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Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

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DOI:

10.3791/55226

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22 de enero de 2017

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1Department of Biomedicine, Aarhus University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la extrusión hidráulica de la médula espinal, así como la identificación y el aislamiento de ganglios específicos de la raíz dorsal (DRG) en el mismo roedor. En comparación con los métodos estándar de aislamiento de la médula espinal, este método es significativamente más rápido y reduce el riesgo de daño tisular.

Resumen

Tradicionalmente, la médula espinal se aísla mediante laminectomía, es decir, rompiendo las vértebras espinales de una en una. Esto lleva mucho tiempo y puede provocar daños en la médula espinal causados por el proceso de disección. Aquí, mostramos cómo se puede extruir la médula espinal utilizando presión hidráulica. El tiempo de manipulación se reduce significativamente a solo unos minutos, lo que probablemente disminuya el daño a las proteínas. El bajo riesgo de daño al tejido de la médula espinal mejora el análisis inmunohistoquímico posterior. Al realizar la extrusión hidráulica de la médula espinal en lugar de la laminectomía tradicional, los roedores se pueden utilizar aún más para el aislamiento de DRG, lo que reduce el número de animales y permite el análisis a través de tejidos del mismo roedor. Demostramos un método consistente para identificar y aislar los GRD de acuerdo con su localización en relación con las costas. Sin embargo, es importante ajustar este método al animal particular utilizado, ya que el número de segmentos de la médula espinal, tanto torácicos como lumbares, puede variar según el tipo de animal y la cepa. Además, ilustramos ejemplos de procesamiento adicionales de los tejidos aislados.

Introducción

El objetivo general de este método consiste en aislar la médula espinal, así como para identificar y aislar los GRD 1, 2. Extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, es decir, romper la columna vertebral de una en una, y este método reduce el riesgo de daño tisular causado por el proceso de disección de 3, 4 . GRD puede ser difícil de identificar. La identificación correcta es muy importante para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente.

Tejido aislado por las técnicas demostradas aquí se puede aplicar a una amplia gama de análisis, incluyendo transferencia de Western 5,6, 7 y qPCR tinción inmunohistoquímica 8.

Cuando la identificación de los GRD, es importante tener en cuenta que el número de segmentos de la médula espinal se sabe que varían con el tipo de animal y tensión 9, 10, 11. Las ventajas en la realización de este método en los ratones son el elevado número de variantes modificadas genéticamente disponibles y los gastos relativamente bajos de vivienda. Las ventajas de usar las ratas son el rendimiento tejido relativamente alta y si la participación de las lesiones nerviosas, el procedimiento se aliviaron con el tamaño.

Protocolo

Todos los animales fueron manejados en plena conformidad con los reglamentos daneses y europeos. Número de Permiso: 2012-15-2934.

1. Preparación de la jeringuilla por extrusión hidráulica de la Médula Espinal

  1. Para una rata adulta, utilice una jeringa de 10 ml. Para un ratón adulto, utilizar una jeringa de 5 ml. Para los cachorros, utilice una jeringa de 2,5 ml.
  2. Ajuste una punta de pipeta no universalmente filtro adecuado para 2-200 pipetas mu L por el recorte de la gran final de la punta de la pipeta hasta que se ajuste firmemente a la jeringa. Coloque la punta de la pipeta ajustada en la jeringa. Para los cachorros, utilizar una aguja de 23 G o similar en lugar de una punta de pipeta ajustada.
  3. Aspirar PBS estéril y dejar la jeringa en hielo hasta su uso posterior en frío de hielo.

2. La eutanasia

  1. No realice dislocación cervical, ya que esto perturbe la columna vertebral representación de extrusión imposible.
  2. Para el adulto de rata / ratón, la eutanasia usando gas tal como CO2 o isofluRane. Estas sustancias son dañinas. Realizar la eutanasia en una campana de humos y manejar las sustancias de acuerdo con directrices de la institución. (PRECAUCIÓN: CO 2: H280, P410, P403; isoflurano: H361d, P260, P281, P280)
    1. Para asegurarse de que el roedor está muerto, garantizar la ausencia de reflejo pellizcando una pata con pinzas. Decapitar al roedor usando tijeras grandes. Para los cachorros, la eutanasia por decapitación.

