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Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

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DOI:

10.3791/55203

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26 de junio de 2017

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1UMR 1188 Diabète athérothombose Thérapie Réunion Océan Indien (DéTROI), Saint-Denis de La Réunion, France, Université de La Réunion, INSERM, 2RIPA (Radiochimie et Imagerie du Petit Animal), Cyclotron de la Réunion Océan Indien CYROI, 3CHU de La Réunion

En este artículo

Resumen

Este trabajo describe métodos para establecer modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra. El objetivo es investigar el impacto de la hiperglucemia sobre los procesos fisiológicos, tales como la neurogénesis constitutiva y la inducida por lesión. El trabajo también destaca el uso de pez cebra para seguir moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.

Resumen

La hiperglucemia es un problema de salud importante que conduce a la disfunción cardiovascular y cerebral. Por ejemplo, se asocia con un aumento de los problemas neurológicos después del accidente cerebrovascular y se muestra que perjudica los procesos neurogénicos. Curiosamente, el pez cebra adulto ha emergido recientemente como un modelo relevante y útil para imitar la hiperglucemia / diabetes y para investigar la neurogénesis constitutiva y regenerativa. Este trabajo proporciona métodos para desarrollar modelos de hiperfeminismo de pez cebra para explorar el impacto de la hiperglucemia en la proliferación de células cerebrales bajo condiciones homeostáticas y de reparación cerebral. La hiperglucemia aguda se establece mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) en el pez cebra adulto. La hiperglucemia crónica se induce por inmersión de pez cebra adulto en D-glucosa (111 mM) que contiene agua durante 14 días. Se describen mediciones de nivel de glucosa en la sangre para estos diferentes enfoques. Métodos para investigar el impacto de la hiperglucemia sobreY la neurogénesis regenerativa, mediante la descripción de la lesión mecánica del telencéfalo, la disección del cerebro, la inclusión de parafina y la sección con un microtomo, y la realización de procedimientos inmunohistoquímicos. Finalmente, se describe también el método de utilizar el pez cebra como modelo relevante para estudiar la biodistribución de moléculas radiomarcadas (aquí, [18F] -FDG) utilizando PET / CT.

Introducción

La hiperglucemia se define como niveles excesivos de glucosa en la sangre. A pesar de que podría reflejar una situación de estrés agudo, la hiperglicemia es también una condición que a menudo conduce a un diagnóstico de diabetes, un trastorno crónico de la secreción de insulina y / o resistencia. En 2016, el número de adultos que viven con diabetes ha alcanzado 422 millones en todo el mundo, y cada año, 1,5 millones de personas mueren de esta enfermedad, por lo que es un problema de salud importante 1 . De hecho, la diabetes no controlada conduce a varios trastornos fisiológicos que afectan al sistema cardiovascular, a los riñones y al sistema nervioso periférico y central.

Curiosamente, la hiperglucemia aguda y crónica puede alterar la cognición y contribuir a la demencia y la depresión 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Además, la admisión de pacientes wLa hiperglicemia se ha asociado con peores resultados funcionales, neurológicos y de supervivencia después del accidente cerebrovascular isquémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . También se demostró que la hiperglucemia / diabetes afecta la neurogénesis de adultos, un proceso que conduce a la generación de nuevas neuronas, por el impacto de la actividad de las células madre neurales y la diferenciación neuronal, la migración y la supervivencia [ 2 , 12] .

En contraste con los mamíferos, los peces teleósteos, como el pez cebra, muestran una intensa actividad neurogénica en todo el cerebro y muestran una capacidad excepcional para la reparación del cerebro durante la edad adulta 13 , 14 , 15 , 16 . Cabe destacar que estas capacidades son posibles debido a la persistencia de neuRal / células progenitoras, incluyendo glia radial y neuroblastos [ 17 , 18 , 19] . Además, el pez cebra ha surgido recientemente como un modelo para estudiar los trastornos metabólicos, incluyendo obesidad e hiperglucemia / diabetes 20 , 21 , 22 .

