BP, administrar ~ 0,74 MBq (20 Ci) de ^Tc-99m tetrazina formulados en 100 l de BSA al 0,5%, 0,01% de Tween-80 en PBS, a través de la cola de inyección venosa.
2. Los estudios de biodistribución
   1. En el punto de tiempo deseado (t = 6 h), anestesiar los ratones utilizando 3% de isoflurano y mezcla de gases de oxígeno 2%. Demostrar una dee pizca de retirada en el ratón anestesiado para asegurarse de que están bajo plano quirúrgico de anestesia.
   2. Recoger la sangre (1 ml) mediante punción cardíaca usando una jeringa pre-tratado con heparina. Coloque el ratón sobre su espalda con la nariz en el cono de la nariz para la anestesia continua y localizar la apófisis xifoides en el animal.
      1. Insertar una aguja de 25 G, ligeramente a la izquierda de la línea media del animal en el marco del proceso xifoides, en un ángulo de 20 °. Inserte completamente la aguja y tire lentamente el émbolo hacia atrás para ver la sangre en el cubo de la aguja si se perfora el corazón. Ligeramente reajustar la aguja mientras mantiene el émbolo en caso necesario, para perforar el corazón. extraer lentamente sangre en la jeringa.
   3. La eutanasia a los animales por dislocación cervical, mientras que bajo anestesia.
   4. Coloque cada animal en una bolsa de plástico y utilizar un calibrador de dosis ^(99m Tc configuración) para medir el nivel de actividad todo el cuerpo.
   5. Recoge los siguientes tejidos y fluidos pre-pesajeed contando tubos: sangre, médula (rodilla y hombro), la vesícula biliar, los riñones, el hígado, el estómago (con su contenido), los intestinos pequeños (con su contenido), intestino grueso y ciego (con su contenido), la tiroides y la tráquea, vejiga urinaria con orina , y la cola.
   6. Enjuague tejidos apropiados (con exclusión de la sangre, la vesícula biliar y la vejiga urinaria) en PBS para eliminar la sangre y secar antes de colocar los tejidos en tubos de recuento apropiados.
   7. Coloque cadáver animal en una bolsa de plástico y medir la actividad de todo el cuerpo residual utilizando un calibrador de dosis.
   8. Pesar cada tubo que contiene una muestra de tejido. Restar el peso inicial del tubo para obtener la masa del tejido.
   9. Utilice un calibrador de dosis ^(99m Tc ajuste) para medir la cantidad de actividad en una muestra de ensayo (100 l) en el momento de la inyección para cada ratón.
      NOTA: Este muestra de ensayo es igual al volumen de inyección, dando así el recuento de actividad en el momento de la inyección.
   10. En el momento de la medición de tejido, unaliquot 5 l de la muestra de ensayo utilizado anteriormente. Use un contador gamma multi-detector ^(99m Tc configuración) y contar hasta obtener el recuento por minuto (CPM) para la muestra 5 mL.
   11. Usa los dos valores obtenidos en 2.2.9 y 2.2.10 para calcular la actividad y la relación CPM utilizando la ecuación 1 para obtener un factor de conversión (CPM Ci ^-1).
       (1)
   12. Utilice el contador gamma para medir la cantidad de radiactividad en cada muestra de tejido o fluido.
   13. Usar la ecuación 1 para calcular la cantidad de actividad en cada tejido o fluido en el momento de la medición en relación con la dosis total inyectada. Este valor se normalizó por el peso de órganos y se expresa como porcentaje de dosis inyectada por gramo (es decir,% ID / g) de tejido.
   14. Siga los pasos 2.1.2 a 2.2.13 para llevar a cabo un experimento de control negativo utilizando las marcado ^{con 99mTc} ligandos tetrazina en el Absencina de TCO-BP. ratones Sacrificio (n = 3) a las 0,5, 1, 4 y 6 h después de la inyección y obtener tejido o fluido como se describe anteriormente.

Resultados

Los ligandos se sintetizaron utilizando diferentes enlazadores y quelantes a través de una simple estrategia de aminación reductora (Figura 2), seguido de acoplamiento del producto a un tetrazina disponible en el mercado ^{22, 23.} El radiomarcado se realizó utilizando el mismo método para todos los compuestos y era altamente reproducible. El proceso se ha optimizado variando el pH, la cantidad de ligando, tiempo de...

Discusión

Se preparó una colección de quelatos tridentado tetrazina ligados de distintas polaridades, y se evaluó la utilidad de sus complejos ^99m Tc en la reacción con un derivado IEDDA TCO in vivo. Un método eficaz y reproducible ^99m Tc fue desarrollado para cinco tetrazina quelatos, donde la concentración de ligando se 10 ^-3 M. La etapa de marcaje fue seguido por la desprotección de t- butilo (para los compuestos 2-5). La alta concentración de ligando se utili...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Gas argón	Alphagaz	---	---
Na2CO3	EMD Millipore	106395	---
Na2B4O7· 10H2O	Anachemia	S9640	---
KNaC4H4O6· 4H2O	Anachemia	217255	---
Technelite 99mTc Generador	imágenes médicas Lantheus	---	Fuente de 99mTcO4-
0.9% Solución salina	Imágenes médicas de Lantheus	---	Para eluir
el generador 1 M HCl	Lab Chem	---	---
MeOH	Caledon		------
ACN	Caledon	---	HPLC grado
Millipore H2O	Thermo Fisher Scientific	Barnstead Nanopure	---
DCM	Caledon	---	---
TFA	Caledon	---	---
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023	pH 7.4 1x
BSA	Sigma Aldrich	A7906	---
Tween80	Sigma Aldrich	P8047	---
Isoflurano	CDMV		108737 Proveedor: Fresenius Kabi Animal Health
HPLC	Waters	1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (artículo # 15590)	---
Columna de HPLC para análisis y purificación de compuestos 2-4	Phenomenex	00G-4435-E0	Gemini® 5 µ m C18 110  Å, Columna LC 250 x 4,6 mm
Columna HPLC para análisis y purificación de compuestos 1 y 5	Aguas	186003115	Columna XBridge BEH C18, 130 Å, 5 µ m, reactor de microondas de 4,6 mm x 100 mm
	Biotage	Iniciador 8	---
Biotage V10 Evaporador	Biotage	Serial # V1041	---
Calibrador de dosis	Capintec, Inc.	CRC-25R	---
Contador Gamma	Perkin Elmer	Wizard 1470 Contador Gamma Automático	---
Báscula de habitación para animales	Mettler Toledo	XP105 Delta Range	---
Viales para microondas	Biotage	355629	0.5-2 mL