Una evaluación funcional de la placa neuromuscular (NMJ) puede proporcionar información esencial sobre la comunicación entre el músculo y del nervio. Aquí se describe un protocolo para evaluar exhaustivamente el NMJ y músculo funcionalidad utilizando dos preparaciones diferentes músculo-nerviosa, es decir, sóleo-ciático y frénico-diafragma.
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Artículo de método
Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular
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Resumen
Resumen
Funcionalidad de la placa neuromuscular (NMJ) desempeña un papel fundamental al estudiar enfermedades en que la comunicación entre neurona motora y músculo se deteriora, como el envejecimiento y esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Aquí describimos un protocolo experimental que puede utilizarse para medir funcionalidad NMJ combinando dos tipos de estimulación eléctrica: dirigir la estimulación de la membrana muscular y la estimulación a través del nervio. La comparación de la respuesta del músculo a estos dos estímulos diferentes puede ayudar a definir, a nivel funcional, posibles alteraciones en el NMJ que conducen a deterioro funcional en el músculo.
Preparaciones dex vivo E son adecuadas para estudios bien controlados. Aquí describimos un protocolo intensivo para medir varios parámetros de funcionalidad NMJ para la preparación del nervio ciático en sóleo y para la preparación del nervio frénico-diafragma y músculo. El protocolo dura aproximadamente 60 minutos y se lleva a cabo ininterrumpidamente por medio de una medida software que mide las propiedades de la cinética de contracción, la relación de la frecuencia de la fuerza para estimulación de músculo y nervio y dos parámetros específicos a la funcionalidad de la NMJ, es decir falta de neurotransmisión y fatiga intratetanic. Esta metodología fue utilizada para detectar daños en preparaciones de nervio Músculo sóleo y el diafragma mediante el uso de ratón transgénico de SOD1G93A , un modelo experimental de esclerosis lateral amiotrófica que ubicuo overexpresses del mutante antioxidante enzima superóxido dismutasa 1 (SOD1).
Introducción
La Unión neuromuscular (NMJ) es una sinapsis química formada por la conexión entre la placa motora de la fibra muscular y el axón de la neurona motora terminal. El NMJ ha demostrado jugar un papel crucial cuando la comunicación entre el músculo y el nervio se deteriora, como ocurre en el envejecimiento o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Como músculo y del nervio se comunican en forma bidireccional1,2, pudiendo medir NMJ defectos por separado de defectos músculo puede proporcionar nuevas perspectivas sobre su interrelación fisiopatológica. De hecho, esta evaluación funcional puede ayudar a evaluar si alteraciones morfológicas o bioquímicas reducen la funcionalidad de señalización de la neurotransmisión.
La comparación de la respuesta contráctil muscular provocada por estimulación del nervio y la respuesta del músculo mismo evocado por estimulación directa de su membrana se ha propuesto como una medida indirecta de la funcionalidad de la NMJ. De hecho, desde membrana estímulo por pases neurotransmisión señalización, cualquier diferencia en las dos respuestas contráctiles puede atribuirse a los cambios en el NMJ. Este enfoque ha sido ampliamente propuesto para las ratas3,4,5,6,7y también se utiliza para recopilar información sobre los modelos de ratón8,9,10,11,12.
Aquí, describimos en detalle un procedimiento para suprimir dos preparaciones de músculo-nerviosa, e. i. los preparativos sóleo-ciático y frénico-diafragma. Mediante una medida software, diseñamos un protocolo de pruebas continuado que combina la medición de varios parámetros que caracterizan la funcionalidad de NMJ y músculo, lo que rinde una evaluación comprensiva del daño NMJ por separado del músculo. En particular, el protocolo mide la fuerza de contracción, la cinética muscular, la curva de frecuencia de la fuerza directa y estímulos del nervio, la neurotransmisión falta13 para un disparo y las frecuencias tetánicas y la fatiga intratetanic7.