3. Aislamiento de la columna vertebral

  1. Espolvorear agua sobre la piel para controlar el cabello.
  2. El uso de un par de tijeras, corte abierto la piel a lo largo de la columna vertebral en una dirección distal y aislar la columna vertebral mediante el corte en ambos lados a lo largo de la columna vertebral más allá del hueso de la pelvis. Cortar la médula espinal distal al hueso pélvico con un par de tijeras.
    NOTA: El eje rostral-caudal se denota como el eje proximal-distal durante todo el protocolo.
    1. Recorte de la columna vertebral con un par de tijeras para evitar la proximal-más y más distal áreas, ya que pueden hacer que la columna vertebral también en forma de S para el éxito de la extrusión de la médula espinal. Asegúrese de que la médula espinal es visible en ambos extremos. Si la médula espinal no es visible, el asiento de la columna vertebral con tijeras hasta la médula espinal se hace visible.

4. hidráulica de extrusión de la Médula Espinal

  1. Colocar una placa de Petri (100 mm de diámetro) lleno de PBS estéril en hielo.
  2. Enderezar la columna vertebral mediante la aplicación de un dedo índice en la parte doblada (extremo más proximal) de la columna vertebral, enderezando de ese modo la columna vertebral lo más posible.
    1. Para cachorros, evitar doblar la columna vertebral, como las vértebras se interrumpirá la prestación de extrusión de la médula espinal imposible.
  3. Insertar la punta de la pipeta (23 G aguja para cachorros, de forma alternativa 18 de la aguja G para ratones adultos) en el extremo más distal de la columna vertebral. Si se inserta correctamente, la punta se estabiliza en la cavidad de la médula.
  4. Asegúrese de que la columna vertebral se endereza tanto como sea posible. Aplique una presión constante, y la extrusión de la médula espinal en la placa de Petri en el hielo. Asegúrese de que la médula espinal se mantiene húmedo en hielo por mantenerla en PBS hasta su posterior manipulación.

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Figura 1: médulas espinales representativos. Hidráulicamente extruido médula espinal. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón. ampliaciones lumbares marcados por caja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Identificación de los ganglios de la raíz dorsal (GRD)

  1. Dividir la columna vertebral en dos partes longitudinales iguales utilizando tijeras y colocar la columna vertebral de división bajo el microscopio.
  2. Identificar el segmento T13 vértebra a localizar el sitio de unión de la más distal costillas sobre la columna vertebral prestar atención para no confundir la costae con los nervios intercostales cercanas. Los más distal costae están unidos a la parte proximal del segmento vértebra T13 y el T13 DRG está situado distalmente a T13 vértebra y proximalmente a la vértebra L1.
  3. Identificar los GRD concomitantes en la dirección distal. Para una rata adulta, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para un ratón adulto, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para los cachorros, los GRD concomitantes aparecen como esferas claras.

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Figura 2: Identificación de los GRD en la columna vertebral después de la extrusión de la médula espinal. La columna vertebral se ha dividido que permite la visualización de los GRD, como se indica por las flechas. Ejemplificado por rata adulta y la cría de ratón. ref = objetivo "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Aislamiento de los GRD

  1. Platos Número de Petri (30 mm de diámetro) de acuerdo con los GRD específicos a ser aislados, por ejemplo, L3, L4, L5. Llenar las cajas de Petri con helado de PBS estéril y colocarlos en hielo.
  2. Con unas tijeras micro, dorsal y cortar las raíces ventrales tan cerca de los GRD como sea posible para liberarlos, evitando dañar los GRD.
  3. Con la punta de las pinzas cerradas, suavemente sáquele GRD y transferirlos a las placas de Petri numeradas correspondientes.

figure-protocol-3
Figura 3: Representante aislado GRD. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Tratamiento de tejidos para su posterior análisis