Aunque el pez cebra es un modelo bien reconocido de hiperglucemia y neurogénesis, pocos estudios han investigado el impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la función cognitiva 12 , 23 . Para determinar el impacto de la hiperglucemia sobre la proliferación de células cerebrales constitutivas y lesionadas, se creó un modelo de hiperglucemia aguda mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa. Además, se reprodujo un modelo de hiperglucemia crónica a través de la inmersión de peces en agua suplementada wCon D-glucosa 12 . Zebrafish exhiben muchas ventajas en la investigación. Son baratos, fáciles de levantar y transparentes durante las primeras etapas de desarrollo, y su genoma ha sido secuenciado. En el contexto de este trabajo, también muestran varias ventajas adicionales: (1) comparten procesos fisiológicos similares con los humanos, haciéndolos una herramienta crítica para la investigación biomédica; (2) permiten una rápida investigación del impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la neurogénesis, dada su amplia y fuerte actividad neurogénica; Y (3) son un modelo alternativo, que permite la reducción del número de mamíferos utilizados en la investigación. Finalmente, el pez cebra puede usarse como un modelo para probar la biodistribución de moléculas radiomarcadas y agentes terapéuticos potenciales usando PET / CT.

El objetivo general del siguiente procedimiento es visualizar visualmente cómo configurar modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra, use zebRafish para evaluar la remodelación cerebral en condiciones hiperglucémicas y monitorear las moléculas radiomarcadas (aquí, [ 18 F] -FDG) utilizando PET / CT.

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Protocolo

El pez cebra de tipo salvaje adulto ( Danio rerio ) se mantuvo en condiciones normales de fotoperiodo (14/10 h luz / oscuridad) y temperatura (28 ° C). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las Directrices de la Comunidad Francesa y de la Comunidad Europea para el Uso de Animales en la Investigación (86/609 / EEC y 2010/63 / EU) y fueron aprobados por el Comité de Ética local para la experimentación con animales.

1. Establecimiento de un modelo de hiperglucemia aguda en peces cebra

  1. Preparar una solución madre de tricaína (MS-222) disolviendo 400 mg de tricaína en polvo en 97,9 ml de agua y 2,1 ml de tampón Tris / HCl 1 M (pH 9). Ajustar el pH a 7 y alícuota para el almacenamiento a -20 ° C.
  2. Prepare un anestésico para el pez cebra adulto poniendo 5 mL de tricaína (solución madre) en 100 mL de agua de pescado (concentración final de tricaína: 0,02%).
  3. Transferir un pez cebra (3 a 6 meses) desde su tanque hasta el anestésico hasta que deje de moverse.
  4. ReMueva el pescado con una pipeta cortada y séquelo rápidamente en papel absorbente.
  5. Pesar el pescado.
  6. Preparar una jeringa de D-glucosa disuelta en 1X PBS e inyectar 50 μL de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal).
    NOTA: Por ejemplo, un pescado de 0,6 g recibirá 50 μl de solución de D-glucosa al 3% / PBS.
  7. Coloque el pez en su espalda e inserte la aguja de la jeringa en la cavidad intraperitoneal.
  8. Inyecte lentamente la solución de D-glucosa / PBS y luego coloque los peces de nuevo en el agua.
  9. Compruebe el pescado hasta que se recupere por completo. Regrese a su tanque hasta que se alcance el tiempo requerido para realizar la medición de glucosa en sangre.
    NOTA: La glucosa en la sangre se mide 1,5 h después de la inyección.

2. Establecimiento de un modelo de hiperglucemia crónica en peces cebra

  1. Prepare un tanque de agua limpia de 2 l.
  2. Disolver 40 g de D-glucosa en 2 L de agua de pescado para una concentración final de D-glucosa de111 mM.
  3. Sumerja 5 a 7 pez cebra adulto en el agua que contiene D-glucosa.
  4. Reemplace el agua de peces D-glucose cada 2 días para evitar el crecimiento de bacterias u otros microorganismos.
  5. Después de 14 días de tratamiento, coloque el pescado brevemente en agua dulce para retirar la D-glucosa fuera del cuerpo antes de tomar la medición del nivel de glucosa en la sangre.

