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Artículo de método

Desarrollo de un sistema de entrega de ADN económico por "Acufection" y su aplicación a la investigación de la piel

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DOI:

10.3791/55206

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19 de abril de 2017

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine

En este artículo

Resumen

Este protocolo es una alternativa rentable para expresar ADN plasmídico desnudo en la piel del ratón. El objetivo general del protocolo es para suministrar genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel para delinear el papel funcional de un gen específico en la inflamación cutánea.

Resumen

La desregulación de la respuesta inmune en la piel se asocia con numerosos trastornos de la piel humanos. La transferencia directa de genes relacionados con la inmunidad en el tejido de la piel es un enfoque fascinante para investigar la modulación inmune de la inflamación cutánea en modelos de ratón de enfermedades humanas. Aquí se presenta un protocolo rentable que entregó ADN desnudo en la piel del ratón y conduce a la expresión del transgen. El método se acuñó "acufection", que denota acu ADN punción mediada fection trans. Para realizar acufection, la piel del ratón se infundió primero con el ADN en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se pincha ligeramente con un manojo de agujas de acupuntura para facilitar la absorción de ADN y transfección en células. El ADN plásmido se presumiblemente tomado por el queratinocito y las células dendríticas (DC) en la piel y se expresó en una proteína. Pinchazo mecánico con la agujas per se no causa daños en la piel o inducir la activación de los queratinocitos. La expresionde los genes transfectados se detectó en la piel, tanto a nivel de transcripción y traducción siguientes acufection durante 2 días y se mantuvo hasta 7 días. El objetivo principal para el desarrollo de este método acufection fue investigar una isoforma antes delimitada IL-15. Usando este método, un corte y empalme alternativo de IL-15 isoforma con parcialmente suprimido el exón 7 (IL-15ΔE7) se expresó en la piel y, posteriormente, tratado con un receptor de tipo Toll 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), para inducir la inflamación. Acufection-entregado IL-15ΔE7 en la piel suprime la proliferación de queratinocitos, espesor de la epidermis y el reclutamiento de neutrófilos en la inflamación cutánea inducida por IMQ. Con el aumento de interés en la identificación de los mecanismos de regulación de la inflamación cutánea, el protocolo descrito aquí proporciona una alternativa eficaz y versátil costo para el sistema de pistola de genes o microsiembra para la entrega de ADN in vivo. Puede que potencialmente permitir el descubrimiento de la función de una novelagen en la piel o para la investigación de nuevos tratamientos para las enfermedades cutáneas.

Introducción

La piel es la primera línea de defensa del huésped. Los queratinocitos (KCS) son el principal tipo de células en la piel de los seres humanos y ratones. En respuesta a estímulos ambientales (por ejemplo la luz solar, oxígeno, productos químicos y la invasión patógena), KCS se activan y producen una amplia gama de citoquinas proinflamatorias y quimiocinas tales como IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α y GM-CSF 1. Juntos desencadenan el reclutamiento de células inmunes en la piel. Inflamación cutánea agravado a menudo se asocia con numerosas enfermedades humanas, incluyendo la dermatitis de contacto ectópico aguda y la inflamación mediada por células T crónico (por ejemplo, dermatitis de contacto alérgica y psoriasis) 2. Modulación de las respuestas proinflamatorias en la piel inhibiendo la activación KC es un enfoque plausibles para tratar la inflamación cutánea. Este protocolo describe un nuevo enfoque para expresar transitoriamente un gen de citoquina en la epidermis con el fin de estudiar res inmunesPonse como consecuencia de un tratamiento de este tipo en la piel.

