Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

Resumen

Un método de lisis de glóbulos rojos simple para el establecimiento de B-LCLs se desarrolló con una alta eficiencia de la inmortalización, lo que requiere una pequeña cantidad de sangre y el ahorro de tiempo desde el inicio de la crioconservación.

Resumen

Existen varios métodos para la transformación de linfocitos B por el virus de Epstein Barr in vitro en líneas celulares inmortalizadas. Hemos desarrollado un nuevo método con una estrategia potente y sencilla para el establecimiento de B-LCLs, el método de lisis de glóbulos rojos. Este método simplificó el procedimiento de separación de PBMC con la extracción de glóbulos rojos y utilizó tan solo 0,5 ml de sangre completa para establecer líneas celulares inmortalizadas por el VEB, que pueden proliferar a grandes cantidades de células en un período de tiempo relativamente corto con una tasa de éxito del 100%. El método es sencillo, fiable, ahorra tiempo y es aplicable al tratamiento de un gran número de muestras clínicas.

Introducción

Las células B en reposo podrían ser transformadas por el virus de Epstein-Barr (VEB) in vitro en líneas de células linfoblastoides B en proliferación activa (B-LCLs). Las B-LCLs son similares a las células germinales en diferenciación y desarrollo, y la tasa de mutación somática de las B-LCLs fue solo del 0,3%¹, con una alteración genética y fenotípica insignificante. Por lo tanto, las B-LCLs, como sustitutos de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), han acelerado sustancialmente el progreso del estudio de la genómica, la transcriptómica y la proteómica de las enfermedades asociadas al VEB^2,3. Además, las B-LCLs también tienen una aplicación importante en el cribado de anticuerpos monoclonales^4,5.

Se han desarrollado varios métodos para la inmortalización de linfocitos B por el VEB. Los procedimientos más comunes incluyen el aislamiento de linfocitos B y el uso de líneas celulares B95-8 para producir VEB infeccioso. Desde el aislamiento hasta la transformación, estos métodos se dividen en tres estrategias. Los linfocitos se separan de la sangre fresca mediante centrifugación en gradiente de densidad y transformación del VEB directamente^6-8, denominado método de separación en gradiente de densidad en este estudio. Sin embargo, otras técnicas superan la dificultad de enviar sangre fresca y utilizan un procedimiento para la congelación de linfocitos purificados y la posterior descongelación e infección por VEB^9-11. La sangre entera criopreservada también puede utilizarse para el aislamiento de linfocitos B y la transformación^12,13. Además de la centrifugación en gradiente de densidad para separar los linfocitos B, algunos investigadores utilizan un clasificador magnético de células para seleccionar los linfocitos B¹². Sin embargo, la separación magnética es un proceso costoso, complejo y que requiere mucho tiempo. Aunque estos métodos son útiles para inmortalizar linfocitos B con una alta tasa de éxito, la necesidad de tratar un gran número de muestras clínicas y el volumen relativamente pequeño de sangre requieren un método más simple para el establecimiento de una línea celular permanente.

Otro método menos utilizado es el uso de sangre entera como fuente de células nucleadas para la infección por EBV y el establecimiento de B-LCL. Estos métodos simplifican la técnica al omitir el procedimiento de separación. Solo una pequeña cantidad de sangre entera, ya sea fresca¹⁴ o^{congelada 15,16}, es suficiente para obtener las líneas celulares. Desafortunadamente, existe una gran variabilidad en el éxito de los documentos^15,16 y varias de nuestras pruebas de validación. Además, las colonias transformadas apenas se reconocen bajo un microscopio debido a las grandes impurezas contaminantes. Por lo tanto, se requiere un método más confiable para la transformación.