  1. Western Blot
    1. Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación. Si es necesario, separar la médula espinal en ipsilateral y contralateral partes y más en la dorsal y ventral cuernos.
    2. Coloque el tejido en tampón de lisis tal como tampón TNE de lisis (10 mM Tris-base, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP40 en bidestilada H 2 O) que contiene inhibidores de la enzima apropiados sobre hielo.
    3. Homogeneizar el tejido durante aproximadamente 30 s en hielo usando una mano de mortero de molienda mecánica.
    4. Centrifugar durante 15 min a 16.000 xg a 4 ° C y utilizar el sobrenadante para su posterior procesamiento de acuerdo con protocolos estándar 5, 6 o mantener el sobrenadante a -20 ° C hasta su uso posterior.
  2. RNA-análisis
    1. Aislar el tejido de interés.
    2. Colocar inmediatamente el tejido en una solución de estabilización de ARN para estabilizar el ARN para el almacenamiento.
    3. Aislar ARN de acuerdo con protocolos estándar 7.
    4. Convertir RNA a cDNA y realizar qPCR acuerdo con protocolos estándar 7.
  3. La inmunohistoquímica
    1. Para tejido fresco congelado (aplicable a la médula espinal):
      1. Preparar polvo de hielo seco pulverizando los cubos de hielo seco a una cantidad correspondiente a dos cucharadas de polvo. Cubra cubos de hielo seco en un paño y pulverizar los cubos con un martillo. Coloque la hoja de plata (aproximadamente 5 cm x 5 cm) sobre una capa de cubos de hielo seco y cubrir la hoja de plata con el polvo de hielo seco.
      2. Coloque el área de la médula espinal seleccionado para profundizar el análisis sobre el polvo de hielo seco con unas pinzas, se deja complemento de congelación, y la transferencia de la médula espinal a un tubo criogénico. Mantener en hielo seco en todo momento o almacenarla a -80 ° C hasta auxílianosmi.
      3. La transferencia de la médula espinal para un criostato (-20 ° C). Si es necesario, cortar la médula espinal dentro del criostato. Coloque la médula espinal en el interior del material aglomerante criostato con el fin de adjuntarlo a la platina.
      4. Cortar la médula espinal en el espesor deseado, por ejemplo, 5 m, y recoger sobre placas de vidrio. Calentar las placas de vidrio con un dedo inmediatamente antes de la recogida de tejidos para un mejor agarre. Mantenga cualquier tejido sobrante en tubos criogénicos a -80 ° C hasta su uso posterior.
      5. Deje las secciones sobre placas de vidrio en el interior del criostato hasta que esté listo para la post-fijación.
      6. Post-fijar las secciones por inmersión en 4% PFA durante 10 min a temperatura ambiente.
      7. Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8.
    2. tejido fijado para la sección crio (aplicable a la médula espinal y los GRD)
      1. Fijar la médula espinal y los GRD en PFA al 4% (2 h de la médula espinal, 1,5 h para GRD ratón y 4 h de GRD de rata) a4 ° C (lugar de la médula espinal en posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada).
      2. Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior. Si es necesario, recortar la médula espinal para compensar la ampliación lumbar solamente en un tablero de silicona o similar.
      3. Con la punta de una toalla de papel, aspirar el exceso de solución de sacarosa a partir del tejido.
      4. Llenar hasta la mitad un molde crio con material aglomerante. Empuje las burbujas a los lados del molde crio con herramientas tales como pinzas cerradas.
      5. Coloque el tejido en el material de incrustación con unas pinzas y garantizar la orientación tejido deseado.
      6. Llenar el molde crio completamente con el material de incrustación y empujar las burbujas tan lejos de los tejidos como sea posible (por ejemplo, usando pinzas cerradas).
      7. Llene una placa de Petri (100 mmde diámetro) con 2-metilbutano. Esta sustancia es perjudicial. Realice este paso en una campana de humos y manejar la sustancia de acuerdo con directrices de la institución (PRECAUCIÓN: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310).
      8. Coloque la placa de Petri sobre una capa de hielo seco y añadir dos cubos de hielo seco a la placa de Petri. Coloque el molde crio en la placa de Petri y permitir que el material de incrustación para congelar completamente.
      9. Mantener el tejido embebido en hielo seco en todo momento o a -80 ° C envueltos en Parafilm hasta su posterior procesamiento.
      10. Cortar el tejido en un criostato (-20 ° C) en el espesor deseado, por ejemplo 5 m.
      11. Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8.
    3. tejido fijado para la inclusión en parafina (aplicable a la médula espinal y los GRD)
      1. Fijar la médula espinal y los GRD en 4% PFA (2 h para la médula espinal, 1,5 h para GRD de ratón y de 4 h de GRD de rata) a 4 ° C (lugar de la médula espinalen posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada).
      2. Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior.
      3. Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación.
      4. Llenar hasta la mitad un molde de inclusión con parafina.
      5. Enfriar el molde brevemente la incrustación colocándolo en la zona de refrigeración de la máquina de incrustación para endurecer la parafina ligeramente. Esto permite un mejor posicionamiento de los tejidos.
      6. Coloque el tejido en la orientación deseada en el molde de inclusión. Llenar el molde de inclusión con parafina y enfriar inmediatamente.
      7. Coloque el molde de inclusión en parafina que contiene a 4 ° C durante la noche para dejar que se endurezca por completo y retire el bloque de parafina que contiene el tejido del molde de inclusión.
      8. secciones de corte omicrotomo na en el espesor deseado, por ejemplo 5 m.
      9. Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8.