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Protocolo
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Roma Sapienza-Unidad de Histología y Embriología Médica y se realizaron de acuerdo con la versión vigente de la Ley Italiana sobre la Protección de Animales.
1. Configuración experimental
- Configure el sistema experimental compuesto por 1 actuador/transductor, 2 estimuladores, 1 aparato muscular in vitro, 1 baño de tejidos para preparación, 1 electrodo de succión, 1 osciloscopio digital, 1 estereomicroscopio, 1 iluminador de luz fría, 1 tarjeta de adquisición, 1 bloque de conexión y una computadora personal.
NOTA: Aquí el software de control fue programado en LabView y fue diseñado para garantizar una alta flexibilidad, precisión y repetibilidad de las estimulaciones. Para cada estimulación, el usuario puede seleccionar el ancho del pulso, la frecuencia, la duración, y decidir si se aplica a la membrana o a través del nervio. El usuario también puede seleccionar la duración del período de reposo antes de cada estimulación.
2. Evaluación de las propiedades contráctiles de la unión neuromuscular de los músculos sóleo y diafragma
- Calentamiento del sistema
- Preparar el tampón de Krebs Ringer14 y colocarlo en un baño del aparato de montaje y en el baño de tejidos preparatorio. Colocar una placa de 60 mm preparada con 4 ml de silicona en el baño de tejidos preparatorio.
- Encender el baño de agua circulante y ajustar la temperatura a 30 °C para el músculo sóleo y a 27 °C para el músculo diafragma.
- Permitir que fluya una mezcla de 95 % O2 - 5 % CO2 hacia ambos baños.
- Encender el actuador/transductor y los dos estimuladores de pulso, y ajustar los valores de corriente a 300 mA para la estimulación de la membrana y a 5 mA para la estimulación del nervio.
NOTA: Se ha demostrado previamente que el valor de corriente de 300 mA no induce ninguna contracción significativa en las ramas nerviosas cuando se añade D-tubocurarina a la solución15. El valor de corriente de 5 mA corresponde a la cantidad necesaria para estimular el músculo a través del nervio sin generar solapamiento con la estimulación de la membrana inducida mediante la solución. Dado que la distancia entre el electrodo de succión y el músculo depende de la longitud del nervio, este valor de corriente debe ajustarse cuidadosamente antes de cada experimento, como se describe a continuación.
- Diseción del sóleo y del diafragma
- Sacrificar al ratón mediante dislocación cervical para minimizar el sufrimiento, y extraer inmediatamente los músculos para su análisis según lo siguiente.
- Preparación, disección y montaje del sóleo-ciático
- Sprayear etanol al 70 % sobre la pata del ratón y retirar la piel que la cubre. Hacer una incisión en la parte superior de la pata con un par de tijeras y luego tirar firmemente de la piel. Aislar el tendón de Aquiles de la tibia y cortar entonces el tendón de Aquiles con un par de tijeras.
- Apretar firmemente el tendón con un par de pinzas y tirar suavemente del músculo gastrocnemio junto con el sóleo. Una vez expuesto el tendón proximal del sóleo, cortar toda la pantorrilla con un par de tijeras mientras se sigue sujetando el tendón de Aquiles. Colocar inmediatamente la muestra de tejido en el baño de tejidos preparatorio.
- Colocar el baño preparatorio bajo el estereomicroscopio y fijar la pantorrilla a la placa de silicona utilizando alfileres de acero inoxidable de 0,20 mm de diámetro. Con un par de pinzas, sujetar el tendón proximal del sóleo y tirar suavemente para exponer la inervación ciática.
- Una vez expuesta la inervación (Figura 1), retirar cuidadosamente el tejido circundante para exponer aproximadamente 5 mm del nervio. Usar un par de tijeras finas para cortar el nervio. Mientras se sujeta firmemente el sóleo por el tendón proximal con un par de pinzas, tirar nuevamente y extraerlo cortando el tendón de Aquiles con un par de tijeras.