La epidermis se compone la capa más superficial de la piel. Sirve como una barrera física de mantenimiento de sustancias externas tales como ácidos nucleicos y patógenos entren en las capas más profundas de la piel. Varias técnicas libres de agujas han sido establecidos para la transferencia de ADN epidérmico 3, 4. ADN en solución o asociado con liposomas catiónicos o los vectores de adenovirus se ha aplicado directamente a la epidermis modificados con técnicas tales como la eliminación de la capa córnea o el tratamiento con depilación reactivo. La eliminación del epitelio cornified facilita ADN de cruzar la barrera epidérmica y la interacción con los queratinocitos y células de Langerhans para inducir respuestas inmunes 5. Mientras que una gran área de superficie está disponible para la transferencia de ADN y este enfoque no implica agujas, hay desventajas, incluyendo el requisitopara las grandes cantidades de ADN (10 - 100 mg), el tratamiento dura en la piel mediante separación por arrastre, y los resultados inconsistentes en la inducción de respuesta inmune en los animales inmunizados sin refuerzo suministro de ADN 6. La administración intracelular de micropartículas mediada de ADN desnudo para la piel se ha demostrado ser altamente eficiente y reproducible para la inducción de respuesta inmune 7, 8. Una pistola de genes de mano se ha utilizado para bombardear el sitio diana de la piel con el plásmido partículas de oro recubiertas de ADN 2 micras de diámetro de tamaño por medio de flujo de aire de helio presurizado 9. El ADN plásmido se presumiblemente captado por las células dendríticas (DCs) KCsand en la piel y la proteína se expresa de forma local o siendo transportado a ganglios linfáticos de drenaje por DCs 10. Aunque el sistema de pistola de genes es simple y requiere experiencia técnica limitada, el costo para la preparación y la entrega de los "bul de ADNdejar "(es decir, polvos de oro, gas helio) y para la pistola de genes se ha limitado su aplicación general. Además, el requisito de un sistema de suministro de gas helio limita la facilidad de transporte pistola de genes cuando los experimentos se llevan a cabo en diferentes lugares. microsiembra se ha demostrado que se obtiene una mayor eficiencia de la transferencia de genes de una sola inyección y el bombardeo de partículas 11. microsiembra utiliza una pistola de tatuaje para administrar ADN a la piel sin el uso de perlas de partículas 11. oscilante las microagujas en la piel usando este enfoque es probable que raspar directamente la membrana celular y por lo tanto la transferencia de ADN a múltiples células al mismo tiempo. Sin embargo, el dolor asociado con el gran número de inyecciones con agujas de 0,254 mm de diámetro es una desventaja.

Aquí proporcionamos un enfoque alternativo para la entrega de ADN in vivo. El "acufection" protocolo describimos aquí proporciona una manera económica y eficiente para entregar ADN plasmídico en la piel del ratón. Brevemente, diez agujas de acupuntura (0,2 mm de diámetro x 13 mm de longitud) fueron atados en un manojo por cinta adhesiva. Un volumen de 10! L de PBS con 10 g de ADN plásmido que contiene el transgén de interés se colocó en el afeitado, depilación piel flanco crema-tratada. Mediante el uso del haz de aguja de acupuntura para oscilar la superficie (1 cm x 1 cm) de la piel, las queratinas en la capa córnea se aflojaron y el ADN plásmido aplicado a la superficie fue absorbida en la epidermis. daño de la piel se controló y se encontró que ser mínimo. La expresión del gen transfectado en la piel acufected fue confirmada por tanto cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR) y ELISA. Los efectos moduladores inmunes de acufection-entregado IL-15ΔE7 sobre la inflamación cutánea se demostraron usando el modelo de ratón IMQ tratados con 12. Mientras acufection demuestra ser una dema fácil y menosmétodo Nding para la entrega de ADN in vivo, la cantidad óptima de ADN de diferentes genes y los tiempos para pinchar la piel tiene que ser optimizado cuidadosamente para obtener resultados reproducibles.

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Protocolo

Los ratones hembra de 8 - 12 semanas de edad se utilizaron para este estudio. C57 / BL6 de tipo salvaje (WT) y la IL-15 deficientes (IL15 - / -) ratones fueron adquiridos de Laboratorio Nacional Centro de Animales (NLAC), Taiwán y Taconic Farm, respectivamente. IL-15-deficiente (IL15 - / -) y IL-15-dominante (IL15 e IL15 +/- + / +) mostró una proporción de 1: 3 en la segunda generación de la cruz de heterocigotos IL15 +/-. El genotipo de IL-15 - / - ratones se confirmó por análisis PCR. Los ratones se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos específicos (SPF) en el Laboratorio Animal Center (ALC), Universidad Nacional de Taiwán (NTU) Facultad de Medicina. Todos los procedimientos con animales, incluyendo los materiales y métodos anestésicos se realizaron de acuerdo con el protocolo de animales aprobado por el Taiwan National College de la Universidad de Medicina y la Facultad de Salud Pública Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) (Declaración jurada de la aprobación del Protocolo de animales 20130225).

