Aquí, describimos una técnica para la administración localizada de reactivos a la glándula mamaria del conejo a través de una inyección intraductal. Además, describimos un protocolo para la visualización y la confirmación de la administración mediante ecografía de alta resolución de agentes de contraste.
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Artículo de método
Intraductal La entrega al conejo Glándula Mamaria
En este artículo
Resumen
Resumen
Tratamientos intraductales localizado para el cáncer de mama ofrecen ventajas potenciales, incluyendo la entrega eficiente con el tumor y la reducción de la toxicidad sistémica y los efectos adversos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Sin embargo, persisten algunos desafíos antes de que estos tratamientos pueden ser aplicados más ampliamente. El desarrollo y la validación de la terapéutica intraductales en un modelo animal apropiado facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas para los pacientes intraductales. Mientras que la glándula mamaria de ratón ha sido ampliamente utilizado como un sistema modelo de desarrollo mamario y la tumorigénesis, la anatomía es distinta de la glándula humano. Un modelo animal más grande, como el conejo, puede servir como un modelo mejor para la estructura de la glándula mamaria y desarrollo terapéutico intraductal. Cªontraste a ratones, en la que diez árboles ductales están distribuidas espacialmente a lo largo del eje del cuerpo, cada uno que termina en una tetina separada, la glándula mamaria de conejo se asemeja más a la glándula humana, con múltiples sistemas ductales se solapan y que salen a través de aberturas separadas en un pezón. A continuación, presentamos los métodos mínimamente invasivos para el suministro de reactivos directamente en el conducto mamario de conejo y para la visualización de la entrega de sí mismo con imágenes de ultrasonido de alta resolución.
Introducción
La entrega intraductal de agentes terapéuticos se ha estudiado en modelos de roedores y en los ensayos en humanos en fase inicial 3, 4, 5, 6, 11, 12. Un reciente estudio de Fase demostró la seguridad y la viabilidad de carboplatino intraductal o intraductal doxorrubicina liposomal pegilada en las mujeres que esperan la mastectomía para el tratamiento de cáncer invasivo 2.
Protocolos anteriores para la entrega intraductal se han desarrollado para ratón y de rata glándulas mamarias 6, 7, 8, 9. Para fines de investigación, inyecciones de células tumorales intraductales y la entrega de vector lentiviral de oncogenes también se han realizado en modelos de roedoresref "> 13, 14, 15, 16. Sin embargo, un ideal modelo in vivo del proceso de entrega intraductal debe permitir el desarrollo de nuevas clases de compuestos terapéuticos y facilitar la evaluación preclínica. Las diferencias anatómicas entre roedores y humanos han complicado la traducción de estos estudios.
A diferencia de los ratones, en el que cada conducto termina en un pezón separado, el de mama humano se compone de 5 a 9 sistemas ductales independientes, cada uno con una abertura separada terminando en el pezón. Conejo glándulas mamarias albergan cuatro sistemas ductales independientes, cada uno por separado accesible a través de uno de los cuatro orificios en una sola pezón. Un modelo de conejo es más compatible con la anatomía humana y permite el estudio de la administración de fármacos intraductal en un contexto más relevante.
En este caso, se utilizan dos técnicas para evaluar la entrega intraductal. La co-administración de unacolorante vital permite la visualización a través de la piel y proporciona una confirmación simple y rápida del método. Para algunas aplicaciones, puede ser preferible mayor mapeo resolución de los conductos. Presentamos aquí un protocolo para la formación de imágenes por ultrasonido de los conductos a través de la entrega intraductal de un reactivo no específica contraste.
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Protocolo
Procedimientos que utilizan los sujetos animales han sido aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Texas en Austin.
1. Preparación preoperatoria
- Anotar el peso corporal de cada conejo. Al igual que con todos los estudios preclínicos, monitorear pesos de los animales regularmente para evaluar la toxicidad potencial.
- Antes de anestesiar el conejo, llenar un tubo cónico de 50 ml con gel de ultrasonido disponibles comercialmente y centrifugado a 500 xg durante 30 s; no debe haber burbujas visibles en el gel sobre la terminación de la centrifugación.
- Administrar por vía subcutánea glicopirrolato en una dosis de 0,1 mg / kg y acepromacina por vía intramuscular a una dosis de 0,75 mg / kg. Espere 15-20 minutos para que el sedante para tener efecto durante el seguimiento de los signos vitales y el comportamiento.