Basándonos en las consideraciones anteriores, hemos desarrollado un método novedoso para establecer B-LCLs sin purificación previa de los linfocitos, llamado método de lisis de glóbulos rojos. Este método es conveniente, ahorra tiempo y es aplicable a una gran cantidad de muestras. Tan solo 0,5 mL de sangre entera fue suficiente para obtener B-LCL que se pueden obtener fácilmente de bebés y ancianos sin dañar significativamente su salud.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Genética y Biología del Desarrollo, y el protocolo sigue las directrices institucionales para el bienestar humano.

1. Preparación de virus EB

1. En el día 1, descongelar las células B95-8 y la cultura en 6 ml de RPMI completo 1640, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, y antibióticos (100 mg / ml de estreptomicina, 100 U / ml de penicilina) en una matraz de cultivo T25. Colocar el frasco de cultivo en 5% de _CO2 a 37 ° C.
2. En el día 2, observar la morfología de las células bajo un microscopio. Las células están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondas. Añadir 10 ml de medio completo RPMI 1640.
3. El día 4, se añaden 10 ml de medio completo RPMI 1640, y luego se transfieren a un matraz de cultivo T75.
4. En el día 8, se añaden 20 ml de medio completo RPMI 1640.
5. Mantener las células durante 8 días sin la adición de medio fresco, es decir, el hambre.
6. En el día 16, observe las célulasobservado bajo el microscopio. Recoger las células en un tubo de centrífuga de 15 ml, 12 ml / tubo.
7. Crio-preservar a -80 ° C durante 1 h, y luego descongelar rápidamente a 37 ° C. Repetir 3 veces hasta que las partículas de virus se liberan de las células.
8. Centrifugar a 240 xg durante 10 min a temperatura ambiente.
9. Se filtra el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 micras, alícuota de 12 ml / tubo, y se almacena a -80 ° C.

2. El tratamiento de la sangre entera con glóbulos rojos tampón de lisis

1. Añadir 0,5 ml de sangre total anticoagulada con EDTA · K ₂ a un tubo de 15 ml.
2. Ponga 1 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos (filtrada por 0.22 m filtro y descongelado a temperatura ambiente antes de su uso) para la sangre entera y mezclar bien. Colocar la mezcla a temperatura ambiente durante 4 min. A continuación, añadir de 5 - 7 ml de PBS 1x rápidamente a la reacción de parada.
3. Centrifugar a 240 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Los glóbulos blancos se precipitarán en la parte inferior del tubo.
4. Descartar el sobrenadante, y se lava la precipitación mediante la adición de 7 ml 1,640 medio básico. Centrifugar durante 5 min a 240 xg a temperatura ambiente. Repetir dos veces.
5. Resuspender el sedimento celular en 300 medio de transformación l (medio RPMI 1640, que contiene 20% de suero bovino fetal y 10 mg / ml de fitohemaglutinina (PHA)).

La infección por VEB 3.

1. Añadir 60 l de 20 mg / ml de ciclosporina A (CsA) a la suspensión celular.
2. Descongelar rápidamente una alícuota de EBV a 37 ° C. Añadir 240 l EBV a la suspensión celular.
3. Mezclar bien y colocar la suspensión celular a una placa de 96 pocillos, a 200 l por pocillo. Para evitar la evaporación, añadir 200 l de 1x PBS a cada pozo alrededor de la placa de 96 pocillos. Colocar la placa en un incubador de _CO2 al 5% a 37 ° C.