1. Preparación de agujas de acupuntura

NOTA: Las agujas de acupuntura son dispositivos médicos compuestos de un mango y un extremo de la aguja (Figura 1A). Los diámetros de la aguja de acupuntura variaron de 0,2 mm (36 G) a 0,35 mm (28 G). Seleccionamos el mejor punto de la aguja para evitar posibles daños en las células excesiva durante pinchar la piel. Hay 4 longitudes diferentes de la aguja 0.2 mm incluyendo 13 mm (0,5 in), 25 mm (1,0 in), 40 mm (1,5 in) y 50 mm (2,0 pulgadas) de longitud. Un haz de 10 agujas con una longitud de 13 mm proporcionó el agarre mejor cómodo durante oscilar la aguja en C57BL / 6 de piel de ratón. Los parámetros pueden ser modificados si se aplica el método a la piel de los animales más grandes o lleva a cabo por investigadores con manos más grandes.

  1. Retire las agujas de acupuntura del envase estéril, no pirogénico. Colocar las agujas en un campo estéril.
  2. Use cinta etiquetado adhesivo para unir 10 agujas juntos ihaz na (Figura 1B).
    NOTA: Los 10 agujas están dispuestas geométricamente para formar una forma de cilindro. Por conveniencia, utilizar un trozo de película de parafina para estabilizar la disposición antes de aplicar la cinta adhesiva. Asegúrese de que todos los puntos de la aguja están en el mismo plano. El uso de un paquete en vez de una sola aguja facilita infusión máxima de ADN mediante el aumento del área de contacto entre las agujas y la piel.

2. Preparación de una cantidad grande y libre de endotoxina de ADN plásmido

  1. Transformar células bacterianas químicamente competentes con el ADN plásmido.
  2. Seleccionar y inocular una sola colonia bacteriana en 3 ml de LB antibióticos que contienen medio y se incuba a 37 ° C en un agitador durante la noche.
  3. Escala de la cultura diluyendo el cultivo bacteriano en 1: 100 en 250 ml de medio LB con antibióticos y agitación durante la noche a 37 ° C.
  4. Preparar una gran cantidad de ADN mediante el uso de un alto quality, kit de preparación de plásmido libre de endotoxinas siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: protocolo Acufection requiere alta pureza y una gran cantidad de ADN de plásmido. El uso de una alta calidad, se recomienda libre de endotoxinas y ADN de plásmido se purificó en columna.
  5. Eluir el ADN en agua estéril. ADN tienda en pequeñas alícuotas a -20 ° C hasta el momento de acufection.
    NOTA: Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación del ADN para asegurar la expresión de ADN plasmídico consistente.
  6. Diluir ADN plasmídico a 1 mg / ml en PBS estéril para acufection.

3. Procedimiento para Acufection

NOTA: La cantidad óptima de ADN y el área de la superficie de la piel diana puede variar para los diferentes genes y necesitan ser optimizado aún más. La fuerza de pinchado y el número de veces, para soltar la capa córnea de la piel también puede variar en función del espesor de la piel. Estas condiciones deben determinarse cuidadosamente después de evaluar el nivel de expresión de gene transcri acufectedpts mediante qRT-PCR.

