Preparación y observación de muestras biológicas mediante el escaneo de grueso Electrónica de Transmisión de Positrones

Resumen

Este informe describe un protocolo de preparación de muestras y condiciones de imagen específicas para realizar tomografía electrónica de transmisión de barrido de muestras biológicas gruesas.

Resumen

Este informe describe un protocolo para preparar especímenes biológicos gruesos para su posterior observación utilizando un microscopio electrónico de transmisión de barrido. También describe un método de imagen para estudiar la estructura 3D de especímenes biológicos gruesos mediante tomografía electrónica de transmisión de barrido. El protocolo de preparación de muestras se basa en métodos convencionales en los que la muestra se fija mediante agentes químicos, se trata con un agente de contraste de sal de átomos pesados, se deshidrata en una serie de baños de etanol y se incrusta en resina. A continuación, se describen las condiciones de imagen específicas para la observación de muestras gruesas mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido. Las secciones de la muestra se observan utilizando un método de enfoque continuo que implica la recopilación de varias imágenes en varios planos focales. Esto permite la recuperación de información enfocada a varias alturas a lo largo de la muestra. Este patrón de recolección particular se realiza en cada ángulo de inclinación durante la recopilación de datos de tomografía. A continuación, se genera una sola imagen, fusionando la información enfocada de todos los diferentes planos focales. A continuación, se genera un conjunto de datos clásico de la serie de inclinación. La ventaja del método es que la alineación y reconstrucción de la serie de inclinación se puede realizar con herramientas estándar. La colección de imágenes focales permite la reconstrucción de un volumen 3D que contiene todos los detalles estructurales de la muestra enfocada.

Introducción

Desde principios de la década de 1970, la tomografía se acerca en la microscopía electrónica de transmisión (TEM) han sido ampliamente utilizados para la caracterización estructural de las muestras biológicas ^{1, 2, 3.} El atractivo de la tomografía electrónica de transmisión era que podría ser utilizado para estudiar una amplia gama de estructuras biológicas a escala nanométrica, de la arquitectura de las células y la ultraestructura de los orgánulos a la estructura de los complejos macromoleculares y proteínas. Sin embargo, la tomografía electrónica de transmisión no se podr....

Protocolo

Precaución: Consulte las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) de los diversos reactivos antes de usarlos. Varios de los productos químicos utilizados durante la preparación de la muestra son tóxicos, carcinogénicos, mutagénicos y / o tóxicos para la reproducción. Usar el equipo de protección personal (guantes, bata de laboratorio, pantalones largos y zapatos cerrados) y el trabajo bajo una campana de humos durante la manipulación de la muestra. Seccionar la muestra con un ultramicrotomo implica el uso de instrumentos afilados, y el uso cuidadoso de estas herramientas es obligatorio. En los pasos descritos a continuación, los autores suponen que la muestra ....

Resultados

En nuestro estudio, los electrones se aceleran a 200 kV en el microscopio electrónico de transmisión cañón de emisión de campo. Las imágenes se recogieron en modo STEM BF utilizando un tiempo de permanencia de 20 mu s. En cuanto al diseño de la serie de inclinación a través de-focal, encontramos que los intervalos de enfoque de 150 nm dieron resultados satisfactorios para el estudio ultraestructural de una muestra, incluso biológica 750 nm de espesor, aunque la profundidad de campo de ha.......

Discusión

En este artículo, se presenta un protocolo de preparación de muestras convencional junto con una guía paso a paso para realizar el análisis 3D en muestras biológicas de espesor utilizando la tomografía por STEM-focal. Resina incrustación de muestras biológicas se ha utilizado durante décadas ²⁶ y protocolos alternativos que se adaptan a diferentes tipos de muestras se pueden encontrar en la literatura ^27. Por el contrario, las muestras gruesas de imagen en STEM está utiliz.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	P4417
Etanol	Sigma-Aldrich	2860
Resina epoxi	EMS	14120
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	Agregue polvo de paraformaldehído al PBS calentado a aproximadamente 60 °C. Aumente el pH agregando 1 N NaOH hasta que no se vea polvo de PFA.
Glutaraldehído	Sigma-Aldrich	G5882
Tetróxido de osmio	EMS	19150
Acetato de uranilo	Sigma-Aldrich	73943
Cápsula de gelatina	EMS	70110
Cuchillos de recorte e histo	Distribución LFG Cuchillos		de diamante de diatomeo
Microscopía electrónica Rejilla de cobre	LFG Distribution	G200-Cu
Bolígrafo de recubrimiento de rejilla	LFG Distribution	70624
Portamuestras	JEOL	EM-21311 HTR
Microscopio electrónico	JEOL	JEM-2200FS