Method Article

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

DOI:

10.3791/55204

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February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular en los cardiomiocitos, presentamos protocolos utilizando dos líneas de ratones transgénicos: ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y ratones CAG-eGFP-aniillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular.

Abstract

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Los cardiomiocitos son propensos a variaciones del ciclo celular, como la endorreduplicación (rondas continuas de síntesis de ADN sin cariocinesis y citocinesis) y la mitosis acitocinética (cariocinesis pero sin citocinesis). Estas variaciones atípicas del ciclo celular dan lugar a células poliploides y multinucleadas en lugar de a la división celular. Por lo tanto, para determinar el recambio y la regeneración cardíaca, es de vital importancia identificar correctamente los núcleos de los cardiomiocitos, el número de núcleos por célula y su estado del ciclo celular. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares para identificar la actividad del ciclo celular, como los análogos de timidina Ki-67, PCNA o pHH3. Aquí, presentamos métodos para reconocer cardiomiocitos y su nuclearidad y para determinar su actividad en el ciclo celular. Utilizamos dos sistemas transgénicos publicados: la línea de ratones transgénicos Myh6-H2B-mCh, para la identificación inequívoca de núcleos de cardiomiocitos, y la línea de ratones CAG-eGFP-anillina, para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular. Combinados, estos dos sistemas facilitan el estudio de la regeneración cardíaca y la plasticidad.

Introduction

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La correcta identificación de los núcleos de cardiomiocitos y el estado del ciclo celular es de crucial importancia para la determinación del volumen de negocios del músculo cardiaco y la regeneración. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares, tales como pHH3, Ki-67, o los análogos de timidina, para la identificación de la actividad del ciclo celular. Como la capacidad de proliferación de los cardiomiocitos de mamíferos adultos es muy pequeño 1, una falsa identificación de un núcleo positivo para un marcador de proliferación de un núcleo de cardiomiocitos podría hacer una diferencia crucial en el resultado de un ensayo ....

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Protocol

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Todos los procedimientos de este protocolo se utilicen animales estaban en conformidad con las normas éticas de la Universidad de Bonn y cumplen con las directrices de la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.

1. En Vitro Visualización de actividad del ciclo celular en cardiomiocitos postnatal

  1. la disociación de los cardiomiocitos postnatales
    1. preparaciones pre-experimentales
      1. Preparar los medios de cultivo (IMDM, 1% penicilina / estreptomicina, aminoácidos no esenciales al 1%, 0,1% β-mercaptoetanol); medio 1: añadir FCS al 2%;....

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Results

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Con el fin de analizar los efectos de siRNAs / miRNAs en la actividad del ciclo celular de cardiomiocitos postnatales in vitro, los cardiomiocitos de ratones MYH6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doble transgénicos fueron aislados en el día postnatal 3 (P3) y se transfectaron con actividad inductora de ciclo celular miR199 5, p27 siRNA, y siRNA Fzr1. En comparación con el control negativo (Figura 1A), las imágenes de miR199- (Figura 1B).......

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Discussion

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Existe una controversia sobre si los cardiomiocitos son capaces de volver a entrar en el ciclo celular y dividir después de la lesión y durante la homeostasis del tejido. Los valores para el volumen de negocio básico de cardiomiocitos se han dado en el rango entre 1% 1 y 80% 7. También después de una lesión cardíaca, la inducción de la actividad del ciclo celular y la generación de nuevos cardiomiocitos se ha informado en la zona fronteriza, con valores entre 0,0083%

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Disclosures

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgements

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Agradecemos a S. Grünberg (Bonn, Alemania) y P. Freitag (Bonn, Alemania) por su asistencia técnica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de Petri de 10 cmSarstedt821472
100 µ filtro de células mBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-butanediona monoxima (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ cánula de inyección, StericanBraun, Melsungen4657519
aguja de calibre 20Becton Dickinson GmbH301300
Placas de 24 pocillosBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-metil-butanoCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
Solución de formaldehído al 37%AppliChem GmbH A0936,1000
Llave de paso de 3 víasB. Braun Medical Inc.16494C
Jeringa de 50 ml B. Braun Medical Inc.8728810F
70% etanolOtto Fischar GmbH27669
Anticuerpo secundario conjugado con Alexa-fluorJackson ImmunoResearch115-605-205
Alfa-Aktinina EA-53, IgG de ratónSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Microplaca de cultivo celular, 96 pocillos, MicroscopioGreiner bio-one 675986
colagenasa BRoche11088815001
Eclipse Ti-ECriostato Nikon
CM 3050SSuero
Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Solución salina tamponada con fosfato de DulbeccoSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
suero fetal para ternerosPromoCell, Heidelberg
Solución de formaldehído (4%)PanReac AppliChemA3697
Gelatina de piel porcina, Tipo ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
cubreobjetos de vidrioVWR631-0146
GlucosaSigma-AldrichG7021
Heidelberger tubo de extensiónIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparina-NatrioRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
Portaobjetos de microscopio HistoBondMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Jeringa de insulinaBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s Dulbecco' modificado s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü sseldorf
Lipofectamina RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
ratón IgG Cy5 (burro)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
tubo de microcentrífugaSarstedt72690
Mini agitadorVWR12620-940
mimímico de miARN mirVana, has-miR199a-3p4464066Ambion/Thermo Fischer Scientific
Sakura Finetek/ VWR4565
M-slide de 8 pocillos ibiTreat ibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
negativo control (ARN codificado)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Kit de disociación cardíaca neonatalMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü sseldorf
Aminoácidos no esenciales, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Medio sérico reducidoGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Penicilina/EstreptomicinaGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Medio de montaje de alcohol polivinílico con DABCO®, antidecoloraciónSigma-Aldrich10981
RNasa AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
recipientes de muestrasVitlab80731
pipeta serológicaGreiner607180
software NIS ElementsNikon
SacarosaSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompuestoSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 yoduro (642/661)Molecular sondas/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TripsinaSigma-AldrichT1426
Aglutinina de germen de trigo (WGA) Fluoresceína marcada con VectorLaboratoriesVEC-FL-1021-5
&alfa;-anticuerpo de actininaSigma-AldrichA7811
β-MercaptoetanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
confocal de burro Leica Molde de biopsia de

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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