  1. Pesar los ratones y administrar tribromoetanol (400 g por g de peso corporal) por inyección peritoneal.
    NOTA: 2,2,2-tribromoetanol es un agente anestésico inyectable que se utiliza comúnmente en ratones. Las soluciones se prepararon disolviendo una calidad no farmacéutica 2,2,2-tribromoetanol (2,5 g) en agua destilada (200 ml) que contenía 2,5% de 2-metil-2-butanol.
  2. Utilice veterinario pomada oftalmológica en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia.
    NOTA: efecto anestésico puede ser inducida en 1 - 2 min. Compruebe el pellizco reflejo del dedo del pie para asegurar la suficiente profundidad de la anestesia antes de la operación.
  3. Shave la piel flanco dorsal y aplicar crema depilatoria para disolver proteínas de la queratina en el cabello.
    NOTA: El uso de crema depilatoria para eliminar el vello facilitará infusión de ADN en la piel.
  4. El uso del agua empapada bolas de algodón para limpiar la crema depilatoria.
    NOTA: La crema depilatoria es soluble en agua. La eliminación completa de la crema de Will prevenir una superficie grasienta y asegurar un mejor resultado pinchazo.
  5. Use un hisopo de algodón estéril empapado en etanol al 70% para desinfectar la superficie de la piel.
  6. Delimitar la zona de objetivo (1 cm x 1 cm) en la piel depilada con una plantilla previamente medida. NOTA: Al marcar el sitio de destino le ayudará a aplicar el lote de aguja hacia arriba y hacia abajo dentro de un área definida. Esto es importante para asegurar la entrega de la misma cantidad de ADN a un área de superficie específica para minimizar la variación-experimento a experimento.
  7. Coloque una gota 10 l de ADN plásmido (10 mg) sobre la piel marcada.
    NOTA: La cantidad de ADN para acufection varía con los diferentes genes y el tipo de vector de expresión. La cantidad de ADN utilizado debe ser cuidadosamente valoró antes de realizar el experimento de interés. El 10 l es una pequeña gota de líquido y se sienta bien en la piel afeitada y depiladas sin rodar hacia abajo mientras pinchazo. Incluyen un grupo de control de ratones tratados con 10! L de ADN vector vacío para comparar con los ratones unacufected con el gen de estudio.
  8. Mantenga el haz aguja de acupuntura (Figura 1B) y pinchar la superficie marcada con un movimiento hacia arriba y hacia abajo para 100 veces o hasta que la humedad de ADN en PBS en desaparece la piel. NOTA: se puede producir un enrojecimiento de la superficie de la piel. Evitar hacer cortes profundos que sangran. El número de arriba y abajo pinchando movimientos en la superficie de la piel se determina de manera operativa cuando la humedad a partir de ADN en PBS (10 l) desaparece en la piel. Decidimos 100 veces en 30 s, ya que ha dado los resultados más consistentes de los genes acufection-entregado. Si procede, las agujas pueden ser reutilizados para hasta 6 pinchazos en la piel de destino (1 cm x 1 cm cada uno). Enjuagar las agujas en 70% de etanol y PBS entre acufection. Cambiar a nuevas agujas cuando están sordo o para diferentes ADN de plásmido para evitar la contaminación cruzada.
  9. Coloque ratones acufected sobre una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo hasta que despierta.
  10. Devolver los ratones a sus jaulas cuando tienenrecuperado el conocimiento suficiente. NOTA: Mantenga ratones acufected en jaula separada (menos de 5 animales por jaula) de la jaula de los ratones un-acufected.
  11. Ponga la botella de agua en su lugar y volver a la jaula de la vena cava inferior (jaulas ventiladas por separado) bastidor.

4. Cuidado post-operatorio

  1. Durante las primeras 48 h después del procedimiento, supervisar de cerca ratones para cualquier incomodidad incluyendo cambios de comportamiento (inquietud, agitación o trastorno de la alimentación) o apariencia anormal (pelo áspero o postura encorvada).

5. Imiquimod (IMQ) Tratamiento de la Piel acufected-IL-15ΔE7

NOTA: la expresión transcripcional y la producción de proteínas de gen acufected son detectables en el día 3. Los ratones acufected con el plásmido de interés se puede tratar con diferentes tipos de estimulantes 3 días después de la transfección. Se ilustra aquí mediante el tratamiento de la piel acufected-IL-15ΔE7 ratón con crema de IMQ. IMQ es una f imidazoquinolin amina aprobadoo el tratamiento de verrugas genitales externas y perinatales 13. Tratamiento IMQ tópica se muestra para inducir trastornos de la piel con psoriasis-como humanos en ratones con la manifestación de la piel escamosa, proliferación epidérmica y la infiltración 12, 14, 15 de neutrófilos dérmica.

