3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Resumen

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

Resumen

Ingeniería de cartílago sigue siendo un desafío debido a las dificultades en la creación de un implante funcional in vitro similar al tejido nativo. Un enfoque poco explorado para el desarrollo de reemplazos autólogas implica la diferenciación de células madre en condrocitos. Para iniciar este condrogénesis, un grado de compactación de las células madre se requiere; por lo tanto, hemos demostrado la viabilidad de las células magnéticamente de condensación, tanto dentro de los andamios de espesor y libre de andamio, utilizando fuentes de campo magnético miniaturizados como atractores de células. Este enfoque magnético también se utiliza para guiar fusión agregada y para construir libre de andamio, organizado, en tres dimensiones (3D) tejidos de varios milímetros de tamaño. Además de tener un tamaño mejorada, el tejido formado por la fusión magnético impulsado presentó un aumento significativo en la expresión de colágeno II, y se observó una tendencia similar para la expresión de agrecano. A medida que el cartílago nativo fue sometido a fuerzas tsombrero influenciado su estructura en 3D, también se llevó a cabo la maduración dinámica. Un biorreactor que proporciona estímulos mecánicos se utilizó para la cultura de los andamios magnéticamente sembradas durante un período de 21 días. maduración Bioreactor mejoró en gran medida la condrogénesis en los armazones cellularized; la matriz extracelular obtenido bajo estas condiciones era rico en colágeno II y agrecano. Este trabajo describe el potencial innovador de condensación magnética de las células madre etiquetados y maduración dinámica en un biorreactor para mejorar la diferenciación condrogénica, tanto andamios de polisacárido libre de andamio y dentro.

Introducción

Las nanopartículas magnéticas se utilizan ya en la clínica como agentes de contraste para formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y sus aplicaciones terapéuticas mantienen en expansión. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado que las células marcadas pueden ser manipuladas in vivo utilizando un campo magnético externo y pueden ser dirigidas y / o mantenidas en un sitio definido de implantación ^{1, 2, 3.} En la medicina regenerativa, que pueden ser utilizados para diseñar tejidos organizados in vitro ^4, incluyendo el t....

Protocolo

1. Construcción de los dispositivos magnéticos

NOTA: Los dispositivos utilizados para la siembra de células varían dependiendo de la aplicación (Figura 1). Para formar agregados, el número de células está limitado a 2,5 × 10 ⁵ / agregado, por lo que las puntas magnéticas deben ser muy delgada (750 micras de diámetro). Para sembrar los andamios de 1,8 cm ^2/7 mm de espesor, los imanes deben ser más grande (3 mm de diámetro) y se asegurará de la migración de células a través de los poros de la andamio.

1. Construcción de un dispositivo con micro-imanes para la formación de agregados (Fig....

Resultados

En primer lugar, los agregados se pueden formar individualmente utilizando micro-imanes depositando 2,5 × 10 ⁵ células madre marcadas (Figura 2A). Estos agregados individuales (~ 0,8 mm de tamaño) pueden entonces ser fusionados en estructuras más grandes gracias a la fusión secuencial, inducida magnéticamente. Por ejemplo, en el día 8 de la maduración condrogénica, los agregados se colocaron en contacto en pares para formar dobletes; cuadrúpedos se ensamblaron.......

Discusión

En primer lugar, porque las técnicas que aquí se presentan se basan en la internalización de nanopartículas magnéticas, una cuestión importante es el resultado de las nanopartículas una vez que se localizan dentro de las células. Es cierto que las nanopartículas de hierro pueden desencadenar toxicidad potencial o alteración de la capacidad de diferenciación en función de su tamaño, de revestimiento, y tiempo de exposición ^{19, 22.} Sin embargo, varios estudios han.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nanopartículas de óxido de hierro (maghemita) (γ-Fe2O3)	PHENIX - Universidad de París 6	Hecho y dado por C. Mé nager	Diámetro medio de 8,1 nm y carga superficial negativa
Andamios de polisacárido Pululano/Dextrano	LIOAD - Universidad de Nantes	Fabricado y dado por C. Le Visage	Preparado a partir de una mezcla 75:25 de pululano/dextrano en condiciones alcalinas (10  M NaOH). Porosidad: 185-205  y micro; m; Grosor: 7  milímetro; Superficie: 1,8   cm2.
Sistema de regeneración TisXell	QuinXell Technologies	QX900-002	Biorreactor biaxial con cámara de cultivo de 500 mL
Jaula para andamios: Histosette II M492	VWR	720-0909
Célula madre mesenquimal (MSC)	Lonza	PT-2501	han utilizado tres lotes independientes
MSCGM BulletKit medio	Lonza	PT-3001	Para el medio completo, agregue el BulletKit provisto (que contiene suero, glutamina y antibióticos) al medio MSCGM
DMEM con Glutamax I	Life Technologies	31966-021	Sin piruvato de sodio, sin HEPES
RPMI medio 1640, sin glutamina	Life Technologies	31870-025	Sin piruvato de sodio, sin HEPES
PBS sin CaCl2 sin MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Tripsina-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicilina (10,000  U/mL) / Estreptomicina (10,000  y micro; g/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premezcla Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Solución de piruvato de sodio 100 mM	Sigma	S8636
Ácido L-ascórbico 2-fosfato	Sigma	A8960	Preparar la solución concentrada (25 mM) en agua destilada extemporáneamente
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare la solución madre de 175 mM diluida en agua destilada y almacene a 4   ° C
Dexametasona	Sigma	D4902	Prepare la solución madre de 1 mM diluida en etanol al 100% y almacene a -20   ° C
TGF-beta 3 proteína 10  y micro; g	Interchim	30R-AT028
Citrato trisódico	VWR	33615.268	Prepare el 1  M solución madre diluida en agua destilada y almacenar a 4   ° C
Pululanasa de Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranasa de Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin Kit de extracción de ARN	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Transcriptasa inversa	Technologies	18064-014
Aleatorio Imprimación - Hexamer	Promega	C1181	500 y micro; g/mL: Usar diluido 1/2 y poner 1 µ L por muestra
ARN recombinantes en inhibidor de la ribonucleasa	Promega	N2511	40 U/µ L: poner 1 µ L por muestra
de mezcla de nucleótidos de PCR dNTP (10  mM cada uno)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Paso Uno Plus Sistema de PCR en tiempo real	Life Technologies	4381792
Solución de formalina 10% neutro tamponado	Sigma	HT5012
OCT solución VWR		361603E
Isopentano	Sigma	M32631
Azul de toluidina O	VWR	1.15930.0025
Absoluto de etanol	VWR	20821.310
Tolueno	VWR	1.08323.1000
Medio de montaje Pertex	Histolab	840
RPLP0 Imprimación para qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Imprimación
agrecan para qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen
II Primer para qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'

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