Resultados

Médulas espinales hidráulicamente extruidos presentan una superficie lisa sin daños muestra en la Figura 1. La ampliación lumbar puede ser fácilmente identificado como el área engrosada de la médula espinal, encajonado en la Figura 1. Los lados dorsal y ventral de la médula espinal pueden ser identificados por los ojos de acuerdo con la morfología. En la Figura 1, el lado ventral se enfrenta al espectador, identificable por una línea media clara a lo largo de toda la médula espinal. Dos líneas más generales a lo largo de la médula espinal permiten la identificación de la cara dorsal. En el extremo más distal, la cola de caballo a veces puede permanecer unido en ratas adultas y ratones adultos.

GRD individuales sólo pueden ser identificados mientras se encuentra en la columna vertebral, la Figura 2. Después del aislamiento, la Figura 3, los GRD individuales no pueden ser identificados por la apariencia. Si es necesario, es por lo tantoimportante mantenerlos claramente separados tras el aislamiento. Después del aislamiento, la médula espinal y los GRD pueden ser procesados y se tiñeron como se indica en el paso 7.3 y representado en la Figura 4. La figura 4a muestra una tinción inmunohistoquímica de una sección donde los DRG neuronas y células gliales sus alrededores satélite son claramente visibles. Por la correcta identificación del DRG es posible analizar el efecto de las lesiones del nervio ciático en el soma de la neurona lesionada, así como en sus células gliales satélite circundante. La figura 4b muestra una tinción de Nissl de una médula espinal hidráulicamente extruido en el que el tejido está intacto como se refleja por los bordes lisos de la sección.

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Figura 4: secciones de tejido representativas. A. La tinción inmunohistoquímica de la sección DRG. B. Nissl manchadas sección de la médula espinal hidráulicamente extruido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Si se altera la columna vertebral, por ejemplo, por dislocación cervical, la médula espinal se dividirá durante la extrusión. Si la médula espinal no se puede extruir, la columna vertebral puede ser recortado ligeramente en ambos extremos y el intento de extrusión se puede repetir. En caso de que se necesita toda la médula espinal para su posterior análisis, es decir, que consiste en la ampliación de cuello uterino, así como la ampliación lumbar, la columna vertebral sólo debe ser recortado ligeramente. Si sólo se necesita la ampliación lumbar para su posterior análisis, la médula espinal se debe ajustar de acuerdo con el presente protocolo. La columna vertebral debe enderezarse usando las yemas de los dedos para facilitar la extrusión.