NOTA: El glicopirrolato es un agente anticolinérgico que previene la bradicardia y reduce respiratorias y gastrointestinales secreciones. Acepromazina es un sedante que sirve como un premedicatipor la anestesia. - Administrar 35 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por vía subcutánea como anestésico. Sin embargo, como el operador vuelve más experimentado y puede lograr la entrega intraductal más rápidamente, disminuir las dosis de los fármacos a 15 mg / kg de ketamina y 3 mg / kg de xilazina por vía subcutánea; esto acortará el tiempo de anestesia y el tiempo requerido para que el animal recuperarse de la anestesia.
- Comprobar y documentar la frecuencia cardíaca, la SPO 2, temperatura, frecuencia respiratoria, y el color membrana mucosa cada 15 minutos. Aplicar lubricante ocular en ambos ojos.
NOTA: Sólo el personal que han recibido una formación adecuada y han sido aprobados por el IACUC de su institución debe administrar o supervisar la anestesia. El uso de un monitor de anestesia veterinaria puede ayudar en la adquisición de los signos vitales y se recomienda. El monitor de anestesia veterinaria, sin embargo, no reemplaza la necesidad de comprobar manualmente el animal cada 15 minutos. Ver las instrucciones del fabricante fo el uso adecuado de un monitor de veterinaria. - Verificar el inicio de la anestesia por una pizca dedo del pie suave; el conejo debe ser no responden antes de continuar.
- afeitarse con cuidado el abdomen caudal del conejo en el área alrededor de la tercera y cuarta pares de pezones inguinales.
- Con la mayor parte del pelo eliminado, aplicar una crema de depilación over-the-counter de la zona afeitada. Retire la crema 10 minutos después de la aplicación usando toallas de papel húmedas mojadas con agua tibia.
NOTA: piel de conejo es muy frágil / sensibles. La crema de depilación debe ser utilizado por no más de 10 min. De hecho, es más seguro para probar un "punto de prueba" a los 5 minutos y sólo dejar actuar durante más tiempo si punto de prueba indica un tiempo más largo se necesita tiempo. - Limpie el área con gasas empapadas en alcohol para limpiar el sitio de la inyección.
- Colocar el conejo en su dorso en una cubeta en forma de V forrada con una manta de agua caliente de recirculación y una almohadilla absorbente.
2. Preparation del agente de contraste
- Reconstituir el reactivo no específica contraste de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pipetear arriba y abajo suavemente para mezclar.
NOTA: El agente de contraste utilizado en este protocolo es estable a temperatura ambiente durante 4 - 6 h después de la reconstitución. Agite suavemente el vial entre cada recuperación.
NOTA: El volumen de solución requerido dependerá del número de conductos a inyectar. El conejo tiene 4 aberturas de los conductos por los pezones, y 0,2 ml de solución es suficiente para llenar un árbol ductal de un adulto New Zealand White Rabbit (Oryctolaguscuniculus). Por lo tanto, un volumen total de 0,8 ml puede ser entregado a una glándula mamaria.
3. Entrega intraductal
- Localizar los pezones apropiados para ser inyectados; Se recomiendan los pares 3 ° y 4 ° de tetinas inguinales, ya que se visualizan fácilmente cuando el animal se coloca en su dorso.
- Cargar 0,2 ml de solución salina estéril al 0,9% enuna jeringa de tuberculina de 1 ml Luer-lock con una aguja 22 G. Deseche la aguja de 22 G una vez que la solución salina es en la jeringa y reemplazarlo con una aguja de calibre 25 estéril. limpiar suavemente el área con un 85% de alcohol isopropílico en una almohadilla de gasa.
- Con el bisel de la aguja y la jeringa paralela al cuerpo del animal, insertar el bisel de la aguja en el lado de la tetina y lentamente inyectar 0,1-,2 ml de solución salina; esto permitirá una mejor visualización de las aberturas de los conductos.
- Cargar 0,2 ml de solución inyectable en una jeringa de tuberculina de 1 ml de cierre Luer.
- Mantenga el pezón suavemente con los dedos pulgar e índice y levantarlo ligeramente para posicionarlo para la inyección intraductal; una lupa ocular portátil puede ayudar en la visualización de las aberturas de los conductos.
- Mientras se mantiene la posición elevada de la tetina, cannulate cuidadosamente el conducto de interés utilizando una aguja de punta roma 25 G.
- Después de la punción, gire suavemente la jeringa Luer-lock en el centro del elemento romo-taguja de infusión ip hasta que quede bloqueado en su lugar.
- Levantar el pezón e inyectar la solución lentamente para minimizar el daño potencial causado por movimiento rápido del fluido dentro del conducto; En ningún momento debe haber resistencia al inyectar la solución.