- Pasar un hilo de nailon a través del orificio del brazo de palanca del actuador/transductor. Hacer un lazo en el extremo del hilo y sujetar el tendón de Aquiles antes de tirar del hilo hacia atrás hasta que el músculo alcance el baño del aparato de montaje. Sujetar el tendón proximal dentro de la pinza fija y atar el hilo de nailon alrededor del brazo de palanca. Dejar que el músculo se equilibre en la solución.
- Determinar la longitud óptima inicial (L0).
- Primero, estirar el músculo para precargarlo a 10 mN (este valor garantiza la fuerza máxima de contracción única, basado en la experiencia). Luego, estirar suavemente el músculo para modificar la precarga y estimularlo con una serie de pulsos simples. La longitud óptima se alcanza cuando se mide la fuerza máxima de contracción única.
- Preparación, disección y montaje del diafragma-frénico
- Sprayear etanol al 70 % sobre la piel del ratón. Retirar la piel que cubre el músculo diafragma haciendo una incisión sobre el esternón con un par de tijeras y tirando firmemente de la piel.
- Con un par de tijeras, cortar el abdomen horizontalmente por debajo del esternón y retirar suavemente el intestino y los órganos con un par de pinzas. Usar un par de tijeras gruesas para cortar la columna vertebral.
- Cortar las costillas aproximadamente 1 cm por encima del esternón y continuar horizontalmente. Retirar suavemente los órganos externos con un par de pinzas y cortar la columna vertebral para obtener un anillo circular de costillas que contenga el diafragma.
- Lavar la preparación en una placa que contenga tampón de Krebs Ringer y luego colocarla en la placa de silicona dentro del baño de tejidos preparatorio, con la cara superior hacia arriba y el esternón orientado hacia adelante.
- Usando el estereomicroscopio, retirar cuidadosamente los pulmones y los órganos restantes; el nervio frénico será visible en el lado derecho (Figura 2A).
- Recortar las costillas para dejar un anillo de aproximadamente 2 mm a lo largo de todo el diafragma.
- Usando pinzas, fijar un alfiler de acero inoxidable de 0,20 mm de diámetro en el tendón central del diafragma en el punto correspondiente a la inervación del nervio frénico, y otro alfiler en las costillas sobre el mismo eje para identificar la tira de diafragma de interés.
- Fijar dos alfileres adicionales en el tendón central y otros dos en las costillas a ambos lados de la tira seleccionada para extender el diafragma. Si es necesario, limpiar el nervio frénico del tejido conectivo circundante usando pinzas.
- Usando una hoja curva, cortar el diafragma a ambos lados de la inervación para identificar una tira tendón-músculo-costilla como se muestra en Figura 2B.
- Pasar un hilo de nailon a través del orificio del brazo de palanca del actuador/transductor. Hacer un lazo en el extremo del hilo y sujetar el tendón antes de tirar del hilo hacia atrás hasta que el músculo alcance el baño del aparato de montaje.
- Sujetar las costillas dentro de la pinza fija y atar el hilo de nailon alrededor del brazo de palanca.
- Dejar que el músculo se equilibre en la solución y determinar la longitud óptima inicial (L0).
- Estirar el músculo para precargarlo a 5 mN. Estirar suavemente el músculo para modificar la precarga y estimularlo con una serie de pulsos simples. La longitud óptima se alcanza cuando se mide la fuerza máxima de contracción única.
Figura 1 - Preparación del nervio ciático-soleo. Vista del nervio ciático-soleo durante la intervención quirúrgica para las pruebas funcionales. El nervio ciático se expone utilizando un par de pinzas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 - Preparación del diafragma con el nervio frénico. La imagen muestra una fase de la disección de la preparación del diafragma con el nervio frénico (A) y la tira que se montará para las pruebas funcionales (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Medición de las propiedades de la unión neuromuscular por separado de la contractilidad muscular
- Establezca la intensidad de corriente óptima para la estimulación a través del nervio y verifique que los pulsos de corriente entregados mediante el electrodo de succión no provoquen contracción muscular por dispersión de la corriente en el baño.