NOTA: El vector de plásmido contenía ratón de longitud completa de IL-15 cDNA, bajo la regulación del factor-1 de alargamiento α (PEF), flanqueado con un péptido señal de IL-2 y una etiqueta FLAG en el extremo C-terminal (pEF-IL- 15, 5859 pares de bases), que fue construido como se describe por Bamford et al. 16. El plásmido se usa como una plantilla de IL-15 para eliminar los primeros 16 aminoácidos en los residuos 33 - 48 en el exón 7 del gen de IL-15 por IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5.811 pares de bases) por SOE (síntesis por extensión de solapamiento) método de PCR 17. Las colonias de bacterias que estaban con éxitotransformada con IL-15ΔE7 fueron verificadas mediante digestión con enzimas de restricción y seguida de la secuenciación de ADN 12, 18. Una gran cantidad de ADN de plásmido libre de endotoxinas se preparó como se describe en el paso 2 protocolo.

  1. Anestesie ratones acufected por inyección intraperitoneal de tribromoetanol (400 g por g de peso corporal) y aplicar veterinario pomada oftalmológica en los ojos para evitar la sequedad bajo anestesia. Compruebe el pellizco reflejo del dedo del pie para asegurar suficiente profundidad de la anestesia antes del comienzo de los procedimientos operativos. NOTA: Como una piel de 2 cm x 2 cm será tratada para IMQ, 2 dosis de ADN de plásmido pil-15ΔE7 (10 g en 10 l de PBS por dosis) se acufected en 2 sitios diana (1 cm x 1 cm cada uno).
  2. Marcos flanquean la piel (2 cm x 2 cm) que cubre el área acufected.
  3. Utilice aplicador Q-tip para aplicar tópicamente crema de IMQ en la superficie marcada. Nota: el paso 5.1 se realiza sólo para la primera dosis (60 mg / dosis).Las siguientes dosis consecutivas se aplican a los ratones no anestesiados.
  4. Documentar los cambios de piel dorsal tratada con IMQ al día con una videocámara de alta definición. Nota: Una persona sostiene el ratón mientras que otro está grabando. Las imágenes fijas se graban y editan en un momento posterior.
  5. La eutanasia a los ratones mediante la inyección de una sobredosis de tribromoetanol (800 g por g de peso corporal), seguido por dislocación cervical en el día 4 o el día 7 después del tratamiento IMQ. La piel se cortó y se procesa (pasos 4.1 a 4.5).

6. homogeneizado de ratón Piel

  1. Use un par de tijeras quirúrgicas para hacer un corte horizontal desde la base de la cola. Bilateralmente proceder a la base de la extremidad posterior y continuar a cortar verticalmente a lo largo del flanco a la base de la extremidad anterior.
  2. Con cuidado, pelar la piel del tejido subyacente de posterior a la anterior. Use las tijeras para cortar la piel dorsal. Coloque la piel en una placa de Petri estéril.
  3. Utilizar un bisturí para extirpar objetivopiel y congelarlo en nitrógeno líquido inmediatamente. Nota: El mismo tamaño de la piel acufected sin (1 cm x 1 cm) o con tratamiento IMQ (2 cm x 2 cm) se fija para cada ratón para minimizar las variaciones-experimento a experimento.
  4. Coloque el tejido de la piel congelada en el centro de un pre-refrigerada mortero 2-compartimiento con asas y una mano de mortero. Use un martillo de plomo en el mortero para pulverizar el tejido.
  5. colocar rápidamente el tejido pulverizado a un nuevo tubo que contiene 500 l de reactivo de lisis celular para la extracción de ARN o a un tubo que contiene 50 l de PBS y 1x cóctel inhibidor de proteasa para obtener el lisado de proteínas.