El protocolo es aplicable a los roedores de todas las edades y es aquí ejemplificado por un ratón adulto (8 semanas), una cría de ratón (5 días) y una rata adulta (10 semanas). Dependiendo del tipo de animal y la tensión, el número de secciones torácica y lumbar puede variar 9, 10, 11. Dependiendo de las proteínas a analizar, roedores adultos pueden ser perfundidos con soluciones de inhibidores de enzimas antes de la eutanasia. Si se realiza un experimento con lesión del nervio unilateral, la médula espinal se puede dividir en los lados ipsilaterales y contralaterales utilizando pinzas ultra-finas inmediatamente después de la extrusión. Además, cada lado se puede dividir en lados dorsal y ventral. El tejido puede ser procesada para análisis adicionales, por ejemplo, transferencia Western.

Transcardial perfusión-fijación con PFA antes de la extrusión de la médula espinal debe evitarse, ya que esto hace que la médula espinal no flexible y evita cable de extrusión hidráulica espinal. Hidráulica de extrusión de la médula espinal será arrancar las raíces dorsales. Para los experimentos en los adjuntos raíces dorsales son necesarias, se recomienda laminectomía. Además, meninges espinales se pierden por extrusión hidráulica, que se puede evitar mediante laminectomía estándar 3.

extrusión hidráulica de la médula espinal y el aislamiento DRG también podría llevarse a cabo utilizando oxigenado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en lugar de PBS enfriado en hielo. El uso de ACSF permite la conservación del tejido aislado en un mejor entorno fisiológico, que es particularmente importante en el caso de registros electrofisiológicos posteriores 12, 13. Una alternativa a ACSF podría ser PBS que contiene 1 g / l de glucosa para la generación de cultivos de DRG primaria 14.

extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, lo que reduce el tiempo de manipulación de tejido y por lo tanto reducir el riesgo de daño a las proteínas. La perfusión con un fijador antes de aislar de la médula espinal por laminectomía puede reducir el riesgo de daños en los tejidos durante la disección y durante la extracción final de lade la médula espinal de la columna vertebral. Sin embargo, la fijación del tejido se opone a su aplicabilidad a los análisis, tales como transferencia Western. Los rendimientos de extrusión hidráulicas estructuralmente tejido intacto 3 adecuado para una gama más amplia de análisis.