- Coloque el electrodo de succión cerca del músculo y aspire el nervio hacia adentro. Mientras aumenta suavemente la intensidad de corriente (comenzando desde 5 mA), estimule el músculo con una serie de pulsos simples. El valor óptimo de corriente se determina cuando la fuerza del espasmo es máxima.
- Empuje el nervio hacia afuera del electrodo y aplique algunos pulsos simples. Asegúrese de que el músculo no se contraiga debido a la superposición con la estimulación de la membrana por medio de la solución. Vuelva a introducir el nervio en el electrodo.
- Inicie el programa y seleccione el archivo de entrada para ejecutar el protocolo de pruebas deseado.
NOTA: El archivo de entrada incluye todos los parámetros de estimulación necesarios para ejecutar todo el protocolo. Aunque se utiliza la misma estructura de protocolo para ambos músculos, los parámetros de estimulación difieren según si el protocolo se refiere al músculo sóleo o al diafragma.- Estimulación del nervio ciático-sóleo (véase la Tabla 1)
- Utilice los siguientes anchos de pulso para todas las estimulaciones eléctricas: 1,4 ms para la estimulación del nervio ciático y 0,1 ms para la estimulación directa del sóleo. El protocolo completo dura aproximadamente 65 min.
- Estimulación del nervio frénico-diafragma (véase la Tabla 2)
- Utilice los siguientes anchos de pulso para todas las estimulaciones eléctricas: 1,8 ms para la estimulación del nervio frénico y 0,2 ms para la estimulación directa del diafragma. El protocolo completo dura aproximadamente 55 min.
- Al final del protocolo experimental, mida la longitud y el peso húmedo del músculo utilizando un calibrador analógico con una precisión de 0,05 mm y una balanza de precisión con una exactitud de 0,1 mg, respectivamente.
- Calcule el área de la sección transversal (CSA) dividiendo la masa muscular por el producto de la longitud óptima de la fibra (Lf) y la densidad del músculo esquelético de mamífero (1,06 mg/mm3)16.
NOTA: Lf se obtiene multiplicando L0 por la relación entre la longitud de la fibra y la longitud del músculo (0,71 para el músculo sóleo16 y 1 para el músculo diafragmático17).
- Calcule el área de la sección transversal (CSA) dividiendo la masa muscular por el producto de la longitud óptima de la fibra (Lf) y la densidad del músculo esquelético de mamífero (1,06 mg/mm3)16.
- Estimulación del nervio ciático-sóleo (véase la Tabla 1)
- Establezca la intensidad de corriente óptima para la estimulación a través del nervio y verifique que los pulsos de corriente entregados mediante el electrodo de succión no provoquen contracción muscular por dispersión de la corriente en el baño.
| Tipo de experimento | Frecuencia | Duración | Repeticiones | Estimulación del músculo o nervio | Propósito |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contracción individual | Impulso único | 1 | Músculo | Fuerza y cinética de la contracción individual | |
| Descanso | 30 | ||||
| Contracción individual | Impulso único | 1 | Nervio | ||
| Descanso | 30 | ||||
| Contracción individual | Impulso único | 1 | Músculo | ||
| Descanso | 30 | ||||
| Contracción individual | Impulso único | 1 | Nervio | ||
| Descanso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 40 | 0,8 | 1 | Nervio | Curvas fuerza/frecuencia para estimulaciones del nervio y del músculo |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania completa | 80 | 0,8 | 1 | Nervio | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,8 | 1 | Nervio | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania completa | 80 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,8 | 1 | Nervio | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 40 | 0,8 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 300 | ||||
| Paradigma de fatiga | 35 | 0,8 | 1 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de descanso de 1,2 s cada una, repetido 20 veces | Falla en la neurotransmisión (NF) | |
| Descanso | 900 | ||||
| Paradigma de fatiga | 80 | 0,8 | 1 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de descanso de 1,2 s cada una, repetido 20 veces | Falla en la neurotransmisión (NF) y fatiga intratetánica (IF) | |
Tabla 1 - Protocolo de estimulación del nervio ciático-sóleo. La tabla enumera la secuencia de pruebas que conforman el protocolo completo para evaluar preparaciones del nervio ciático-sóleo.