3. Medición de los niveles de glucosa en sangre en el pez cebra

  1. Cubra el pez con hielo para una rápida eutanasia.
    NOTA: No use una sobredosis de tricaína, ya que esto induce grandes variaciones en los niveles de glucosa en la sangre. No deje el pescado en el hielo por mucho tiempo, ya que esto hará que la sangre coagule.
  2. Limpie el pescado con papel absorbente para eliminar todo el agua y para evitar cualquier dilución de sangre durante la medición de glucosa en sangre.
  3. Retire un ojo usando una pinza de disección y espere hasta que la cavidad ocular esté llena de sangre.
  4. Coloque una tira reactiva sobre un glucómetro yInserte la tira en la cavidad ocular.
  5. Mida los niveles de glucosa en la sangre.

4. Análisis de la proliferación de las células cerebrales después de la hiperglucemia

  1. Soluciones y amortiguadores: requisitos y preparación
    1. Se prepara 1 l de 1x PBS añadiendo 100 mL de PBS 10x a 900 mL de H2O destilada (dH2O) y se mezcla.
    2. Preparar 1x PBS con detergente al 0,2% (PBS-T, ver tabla de materiales).
      NOTA: Para preparar 1 L de PBS-T, agregue 2 mL de detergente (ver Tabla de Materiales ) a 1 L de PBS.
    3. Preparar una serie de etanol (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50% y 30%) y 0,85% de NaCl.
    4. Preparar un tampón de bloqueo: PBS-T que contiene 0,5% a 1% de leche en polvo.
      NOTA: Para preparar 200 mL de tampón de bloqueo, agregue 2 g de leche en polvo a 200 mL de PBST.
    5. Preparar el tampón de recuperación de antígeno, citrato de sodio.
      NOTA: Para preparar 1 L de tampón de citrato de sodio, añadir 2,94 g de citrato de sodio triSal de sodio deshidratar a 1 L de dH $ ₂ $ 0. Ajustar el pH a 6 antes de llenar a 1 L.
    6. Se prepara un tampón de paraformaldehído-PBS al 4%, añadiendo 4 g de paraformaldehído a 100 ml de 1x PBS. Calentar bajo agitación a 58-60 ° C hasta que se disuelva completamente.
  2. Preparación de muestras para inmunohistoquímica: fijación y deshidratación
    1. Después de medir el nivel de glucosa en sangre, separe la cabeza del cuerpo cortando la cabeza detrás de las branquias.
      Nota: Alternativamente, el cerebro puede extraerse directamente y congelarse para otros experimentos, como la extracción de mRNA.
    2. Se fijan los cabezales durante la noche a 4ºC en paraformaldehído al 4% disuelto en PBS (PFA-PBS).
    3. Al día siguiente, lavar brevemente las cabezas en PBS.
    4. Diseccionar los cerebros cuidadosamente con un microscopio. Enjuague las cabezas fijas con PBS y use una aguja para asegurar una cabeza debajo de un microscopio de disección. Retire los ojos y la parte superior del cráneo con fórceps. CarefuExtraer el cerebro y colocarlo en 1x PBS.
    5. Lavar sucesivamente los cerebros fijos con 1x PBS durante 30 minutos, NaCl al 0,85% durante 30 minutos, EtOH al 70% / NaCl al 0,85% (v / v) durante 15 min, EtOH al 70% durante 15 min (dos veces), EtOH al 85% durante 20 Min, EtOH al 95% durante 20 min y EtOH al 100% durante 20 min (dos veces). Incubar durante la noche en una solución final al 100% EtOH.
      NOTA: Los cerebros deshidratados pueden permanecer durante varios meses en EtOH al 100% a 4 ° C antes de la incrustación de parafina.
  3. Preparación de muestras para inmunohistoquímica: preparación de tejidos para inclusión de parafina
    1. Coloque los cerebros en un vaso de vidrio pequeño.
      NOTA: No utilice recipientes de plástico, ya que el tolueno puede dañar algunos plásticos.
    2. Eliminar el etanol y reemplazarlo con tolueno, ya que el cerebro debe ser totalmente recuperado por el tolueno. Realizar dos baños de 30 minutos de tolueno.
    3. Retire el tolueno y coloque los cerebros en un casete de empotramiento. Coloque el cassette cerrado en vasos de la serie de parafina derretida a 58 - 60ºC (30 min en cada vaso de parafina). Encienda la pinza de inclusión de calentamiento. Al final de los baños de parafina, saque el casete y vierta un poco de parafina líquida en un molde.