la definición constante de los GRD puede ser difícil. Sin embargo, esto es esencial para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente. La tinción de tejido de la médula espinal, así como de los GRD se puede optimizar mediante la realización de las variaciones de tratamiento de tejido ilustradas descritas en el paso 7 de protocolo.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a David Kiel, de la Universidad de Aarhus, por filmar y editar. Se utilizó el software VirtualDub para el procesamiento de secuencias de vídeo de microscopio. Agradecemos al Instituto Danés de Investigación de Neurociencia Traslacional - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, por el acceso al equipo y a la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus, al proyecto PAINCAGE de la UE 7FP, Det Frie Forskningsrad (DFF) y a la Fundación Lundbeck por su financiación.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tijeras Bonn, extra finas, rectas, 8,5 cmF.S.C. (Fine Science Tools)# 14084-08Para abrir la médula espinal antes del aislamiento de DRG (ratón adulto, rata adulta); Se puede utilizar otro fabricante
CentrífugaEppendorf# 5427 RPara la centrifugación de tejido homogeneizado
Microtomo de criostatoLeica Biosystems# CM 3050 SPara cortar el tejido incrustado antes de la tinción; Se puede utilizar otro modelo y fabricante
Pinzas, Dumont, # 3F.S.C. (Fine Science Tools)# 11231-30Para el manejo de la médula espinal después de la extrusión; Se puede utilizar otro fabricante/tipo
Pinzas, Dumont, # 5F.S.C. (Fine Science Tools)# 11252-20Para el aislamiento de DRG (ratón adulto, rata adulta, cachorro); Se puede utilizar otro fabricante
Isoflurano (furano) IsoFlo Vet 100%Abbott# 002185Para la eutanasia; Se puede utilizar otro fabricante; ATENCIÓN:
Isopentano tóxico GPR rectapur VWRquímicos# 24872.298Para la congelación instantánea de tejidos; Se puede utilizar otro fabricante; PRECAUCIÓN:
micrótomoLeica Biosystems# RM 2155Para el corte de tejido embebido en parafina; Se puede utilizar otro modelo y fabricante
Pellets de cera de parafinaSigma-Aldrich# 76243Para la inclusión en parafina; Se puede utilizar otro fabricante
Estación de inclusión de tejido de parafinaLeica Biosystems# EG1160Para la inclusión de tejido en parafina para su posterior seccionamiento; Se puede utilizar otro modelo y fabricante
Granulometría, motor inalámbricoSigma-Aldrich# Z359971-1EAPara la homogeneización mecánica de tejido aislado antes de la transferencia occidental; Se puede utilizar otro fabricante
Placa de Petri, 35 mmThermo Fischer Scientific# 121VPara el almacenamiento de DRG aislados; Se puede utilizar otro fabricante y tamaño Placa
Petri, 100 mmSigma-Aldrich# P7741Para la extrusión de la médula espinal; Se puede utilizar otro fabricante y tamaño
Inhibidor de la fosfatasa, PhosstopSigma-Aldrich# 04906845001cóctel de inhibidores de la fosfatasa para agregar al tampón de TNE-lysis si es necesario; Se puede utilizar otro fabricante
Punta de pipeta, 1-200 μ L, sin filtroSarstedt# 70.1189.105Para extrusión hidráulica; Se puede utilizar otro fabricante
Inhibidor de la proteasa,Complete Sigma-Aldrich# 05892791001Cóctel de inhibidores de la proteasa para agregar al tampón TNE-lysis si es necesario; Se puede utilizar otro fabricante
Solución RNAlaterSigma-Aldrich# R0901Para la estabilización de ARN para el almacenamiento; Se puede utilizar otro fabricante
Rneasy Protect Mini KiTQiagen# 74124para el aislamiento de ARN; Se puede utilizar
otro fabricante de bisturí; Cuchilla quirúrgica Swann-Morton n.º 11Swann-Morton# REF0203Para el aislamiento de la zona lumbar de la médula espinal; Se puede utilizar otro fabricante/tipo
Tijeras, rectas, tipo 3, filo de corte de 25 mmBochem# 4070Para el aislamiento de la columna vertebral; Se puede utilizar otro fabricante/tipo
Tijeras, filo de 130 mmHounisen# 1902.0130Para el aislamiento de la médula espinal (rata adulta)
Tijeras de resorte, rectas, filo de corte de 8 mmF.S.C. (Fine Science Tools)# 15009-08Para abrir la columna vertebral antes del aislamiento de DRG (cachorro) y para el aislamiento de DRG (ratón adulto, rata adulta, cachorro); Se pueden utilizar
jeringas estándar de otro fabricante, 2.5 mL, 5 mL, 10 mLTerumo# SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1Para extrusión hidráulica; Se puede utilizar otro fabricante:
Microscopio estereoscópico MZ12.5 con objetivo 1X y ocular 10XLeica# 10446370Se puede utilizar otro fabricante/tipo
PBS estérilGIBCO#10010-015Para extrusión hidráulica; También se puede fabricar de acuerdo con los protocolos estándar
Aguja de jeringa 23 G x 1", 0,6 x 25 mmTerumo Neolus# NN-2325RPara extrusión hidráulica en pups; Se puede utilizar otro fabricante/tipo
Aguja de jeringa 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mmTerumo Neolus# NN-1838SAlternativa a la punta de pipeta para la extrusión hidráulica en ratones adultos; Se puede utilizar otro fabricante
Tissue-TekSakura# 4583Tssue material de inclusión para la criosección posterior
tampón TNE-lysisVWR chemicals# 10128-582Para la lisis de tejidos antes de la Western blot; Se puede utilizar otro fabricante; También se puede fabricar de acuerdo con protocolos estándar
tóxico de:

Referencias

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