| Tipo de experimento | Frecuencia | Duración | Repeticiones | Estimulación del músculo o nervio | Propósito |
| (Hz) | (s) | ||||
| Contracción única | Impulso único | 1 | Músculo | Fuerza y cinética de la contracción única | |
| Descanso | 30 | ||||
| Contracción única | Impulso único | 1 | Nervio | ||
| Descanso | 30 | ||||
| Contracción única | Impulso único | 1 | Músculo | ||
| Descanso | 30 | ||||
| Contracción única | Impulso único | 1 | Nervio | ||
| Descanso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,5 | 1 | Nervio | Curvas fuerza/frecuencia para estimulaciones del nervio y del músculo |
| Descanso | 120 | ||||
| Tetania completa | 100 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 40 | 0,5 | 1 | Nervio | |
| Descanso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 120 | ||||
| Tetania incompleta | 80 | 0,5 | 1 | Nervio | |
| Descanso | 150 | ||||
| Tetania incompleta | 80 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 150 | ||||
| Tetania incompleta | 20 | 0,5 | 1 | Nervio | |
| Descanso | 120 | ||||
| Tetania completa | 100 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 150 | ||||
| Tetania completa | 100 | 0,5 | 1 | Nervio | |
| Descanso | 180 | ||||
| Tetania incompleta | 60 | 0,5 | 1 | Músculo | |
| Descanso | 300 | ||||
| Paradigma de fatiga | 35 | 0,33 | 1 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de descanso de 0,67 s cada una, repetido 20 veces | Falla en la neurotransmisión (NF) | |
| Descanso | 900 | ||||
| Paradigma de fatiga | 80 | 0,33 | 1 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de descanso de 0,67 s cada una, repetido 20 veces | Falla en la neurotransmisión (NF) y fatiga intratetánica (IF) | |
Tabla 2 - Protocolo de estimulación del diafragma-nervio frénico. La tabla enumera la secuencia de pruebas que conforman el protocolo completo para evaluar preparaciones del diafragma-nervio frénico.
3. Análisis de datos
NOTA: Al final del protocolo, calcule todos los parámetros deseados de la siguiente manera.
- A partir de la estimulación con un solo pulso
- Calcule la fuerza de contracción (mN; fuerza activa máxima generada durante la contracción) y la fuerza específica de contracción (mN/mm)2). Calcúlelo restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza específica del espasmo como la fuerza del espasmo dividida por el área de la sección transversal (CSA) del músculo.
- Calcule el tiempo hasta la tensión máxima (TTP) (ms) como el tiempo desde la liberación del pulso hasta la fuerza del espasmo.
- Calcule el tiempo medio de relajación (1/2RT) (ms) como el tiempo desde la fuerza del espasmo hasta el 50 % de la fuerza del espasmo.
- Calcule dF/dt (mN/ms) como el valor máximo de la derivada de la fuerza durante la fase contráctil.
- Calcule -dF/dt (mN/ms) como el valor máximo de la derivada de la fuerza durante la fase de relajación.
- De estimulaciones con trenes de pulsos
- Calcular la fuerza no fusionada (mN) y la fuerza específica no fusionada (mN/mm)2). Calcúlelo restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza específica no fusionada como la fuerza no fusionada dividida por el ACS del músculo.
NOTA: La fuerza no fusionada es la fuerza activa máxima generada durante un tren de impulsos con una frecuencia inferior a la frecuencia tetánica. - Calcule la fuerza tetánica (mN) y la fuerza tetánica específica (mN/mm²); la fuerza máxima es la fuerza activa máxima generada durante un tren de impulsos aplicado a frecuencia tetánica. Calcúlela restando el valor inicial de precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza tetánica específica como la fuerza tetánica dividida por el área de la sección transversal (CSA) del músculo.