    4. Vierta la parafina derretida en un molde y coloque el cerebro dentro. Orientar el cerebro con la pinza de inclusión de calentamiento, utilizando la orientación anteroposterior del cerebro como guía. Deje que la parafina se endurezca en la parte de enfriamiento de la máquina de incrustación.
    5. Por razones técnicas, posicionar los cerebros a lo largo del eje anteroposterior. Después de desmoldar el bloque de parafina, recórtelo y fijarlo en un casete, con la parafina fundida en la orientación adecuada para permitir la sección transversal.
    6. Inserte el bloque de parafina en el brazo del micrótomo. Corte secciones de 50 μm de espesor hasta que el nivel de la muestra cerebral se alcanza. Recortar el bloque de parafina para obtener un trapecio y ajustar el grosor de corte a 7 μm. Recoger las cintas de parafina con pinceles y colocarlos en la papEr Cortarlos suavemente cada 3 a 4 secciones.
    7. Ponga una diapositiva en un plato de calentamiento y cúbrala con agua dH 2 O.
    8. Coloque suavemente las cintas cortadas en el agua. Retire el agua con papel absorbente cuando las cintas de parafina estén lo suficientemente extendidas / desplegadas. Quite las últimas gotas mecánicamente. Retire el agua de los portaobjetos y déjelos secar durante al menos 3 h en la placa de calentamiento a una temperatura de unos 30-40 ° C.
  4. Procedimiento inmunohistoquímico
    1. Retire la cera de parafina colocando secciones en tres recipientes de xileno durante 7 min cada uno.
    2. Rehidratar las secciones poniendo los portaobjetos en dos recipientes de EtOH al 100% durante 2 min cada uno, seguidos de baños de EtOH al 95%, EtOH al 85%, EtOH al 70% y EtOH al 30% durante 30 s cada uno. Finalmente, ponga brevemente los portaobjetos en dH2O y dos veces en PBS durante 5 min cada uno.
    3. Realizar la recuperación del antígeno mediante la incubación de las secciones en tampón citrato en un microondas (2 min a 500 W) hastaEl tampón empieza a hervir. Deje que las diapositivas se recuperen a temperatura ambiente durante 15 min.
    4. Lavar tres veces en PBST, 5 minutos cada uno, y bloquear las secciones durante 45 min en PBST que contiene 1% de leche. Incubar durante la noche con anticuerpos primarios ( p.ej. antígeno nuclear de células proliferantes (PCNA) para tinción proliferativa de células; 1/100) diluido en tampón de bloqueo ( es decir , PBST, 1% de leche).
    5. Lavar tres veces en PBST, 5 minutos cada una, e incubar las secciones durante 90 minutos con anticuerpos secundarios apropiados ( por ejemplo, anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488; 1/200) diluidos en tampón de bloqueo y con DAPI (1/500).
    6. Lavar tres veces en PBST, 5 min cada uno, y montar los portaobjetos con medio de montaje fluorescente (ver tabla de materiales).
    7. Analizar la tinción utilizando una epifluorescencia y / o microscopio confocal.
    8. Cuantificar la proliferación de células cerebrales en al menos tres secciones cerebrales sucesivas de una región de interés en al menos tresImals
      NOTA: Alternativamente, la inserción cerebral se puede hacer en agarosa para proceder a la sección de vibratome y inmunohistoquímica de libre flotación, como se describió anteriormente [ 24] .
  5. Estudiar el impacto de la hiperglucemia en los mecanismos de reparación cerebral
    NOTA: Alternativamente, la investigación de la reparación cerebral en hiperglucemia aguda y crónica puede realizarse después de una lesión por herida por punción del telencéfalo, como se describió anteriormente 24 , 25 , 26 . Brevemente:
    1. Anestesiar el pez cebra adulto con tricaine.
    2. Coloque el pescado bajo un microscopio de disección con luz.
    3. Sostenga el pescado con una mano.
    4. Con la otra mano, insertar una jeringa de 30 G verticalmente a través del cráneo en la región medial del hemisferio telencefálico derecho.
    5. Coloque el pescado en agua de pescado fresco, agua suplementada con D-glucosa (111MM), o controlar el agua de los peces. Permita que el pez sobreviva durante 7 días después de la lesión.
      NOTA: Consulte el paso 4 para el resto del procedimiento.