7. H & E y tinción inmunohistoquímica de la Sección de la piel

  1. Coloque el tejido de la piel en un casete y sumergirlo en paraformaldehído al 4% durante la noche.
  2. Insertar y sección de tejido, que en nuestro caso se llevó a cabo por el Laboratorio de Patología de la LAC, NTU. Nota: La sección se corta a un espesor de 5 micras. la sección de entre el tejido Placecomplementos en portaobjetos cargados positivamente.
  3. Calentar los portaobjetos a 65 ° C durante 15 min.
  4. Colocar los portaobjetos en una gradilla de tinción. Sumergir el estante en el tanque correspondiente que contiene sustituto xileno durante 5 min dos veces seguido de inmersión secuencial en 100%, 95%, 80%, 75%, 60% y 50% de etanol (5 min cada uno) para la rehidratación. Sumergir los portaobjetos en agua del grifo durante 3 min antes de la tinción.
  5. Realizar hematoxilina y eosina. Nota: H & E tinción se realizó a petición del Laboratorio de Patología de la LAC, NTU.
  6. Para tinción inmunohistoquímica, bloquear la sección con solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 5 min para reducir la tinción de fondo no específica. Nota: La solución de bloqueo se desarrolla comercialmente con las técnicas de inmunotinción. No suero animal está contenido en este producto.
  7. Sumergir el portaobjetos en PBS para enjuagar la solución de bloqueo.
  8. Se diluye la solución de bloqueo en PBS a 01:10 y añadir 2% de suero bovino fetal (FBS) (solución diluyente).
  9. Pipeta el anticuerpo primario diluido apropiadamente sobre la sección y se incuba durante 60 min a temperatura ambiente. Nota: Los anticuerpos se diluyen en solución diluyente. Las concentraciones de anticuerpos para esta tinción se han optimizado a 1: 800 y 1: 200 para Ki67 (clon SolA15) y Ly6G (clon 1A8), respectivamente. Estas concentraciones se encontraron para mostrar distinta mancha y sin tinción de fondo.
    1. Tinción de una sección en serie en la misma ejecución con la misma solución omitiendo el anticuerpo primario para controlar la unión no específica del anticuerpo secundario.
  10. Lavar los portaobjetos tres veces en TBS más 0,1% de Tween-20 (solución TBST) durante 5 min cada uno. Cambie la solución entre los mismos.
  11. Pipetear una gota de polímeros marcados para cada sección y se incuba a temperatura ambiente durante 40 min. Nota: El polímero marcado se prepara comercialmente mediante la combinación de polímeros de aminoácidos con peroxidasa y anticuerpo secundario que se reduce a un fragmento Fab'. El reactivo está listo para usar paratinción inmunohistoquímica de secciones de tejido de ratón.
  12. Lavar los portaobjetos tres veces en TBST durante 5 min cada uno. Cambie la solución entre los mismos.
  13. Pipeta 3,3'-diaminobenzindine tetraclorhidrato solución (DAB) en sección de tejido y se deja reposar a temperatura ambiente hasta un precipitado de color marrón es visible bajo un microscopio de campo brillante. Nota: El tiempo para DAB a precipitar en presencia de peroxidasa es de alrededor de 30 min.
  14. Sumergir los portaobjetos en agua para detener la actividad de peroxidasa. diapositivas de inmersión en solución de verde de metilo para la tinción nuclear. Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 min cada uno.
  15. Colocar un cubreobjetos sobre la sección teñida que se cubre con medio de montaje permanente (8 l por sección).

8. Fotografía y Análisis de Stained sección de tejido

  1. Visualizar las secciones de tejido teñidas con H & E y de IHC con un microscopio de campo claro. Capturar imágenes utilizando dispositivo de carga acoplada (CCD) adjunta al microscopio. Por qanálisis CUANTITATIVA, software de formación de imágenes se puede utilizar
    1. Análisis de todo los cortes teñidos usando un sondascopio con un objetivo 20X.
    2. Mida el espesor de la epidermis dentro de un segmento de 1 mm de la epidermis y contar el número de células Ki67 inmunorreactivas dentro del segmento.
      NOTA: Análisis cuantitativo se realizó mediante microscopía de automatización y software de análisis de imágenes. El grosor epidérmico se define por la distancia entre la capa basal y la capa más externa de la epidermis.
    3. Contar el número de células Ly6G inmunorreactivas en el área dérmica (230 x 270 m 2 rectángulo) inmediatamente debajo de la piel tópico IMQ-tratada.