- Calcule la curva fuerza-frecuencia. Represente el valor de la fuerza (o fuerza específica) obtenido para cada estimulación frente a la frecuencia creciente de estimulación. Habitualmente, comienza con la estimulación mediante un pulso único y termina con la frecuencia tetánica.
- Calcular la fuerza no fusionada (mN) y la fuerza específica no fusionada (mN/mm)2). Calcúlelo restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza específica no fusionada como la fuerza no fusionada dividida por el ACS del músculo.
- De los paradigmas de fatiga
- Calcule la falla en la neurotransmisión (NF) como:
donde MF es la disminución de la fuerza tras la estimulación muscular y F es la disminución de la fuerza tras la estimulación nerviosa, medida en el primer tren de impulsos después de la estimulación muscular. - Calcular la fatiga intratetánica (IF) como:
donde Flp es la fuerza generada por el músculo en el último pulso de estimulación, y Fm es la fuerza máxima generada por el músculo durante el mismo tren de impulsos. Con respecto a la estimulación del nervio, calcule la fatiga intratetánica en el primer tren de impulsos inmediatamente después de la estimulación directa.
- Calcule la falla en la neurotransmisión (NF) como:
4. Análisis estadístico
NOTA: Los modelos de análisis estadístico deben elegirse según si la respuesta muscular a la estimulación nerviosa y a la estimulación de la membrana se compara dentro del mismo modelo animal o entre dos modelos animales diferentes18,19.
- Utilice la prueba t de Student para TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt si compara únicamente las respuestas musculares a estimulaciones directas e indirectas. Si compara preparaciones musculares obtenidas de 2 cepas diferentes de ratones, utilice un ANOVA de dos vías con el tipo de estimulación y la cepa del ratón como factores fijos. Cuando el ANOVA de dos vías arroje un resultado significativo, utilice pruebas de comparación múltiple para buscar diferencias estadísticas.
- Para la curva fuerza-frecuencia (si compara únicamente las respuestas musculares a estimulaciones directas e indirectas), utilice un ANOVA de dos vías con el tipo de estimulación y la frecuencia de estimulación como factores fijos. Utilice pruebas de comparación múltiple si es necesario.
- Si compara preparaciones musculares obtenidas de 2 cepas diferentes de ratones, utilice un ANOVA de tres vías con el tipo de estimulación, la frecuencia de estimulación y la cepa del ratón como factores fijos.
- Cuando el ANOVA de tres vías revele un efecto significativo de los factores cepa del animal y tipo de estimulación, utilice un ANOVA de dos vías para identificar diferencias significativas entre dos grupos a la vez. Por ejemplo, se pueden evaluar las diferencias entre la respuesta muscular de los dos grupos a la estimulación de la membrana, o entre la respuesta muscular a estimulaciones directas e indirectas dentro de un mismo grupo.
- Si compara preparaciones musculares obtenidas de 2 cepas diferentes de ratones, utilice un ANOVA de tres vías con el tipo de estimulación, la frecuencia de estimulación y la cepa del ratón como factores fijos.
- Fatiga intratetánica
NOTA: Dado que el protocolo fue diseñado para inducir fatiga en respuesta a la estimulación del nervio incluso en ratones control, este parámetro solo puede utilizarse para investigar diferencias entre dos cepas de ratones, y un análisis estadístico dentro de un solo grupo siempre arrojaría diferencias significativas.- Para comparar dos grupos, utilice un ANOVA de tres vías con el tipo de estimulación, el tiempo y la cepa del ratón como factores fijos. Cuando el ANOVA de tres vías revele un efecto significativo de los factores cepa del animal y tipo de estimulación, utilice un ANOVA de dos vías para identificar diferencias significativas entre dos grupos a la vez, como en el caso de la curva fuerza-frecuencia.
- Para el fallo de la neurotransmisión, utilice un ANOVA de dos vías con la cepa del animal y el tiempo como factores fijos. Si arroja resultados significativos, utilice pruebas de comparación múltiple para buscar diferencias estadísticas.