4. La expansión y la criopreservación de B-LCL

1. Cambiar la mitad del medio una vez por semana durante el primer mes después de la infección por VEB. Sólo una gruesa Layer de fragmentos de células es visible bajo el microscopio en el día 7 (Figura 2). Después de un mes de la infección por EBV, grupos de células linfoblastoides son visibles bajo una gruesa capa de fragmentos de células bajo el microscopio (Figura 2).
2. Cambiar la mitad del medio cada 3 días hasta que los grupos de células son claramente visibles bajo el microscopio (Figura 2). Por lo general, este proceso tarda de 10 a 20 días.
3. Después de mezclar, pipetear las células y la transferencia a la placa de 24 pocillos. Duplicar el volumen de medio de cultivo con RPMI 1640 completo, mientras que se vuelva amarillo. Este proceso depende de la tasa de crecimiento celular.
4. Posteriormente, la transferencia de las células al matraz de cultivo T25. El doble del volumen de medio de cultivo, ya que se vuelve amarillo hasta que el volumen de medio se expande a 10 a 15 mL.
5. Cambio de medio 24 h antes de la congelación. suspensión de células Centrifugar durante 5 min a 240 x g. Contar las células con un contador de células y se congelan a una densidad de 5 a 10 x 10 ⁶ / ml en frsolución madre ozen que contiene 90% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelar a una velocidad de 1 ° C por minuto a -80 ° C y luego transferir directamente en nitrógeno líquido.

5. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) ensayo de ¹⁷

1. Preparar una suspensión de células individuales B-LCLs con el medio de 1640 que contiene suero bovino fetal 10%. Semilla 3 x 10 ⁴ células por pocillo en placas de 96 pocillos, 100 l por pocillo.
2. Colocar la placa en 5% de _CO2 a 37 ° C por 12 - 16 h.
3. Añadir MTT (5 mg / ml) a los pocillos en los que las células están creciendo y mantenerse alejado de la luz durante 4 horas a 37 ° C.
4. placa de células se centrifuga durante 10 min a 168 x g.
5. Aspirar el sobrenadante y añadir 100 l de DMSO por pocillo.
   NOTA: Tenga cuidado. No toque los cristales tintados en forma de aguja.
6. Agitar la placa durante 10 minutos a baja velocidad para disolver completamente los cristales.
7. Medida de absorción a 570 nmusando un espectrofotómetro de microplacas.

Resultados

Durante el proceso de transformación, los cambios morfológicos de células se visualizaron por microscopía de luz (Figura 2). Pequeños grupos de células eran claramente visibles con el método de separación en gradiente de densidad después de 7 días de la infección, mientras que sólo una capa gruesa de fragmentos de células son visibles desde el método de lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, los grupos de células linfoblásticas son visibles bajo la gruesa capa de fragment...

Discusión

Se presenta el desarrollo de un nuevo método para inmortalizar células B humanas a partir de sangre completa por lisis de las células rojas de la sangre, y su viabilidad celular de establecido B-LCLs se evaluó por el ensayo MTT. Los resultados mostraron que la viabilidad de las células de B-LCLs establecidos por el método de lisis de glóbulos rojos es mucho mayor que la del método de separación en gradiente de densidad. La principal ventaja del método de lisis de glóbulos rojos es que es simple y requiere un pequeño vol...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Centrífuga	Techcomp	CT6T
Contador de celdas automatizado de centrifugación	Countstar	IC 1000	Para el conteo de células
Epoch Microplate Espectrofotómetro	BioTek Instruments	SN263839	Para medir la absorbancia
96 pocillos grupo de cultivo celular	Corning Incorporated	3599	Placas de poliestireno 24
pocillos Clúster de cultivo celular	Corning Incorporated	3524	Placas de poliestireno
25 cm2 matraz de cultivo celular	Nest	707001	Poliestireno& nbsp;
FBS	Gibco	10270	Componente de B-LCLs medio
RPMI Medio 1640	Gibco	31800-022	Para B-LCLs medio
L-Glutamina	Amresco	0374	Componente del medio B-LCLs
100x solución de penicilina estreptomicina BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Componente del medio B-LCLs
Ficoll paque plus	GE  Cuidado de la salud	17-1440-03	Para el aislamiento > de linfocitos
PHA-M	Sigma	L8902	Para estimular la proliferación de linfocitos
Ciclosporina A	Caimán  Químico	12088	Para inhibir el efecto de citotoxicidad de los linfocitos T
Tampón de lisis de glóbulos rojos	Tiangen	RT122-01	Para lisar glóbulos rojos
MTT	Amresco	0793	Para la detección de la viabilidad celular
DMSO	Sigma	D2650	Para congelar células