Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

Resumen

Un método de lisis de glóbulos rojos simple para el establecimiento de B-LCLs se desarrolló con una alta eficiencia de la inmortalización, lo que requiere una pequeña cantidad de sangre y el ahorro de tiempo desde el inicio de la crioconservación.

Resumen

Existen varios métodos para la transformación de linfocitos B por el virus de Epstein Barr in vitro en líneas celulares inmortalizadas. Hemos desarrollado un nuevo método con una estrategia potente y sencilla para el establecimiento de B-LCLs, el método de lisis de glóbulos rojos. Este método simplificó el procedimiento de separación de PBMC con la extracción de glóbulos rojos y utilizó tan solo 0,5 ml de sangre completa para establecer líneas celulares inmortalizadas por el VEB, que pueden proliferar a grandes cantidades de células en un período de tiempo relativamente corto con una tasa de éxito del 100%. El método es sencillo, fiable, ahorra tiempo y es aplicable al tratamiento de un gran número de muestras clínicas.

Introducción

Las células B en reposo podrían ser transformadas por el virus de Epstein-Barr (VEB) in vitro en líneas de células linfoblastoides B en proliferación activa (B-LCLs). Las B-LCLs son similares a las células germinales en diferenciación y desarrollo, y la tasa de mutación somática de las B-LCLs fue solo del 0,3%¹, con una alteración genética y fenotípica insignificante. Por lo tanto, las B-LCLs, como sustitutos de las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), han acelerado sustancialmente el progreso del estudio de la genómica, la transcriptómica y la proteómica de las enfermedades asociadas al VEB^2,3. Además, las B-LCLs también ....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Genética y Biología del Desarrollo, y el protocolo sigue las directrices institucionales para el bienestar humano.

1. Preparación de virus EB

1. En el día 1, descongelar las células B95-8 y la cultura en 6 ml de RPMI completo 1640, suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, y antibióticos (100 mg / ml de estreptomicina, 100 U / ml de penicilina) en una matraz de cultivo T25. Colocar el frasco de cultivo en 5% de _CO2 a 37 ° C.
2. En el día 2, observar la morfología de las células bajo un microscopio. Las células están en buenas condiciones cuando son ....

Resultados

Durante el proceso de transformación, los cambios morfológicos de células se visualizaron por microscopía de luz (Figura 2). Pequeños grupos de células eran claramente visibles con el método de separación en gradiente de densidad después de 7 días de la infección, mientras que sólo una capa gruesa de fragmentos de células son visibles desde el método de lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, los grupos de células linfoblásticas son visibles bajo la gruesa capa de fragment.......

Discusión

Se presenta el desarrollo de un nuevo método para inmortalizar células B humanas a partir de sangre completa por lisis de las células rojas de la sangre, y su viabilidad celular de establecido B-LCLs se evaluó por el ensayo MTT. Los resultados mostraron que la viabilidad de las células de B-LCLs establecidos por el método de lisis de glóbulos rojos es mucho mayor que la del método de separación en gradiente de densidad. La principal ventaja del método de lisis de glóbulos rojos es que es simple y requiere un pequeño vol.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Centrífuga	Techcomp	CT6T
Contador de celdas automatizado de centrifugación	Countstar	IC 1000	Para el conteo de células
Epoch Microplate Espectrofotómetro	BioTek Instruments	SN263839	Para medir la absorbancia
96 pocillos grupo de cultivo celular	Corning Incorporated	3599	Placas de poliestireno 24
pocillos Clúster de cultivo celular	Corning Incorporated	3524	Placas de poliestireno
25 cm2 matraz de cultivo celular	Nest	707001	Poliestireno& nbsp;
FBS	Gibco	10270	Componente de B-LCLs medio
RPMI Medio 1640	Gibco	31800-022	Para B-LCLs medio
L-Glutamina	Amresco	0374	Componente del medio B-LCLs
100x solución de penicilina estreptomicina BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Componente del medio B-LCLs
Ficoll paque plus	GE  Cuidado de la salud	17-1440-03	Para el aislamiento > de linfocitos
PHA-M	Sigma	L8902	Para estimular la proliferación de linfocitos
Ciclosporina A	Caimán  Químico	12088	Para inhibir el efecto de citotoxicidad de los linfocitos T
Tampón de lisis de glóbulos rojos	Tiangen	RT122-01	Para lisar glóbulos rojos
MTT	Amresco	0793	Para la detección de la viabilidad celular
DMSO	Sigma	D2650	Para congelar células