4. imágenes por ultrasonido
- Aplicar una cantidad generosa de gel de ultrasonido se centrifugaron para la piel de la zona de interés. Asegúrese de que no haya burbujas en el gel, ya que pondrá en peligro la calidad de la imagen.
- Ajuste la profundidad de imagen de 6 mm. Coloque el transductor 21 MHz en contacto con el gel y escanear el área de interés en B-mode. Observe el medio de contraste en la región explorada incluyendo la apertura ductal y en todo el conducto.
NOTA: Estos ajustes se han desarrollado para su uso con una máquina de ultrasonido fotoacústica específica. Consulte la Tabla de Materiales para obtener más detalles. Puede ser necesario ajustar la potencia de transmisión y la profundidad de formación de imágenes de otros sistemas de imagen para optimizar mamariala visualización de la glándula. - Retire el gel de ultrasonido de la piel del animal con una almohadilla de gasa.
5. Cuidado posoperatorio
- Observe el lugar de la inyección: no debe haber signos de traumatismo en la región del pezón o en el tejido circundante, e hinchazón en el área que rodea el pezón probablemente indica una inyección almohadilla de grasa mamaria en lugar de una inyección intraductal éxito.
- Colocar el conejo en una posición esternal. Si es necesario, dar 0,2 mg / kg de yohimbina vía intravenosa en la vena marginal de la oreja; esto va a invertir el efecto de la xilazina y permitir que el animal se recupere más rápidamente de la anestesia.
- Monitorear el conejo cada 15 minutos durante todo el período de recuperación hasta que el animal está alerta, sensible, y mantiene una posición esternal.
NOTA: Este procedimiento no debería ocasionar daño tisular o inflamación. Si enrojecimiento o inflamación se observan, administrar una dosis de meloxicam 0,1-0,2 mg / kg PO una vez que el animal está alerta y capaztomar la medicación por vía oral. Póngase en contacto con el personal veterinario de la institución para obtener más instrucciones.
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Resultados
Aquí, se muestra que la entrega intraductal de reactivos de contraste a los conductos mamarios de un conejo puede lograrse sin trauma al tejido (Figura 2). En conejos, cuatro sistemas ductales separadas convergen en un pezón y de este modo se puede acceder de forma individual y la imagen utilizando este método. aberturas ductales individuales se visualizaron fácilmente; en cuenta el marcado de una segunda abertura ductal adyacente al conducto canulado en la Figur...
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Discusión
Este método de suministro intraductal a la glándula mamaria de conejo se puede usar para los reactivos de contraste de ultrasonido y muchas otras soluciones acuosas, incluyendo colorantes vitales y la terapéutica. Estudios previos han demostrado la entrega intraductal de hormonas 17, 18, 19. En modelos de roedores, la entrega intraductal de los ácidos nucleicos 8, quimioterapéuticos
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo de una Beca de Investigación Traslacional del Cáncer de Mama (14-60-26-BROC a AB) de la Fundación para la Investigación del Cáncer de Mama y la Asociación Americana para la Investigación del Cáncer.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo de contraste no dirigido MicroMarker | VisualSonics | VS-11694 | |
| Luer Lock 1 mL Jeringas | BD | 309628 | |
| Glycopyrrolate 0,2 mg/mL | Wedgewood Compounding Pharmacy | GLYCOP-INJ013VC | 6 meses de vida útil, el suministro puede ser limitado. |
| Sulfato de atropina 0,5 mg/mL | Animal Health International | 15320764 | Si no se dispone de glicopirrolato. No debe combinarse con glicopirrolato. |
| Ketamina HCL 100 mg/mL | Animal Health International | 21250699 | http://www.animalhealthinternational.com/ |
| Acepromazine 10 mg/mL | Animal Health International | 17640541 | |
| Xilacina 20 mg/mL | Animal Health International | 20101547 | |
| Yohimbina 0,2 mg/mL | Animal Health International | 14588965 | |
| Crema Depiladora Veet | Solución para pieles sensibles. Disponible a través de minoristas locales. | ||
| Agujas de infusión de punta roma | Sai Infusion Technology | B14-50 | http://www.sai-infusion.com/collections/blunt-needles |
| Oxímetro de pulso veterinario | EdanUSA | VE-H100B | http://www.edanusa.com/Product/ VE-H100B-Veterinary-Pulse-Oximeter.html |
| Bomba de agua caliente | Gaymar | TP700 | |
| Manta de agua caliente | Animal Health International | 21232696 | Maxi-Therm Lite Almohadillas térmicas Sistema de |
| ultrasonido | VisualSonics | Vevo 2100 |
Referencias
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