5. Imaginación de la biodistribución de moléculas radiomarcadas por PET / CT en peces cebra: Fluorodesoxiglucosa ([18F] -FDG) para analizar el metabolismo de la glucosa

  1. Preparar una jeringa de 50 μL que contiene 20 MBq de una solución salina de [18F] -FDG.
  2. Coloque la jeringa detrás de la pantalla de protección contra la radiación.
  3. Anestesiar un pez cebra adulto con tricaine.
  4. Coloque el pescado detrás de una pantalla de protección contra las radiaciones.
  5. Inyectar [18F] -FDG en la cavidad intraperitoneal. Limpie el sitio de la inyección con un pedazo pequeño de papel de seda para prevenir la detección del [18F] -FDG residual que podría salirse del vientre de los peces.
  6. Utilice un calibrador de radioisótopos para medir la actividad restante contenida en la jeringa y el tejido para calcular la dosis exacta inyectada.
  7. Coloque el pescado en unaEw, pequeño pedazo de tejido absorbente empapado con tricaine y suavemente envolverlo. Coloque el pescado con el tejido absorbente en el lecho del PET / CT.
  8. Inserte la cama en el sistema de imagen PET / CT e inicie la adquisición.
  9. Proceda a realizar la adquisición de PET / CT.
  10. Al final del procedimiento, coloque el pescado de nuevo en una pequeña cantidad de agua de pescado fresco.
    NOTA: Alternativamente, después de la inyección de [18F] -FDG, el pescado se puede volver a introducir en una pequeña cantidad de agua dulce durante 10 min a 1 h para facilitar la difusión de [18F] -FDG antes de anestesiar de nuevo el pescado PET / Tomografía computarizada.

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Resultados

Utilizando los procedimientos descritos en este artículo, se realizó una inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) en pez cebra adulto y se produjo un aumento significativo de los niveles de glucosa en sangre 1,5 h después de la inyección ( Figura 1A ). 24 h después de la inyección, los niveles de glucosa en sangre fueron similares entre D-glucosa y PBS inyectado de peces [ 12] . Para el tratamiento crónico,...

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Discusión

Este trabajo describe varios métodos para establecer modelos agudos y crónicos de hiperglucemia en el pez cebra. Las principales ventajas de estos procedimientos son: (1) permitir una reducción en el número de mamíferos utilizados para la investigación, (2) son fáciles de configurar y de implementar rápidamente, y (3) son económicos. Por lo tanto, estos modelos permiten investigar el impacto de la hiperglucemia en un gran número de animales para estudiar su impacto en diferentes procesos fisiológicos, incluyendo aterotr...

