Para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular en los cardiomiocitos, presentamos protocolos utilizando dos líneas de ratones transgénicos: ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y ratones CAG-eGFP-aniillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular.
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Artículo de método
La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los cardiomiocitos son propensos a variaciones del ciclo celular, como la endorreduplicación (rondas continuas de síntesis de ADN sin cariocinesis y citocinesis) y la mitosis acitocinética (cariocinesis pero sin citocinesis). Estas variaciones atípicas del ciclo celular dan lugar a células poliploides y multinucleadas en lugar de a la división celular. Por lo tanto, para determinar el recambio y la regeneración cardíaca, es de vital importancia identificar correctamente los núcleos de los cardiomiocitos, el número de núcleos por célula y su estado del ciclo celular. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares para identificar la actividad del ciclo celular, como los análogos de timidina Ki-67, PCNA o pHH3. Aquí, presentamos métodos para reconocer cardiomiocitos y su nuclearidad y para determinar su actividad en el ciclo celular. Utilizamos dos sistemas transgénicos publicados: la línea de ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y la línea de ratones CAG-eGFP-anillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular. Combinados, estos dos sistemas facilitan el estudio de la regeneración cardíaca y la plasticidad.
Introducción
La correcta identificación de los núcleos de cardiomiocitos y el estado del ciclo celular es de crucial importancia para la determinación del volumen de negocios del músculo cardiaco y la regeneración. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares, tales como pHH3, Ki-67, o los análogos de timidina, para la identificación de la actividad del ciclo celular. Como la capacidad de proliferación de los cardiomiocitos de mamíferos adultos es muy pequeño 1, una falsa identificación de un núcleo positivo para un marcador de proliferación de un núcleo de cardiomiocitos podría hacer una diferencia crucial en el resultado de un ensayo ....
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Protocolo
Todos los procedimientos de este protocolo se utilicen animales estaban en conformidad con las normas éticas de la Universidad de Bonn y cumplen con las directrices de la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.
1. En Vitro Visualización de actividad del ciclo celular en cardiomiocitos postnatal
- la disociación de los cardiomiocitos postnatales
- preparaciones pre-experimentales
- Preparar los medios de cultivo (IMDM, 1% penicilina / estreptomicina, aminoácidos no esenciales al 1%, 0,1% β-mercaptoetanol); medio 1: añadir FCS al 2%;....
- preparaciones pre-experimentales
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Resultados
Con el fin de analizar los efectos de siRNAs / miRNAs en la actividad del ciclo celular de cardiomiocitos postnatales in vitro, los cardiomiocitos de ratones MYH6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doble transgénicos fueron aislados en el día postnatal 3 (P3) y se transfectaron con actividad inductora de ciclo celular miR199 5, p27 siRNA, y siRNA Fzr1. En comparación con el control negativo (Figura 1A), las imágenes de miR199- (Figura 1B).......
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Discusión
Existe una controversia sobre si los cardiomiocitos son capaces de volver a entrar en el ciclo celular y dividir después de la lesión y durante la homeostasis del tejido. Los valores para el volumen de negocio básico de cardiomiocitos se han dado en el rango entre 1% 1 y 80% 7. También después de una lesión cardíaca, la inducción de la actividad del ciclo celular y la generación de nuevos cardiomiocitos se ha informado en la zona fronteriza, con valores entre 0,0083%
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Agradecemos a S. Grünberg (Bonn, Alemania) y P. Freitag (Bonn, Alemania) por su asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de Petri de 10 cm | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µ filtro de células m | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-butanediona monoxima (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ cánula de inyección, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| aguja de calibre 20 | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| Placas de 24 pocillos | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-metil-butano | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| Solución de formaldehído al 37% | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| Llave de paso de 3 vías | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| Jeringa de 50 ml B | . Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% etanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Anticuerpo secundario conjugado con Alexa-fluor | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alfa-Aktinina EA-53, IgG de ratón | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos, | Microscopio | Greiner bio-one 675986 | |
| colagenasa B | Roche | 11088815001 | |
| Eclipse Ti-E | Criostato Nikon | ||
| CM 3050S | Suero | ||
| Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | ||
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| suero fetal para terneros | PromoCell, Heidelberg | ||
| Solución de formaldehído (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatina de piel porcina, Tipo A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| cubreobjetos de vidrio | VWR | 631-0146 | |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger tubo de extensión | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparina-Natrio | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Portaobjetos de microscopio HistoBond | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1 mg/mL) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Jeringa de insulina | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove' s Dulbecco' modificado s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Dü sseldorf | ||
| Lipofectamina RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| ratón IgG Cy5 (burro) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| tubo de microcentrífuga | Sarstedt | 72690 | |
| Mini agitador | VWR | 12620-940 | |
| mimímico de miARN mirVana, has-miR199a-3p | 4464066 | Ambion/Thermo Fischer Scientific | |
| Sakura Finetek/ VWR | 4565 | ||
| M-slide de 8 pocillos ibiTreat ibidi | 80826 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negativo control (ARN codificado) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Kit de disociación cardíaca neonatal | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Dü sseldorf | ||
| Aminoácidos no esenciales, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Medio sérico reducido | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Medio de montaje de alcohol polivinílico con DABCO®, antidecoloración | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNasa A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| recipientes de muestras | Vitlab | 80731 | |
| pipeta serológica | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sacarosa | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compuesto | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 yoduro (642/661) | Molecular sondas/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Aglutinina de germen de trigo (WGA) Fluoresceína marcada con Vector | Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| &alfa;-anticuerpo de actinina | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoetanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
Referencias
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....
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Reimpresiones y permisos