NOTA: Dado que este parámetro solo proporciona un valor por cada cepa de ratón, permite comparar diferentes modelos de ratón. - Para el peso, longitud y ACS del músculo, utilice la prueba t de Student para investigar diferencias al comparar preparaciones músculo-nervio de diferentes modelos animales.
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Resultados
El protocolo que se describe proporciona información sobre la denervación funcional en varias enfermedades neuromusculares o envejecimiento-sarcopenia. Este protocolo puede utilizarse para determinar si (y, en caso afirmativo, en qué nivel) alteraciones de la musculatura se deben a cambios selectivos que ocurren en el músculo sí mismo o en la transmisión neuromuscular. Los datos que se muestran a continuación son los resultados de un trabajo previo por nuestro grupo18
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Discusión
El protocolo experimental descrito proporciona una manera ideal de medir y discriminar alteraciones funcionales que se han producido directamente en el músculo o indirectamente en el nivel de placa neuromuscular. Puesto que esta técnica se basa en una medición indirecta de la funcionalidad de la NMJ, no puede utilizarse para establecer si un defecto está relacionado con cambios morfológicos o a cambios bioquímicos. Por el contrario, proporciona una manera eficaz de determinar si las alteraciones morfológicas o bioquímica...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Trabajo en laboratorio de los autores fue apoyada por Fondazione Roma y Teletón (no de la concesión. GGP14066).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Sistema de palanca de modo dual | Aurora Científica Inc. | 300B | actuador/transductor |
| Estimulador bifásico de alta potencia | Aurora Científica Inc. | 701B | (nervio) |
| Estimulador bifásico de alta potencia | Aurora Científica Inc. | 701C | estimulador de pulso (músculo) |
| Aparato muscular in vitro | Aurora Científica Inc. | 800A | |
| Baño de tejido preparatorio | Radnoti | 158400 | |
| Electrodo de succión monopolar | A-M Systems | 573000 | con una referencia casera |
| Osciloscopio | Tektronix | TDS2014 | |
| Microscopio estereoscópico | Nikon | SMZ 800 | |
| Iluminador de luz fría | Photonic Optics | PL 3000 | |
| Placa de adquisición | National Instruments | NI PCIe-6353 | |
| Bloque de conectores | National Instruments | NI 2110 | |
| Ordenador personal | AMD Phenom II x4 970 | Procesador 3.50 Ghz con Windows 7 | |
| Software LabView 2012 | National Instruments | ||
| Krebs-Ringer Bicarbonato Búfer | Sigma-Aldrich | K4002 | tampón fisiológico |
| Bicarbonato de sodio | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Cloruro de calcio CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | anhidro, polvo, ≥ 97% |
| Tampón HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | ≥ 99.5% (titulación) |
| Platos 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Poliestireno |
| Silicona | Sylgard | 184 Silicona | Kit de elastómeros 0.5Kg. |
| Termostato | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Bomba | Newa Mini | MN 606 | para acuario |
| Resistencia al calor Thermocable | Lucky Reptile | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| Cubo | cualquiera 10 litros | Polipropileno | |
| O2 + 5%CO2 | siad | Mezcla de gas | |
| #5 Pinzas | Fine Science Tools | 11252-20 | 2 unidades |
| Tijeras de resorte - 8 mm Cuchillas | Fine Science Tools | 15024-10 | escisión de nervios |
| Tijeras afiladas | Herramientas de Bellas Ciencias | 14059-11 | extirpación de músculo |
| Tijeras delicadas | Wagner | 02.06.32 | externo del animal |
| Mango de bisturí de estudiante #3 | Herramientas de ciencia fina | 91003-12 | |
| Hojas de bisturí # 10 | Herramientas de ciencia fina | 10010-00 | |
| Hojas de bisturí #11 | Herramientas de ciencia fina | 10011-00 | |
| alambre de nylon y Oslash; 0,16 mm | cualquiera |
Referencias
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
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