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Divulgaciones

No se revelaron conflictos potenciales de interés.

Agradecimientos

Agradecemos a la Dirección de Usos del Número (DUN) de la Universidad de la Reunión por editar el video (en particular Jean-François Février, Eric Esnault y Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan por la voz en off, Mary Osborne-Pellegrin por la corrección de pruebas La voz en off, y la plataforma CYROI. Este trabajo contó con el apoyo de becas de la Universidad de La Reunión, del Consejo Régional de la Reunión, de la Unión Europea (CPER / FEDER) y de la asociación Philancia. ACD es becario del Ministerio de Educación Nacional, de la Enseñement Supérieur et de la Recherche, de la Universidad de la Reunión (Contrat Doctoral).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa Luer-Lok de 1 mlBD, EE. UU.309628
4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI)Sigma-Aldrich, AlemaniaD8417
7 mL contenedor de bijou laboratorio lisoDutscher, Francia080171
D-glucosaSigma-Aldrich, Alemania67021
Cámara digitalCiencias de la vida, JapónHamamatsu ORCA-ER
Moldes de base desechables Simport, CanadáM475-2
Burro anti-conejo Alexa fluor 488Life Technologies, EE. UU.A21206
Centro de incrustaciónThermo Scientific, EE. UU.Microscopio de fluorescencia Shandon Histocentre 3
Nikon, JapónEclipse 80i
Fluorodesoxiglucosa (18F-FDG)Ciclotrón, Francia
Tira reactiva de glucómetroLifeScan, FranciaOne-Touch 143 Ultra Goat
anti-mouse Alexa fluor 594Life Technologies, EE. UUA11005
In-Vivo Sistema de imágenesTriFoil Imaging, CanadáTriumph Trimodality 
MicrotomoThermo Scientific, EE. UU.Microm HM 355 S
Ratón monoclonal anti-PCNADAKO, EE. UU.clon PC10
Paraformaldehído (PFA)Sigma-Aldrich, AlemaniaP6148-500G
Conejo policlonal anti-GFAPDAKO, EE. UU
Banco de secado de portaobjetosElectrotermal, EE. UUMH6616
Cloruro de sodioSigma-Aldrich, AlemaniaS9888
Citrato de sodio sal trisódica deshidratada Prolabo, Francia27833.294
Aguja estérilBD Microlance 330 G 1/2 ; 0,3 mm× 13 mm
Pinzas para estudiantes Dumont #5Fine Science Tools91150-20
Tijeras quirúrgicas para estudiantesFine Science Tools91400-14
Superfros Plus Gold SlidesThermo Scientific, Estados UnidosFT4981GLPLUS
Microscopio quirúrgicoLeica, FranciaM320-F12
Casetes de inclusión de tejidosSimport, CanadáM490-10
Medio de inclusión de tejidosLeicaBiosystems, EE. UU.39602004
ToluenoSigma-Aldrich, Alemania244511
Tricaine MS-222Sigma-Aldrich, AlemaniaA5040
Triton X100Sigma-Aldrich, AlemaniaX100-500 mL
Vectashield medio Vector Laboratories, EE. UU.H-1000
XilenoSigma-Aldrich, Alemania534056
Cepa de pescadoAB
tampón >fosfato salino fuerte (10X PBS) pH 7.4 (para 1 litro)Para preparar 10X PBS, agregue las siguientes sales y complete hasta 1 litro con agua
destiladaCloruro de potasio (MM : 74,55 g/mol): 2,00 gSigma-Aldrich, Alemania746436
Fosfato de potasio monobásico (MM: 136,09 g/mol): 2,40 gSigma-Aldrich, Alemania795488
Cloruro de sodio (MM : 58,44 g/mol): 80,00 g  Sigma-Aldrich, AlemaniaS9888
Fosfato sódico dibásico (MM: 141,96 g): 14,40 gSigma-Aldrich, Alemania795410
. . Z033429 . <

Referencias

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