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Resultados

Mientras que algunos enrojecimiento era evidente dentro de la primera hora después de pincharse con las agujas de acupuntura, la piel se aclaró en el día 2 y se observó ninguna reacción adversa de la piel hasta el día 7 después de pinchar (Figura 2A). Pinchazo de aguja indujo muy bajo nivel de ortoqueratosis epidérmica y dérmica mínima infiltración por H & E análisis en comparación con la piel no tratada (Figura 2B). El espe...

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Discusión

El paso más crítico para asegurar la expresión del ADN plásmido acufected es a oscilar y aflojar la capa córnea de la piel de manera uniforme. Mientras empuja las agujas suavemente sin cortar la piel, la fuerza debe ser lo suficientemente duro para deprimir la superficie. Para facilitar la absorción de ADN en 10 solución! L en un 1 cm x 1 cm área de la superficie, las agujas deben oscilar hacia arriba y hacia abajo por cerca de 100 veces en 30 s. Se puede determinar la fuerza que necesita para pinchar la piel y anotando...

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Divulgaciones

Los autores no tienen intereses económico alguno.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Agradecemos a los Dres. Betty Wu-Hsieh y Chien-Kuo Lee en NTU, Leigh Zerboni la Universidad de Stanford y el Dr. Peter Hoffmann en la Universidad de Hawai por leer el manuscrito, Yun Chien en la NTU para la asistencia técnica, y el Dr. Wen-Chi Wei en Agricultura Biotecnología Centro de Investigación de la Academia Sinica de asesoramiento técnico.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Accu Handy NeedleAccu36Gx0.5Dispositivo médico
NairTM LociónChurch & DwightN/AUso para eliminar el vello
Shandon Sustituto de XylineThermo Fisher Scientific6764506 Desparafinación
Avertin (2,2,2-Tribrometanol)Sigma-AldrichT4,840-2Anestesia
2-metil-2-butanolSigma-Aldrich152463Disolvente para la disolución de avertina
Caldo DifcoTM LB, MillerBD244620Propagación y mantenimiento de E. coli para biología molecular
Ratón IL-15/IL-15R Complejo ELISA Ready-SET-Go kiteBioscience88-7215Medir la proteína IL-15
Anti-ratón Ly6GBioLegend127601Anticuerpo utilizado para la tinción inmunohistoquímica
anti-ratón Ki-67eBioscience14-5698-80Anticuerpo utilizado para tinción inmunohistoquímica
tinción simple ratón MAXPO (rata)Nichirei Biosciences414341FReactivo para bloquear la señal de fondo en la tinción de ratón sobre ratón
Kit de sustrato de peroxidasa DAB (HRP)Vector LaboratoriesSK-4100 Sustrato deperóxido para tinción inmunohistoquímica
Bloque Ultra VThermo Fisher ScientificTA-060-UBReducir la tinción de fondo inespecífica
Verde de metiloSigma-AldrichM8884Tinción nuclear
Vecta MountTMVector LaboratoriesM-5000Conservación permanente de las tinciones histoquímicas Comprimidos
cóctel inhibidor de la proteasaRoche04-693-116-001Inhibe la actividad de la proteasa en el lisado celular
Crema de Aldara3M ParmaceuticalsN/A5% crema de imiquimod
Pulverizador de tejidos BessmanSpectrum Labs189475Uso para pulverizar tejido de la piel
ABI7900HT cicladorThermo Fisher ScientificN/Acuantitativo de PCR en tiempo real
VideocámaraPanasonicHDC-SD60Documentación de imágenes
Axio Scope.A1ZEISSN/AMicroscopía de campo claro
de ensayo

Referencias

  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
  3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
  4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
  5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
  6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
  7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
  8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
  9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
  10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
  11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
  12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
  13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
  14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
  15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
  16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
  17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
  19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
  20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
  21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).

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