Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

La Unión neuromuscular (NMJ) es una sinapsis química formada por la conexión entre la placa motora de la fibra muscular y el axón de la neurona motora terminal. El NMJ ha demostrado jugar un papel crucial cuando la comunicación entre el músculo y el nervio se deteriora, como ocurre en el envejecimiento o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Como músculo y del nervio se comunican en forma bidireccional^1,2, pudiendo medir NMJ defectos por separado de defectos músculo puede proporcionar nuevas perspectivas sobre su interrelación fisiopatológica. De hecho, esta evaluación funcional puede ayudar a evaluar si alteraciones morfológicas o bioquímicas reducen la funcionalidad de señalización de la neurotransmisión.

La comparación de la respuesta contráctil muscular provocada por estimulación del nervio y la respuesta del músculo mismo evocado por estimulación directa de su membrana se ha propuesto como una medida indirecta de la funcionalidad de la NMJ. De hecho, desde membrana estímulo por pases neurotransmisión señalización, cualquier diferencia en las dos respuestas contráctiles puede atribuirse a los cambios en el NMJ. Este enfoque ha sido ampliamente propuesto para las ratas^3,4,5,6,7y también se utiliza para recopilar información sobre los modelos de ratón^8,9,10,11,12.

Aquí, describimos en detalle un procedimiento para suprimir dos preparaciones de músculo-nerviosa, e. i. los preparativos sóleo-ciático y frénico-diafragma. Mediante una medida software, diseñamos un protocolo de pruebas continuado que combina la medición de varios parámetros que caracterizan la funcionalidad de NMJ y músculo, lo que rinde una evaluación comprensiva del daño NMJ por separado del músculo. En particular, el protocolo mide la fuerza de contracción, la cinética muscular, la curva de frecuencia de la fuerza directa y estímulos del nervio, la neurotransmisión falta¹³ para un disparo y las frecuencias tetánicas y la fatiga intratetanic⁷.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Unidad de Histología y Embriología Médica de la Universidad La Sapienza de Roma y se realizaron de acuerdo con la versión actual de la Ley Italiana sobre la Protección de los Animales.

1. Configuración experimental

1. Puesta en marcha del sistema experimental compuesto por 1 actuador/transductor, 2 estimuladores, 1 aparato muscular in vitro, 1 baño de tejido preparatorio, 1 electrodo de aspiración, 1 osciloscopio digital, 1 microscopio estereoscópico, 1 iluminador de luz fría, 1 placa de adquisición, 1 bloque conector y un ordenador personal
   NOTA: Aquí el software de comando fue programado en LabView y fue diseñado para garantizar una alta flexibilidad, precisión y repetibilidad de las estimulaciones. Para cada estimulación, el usuario puede seleccionar el ancho de pulso, la frecuencia, la duración y decidir si se administra a la membrana o a través del nervio. El usuario también puede seleccionar la duración del período de descanso antes de cada estimulación.

2. Evaluaciones de las propiedades contráctiles NMJ de los músculos del sóleo y el diafragma

1. Calentamiento del sistema
   1. Prepare el tampón Krebs Ringer¹⁴ y colóquelo en un baño del aparato de montaje y el baño de tejido preparatorio. Coloque un plato de 60 mm preparado con 4 ml de silicona en el baño de pañuelos preparatorio.
   2. Abra el baño de agua circulante y ajuste la temperatura a 30 °C para el músculo sóleo y a 27 °C para el músculo diafragma.
   3. Permita que la mezcla de 95% de O₂ - 5% de CO₂ fluya en ambos baños.
   4. Encienda el actuador/transductor y los dos estimuladores de impulsos y ajuste los valores de corriente a 300 mA para la estimulación de membrana y a 5 mA para la estimulación nerviosa.
      NOTA: Se ha demostrado previamente que el valor de corriente de 300 mA no induce ninguna contracción significativa en las ramas nerviosas cuando se añade D-tubocurarina a la solución¹⁵. El valor de corriente de 5 mA corresponde a la cantidad de corriente requerida para estimular el músculo a través del nervio sin crear una superposición con la estimulación de la membrana inducida por medio de la solución. Dado que la distancia entre el electrodo de succión y el músculo depende de la longitud del nervio, este valor de corriente debe ajustarse cuidadosamente antes de cada experimento, como se describe a continuación.
2. Disección de sóleo y diafragma
   1. Sacrifique al ratón por dislocación cervical para minimizar el sufrimiento, e inmediatamente extirpe los músculos para realizar la prueba de la siguiente manera.
   2. Preparación, disección y montaje sóleo-ciático
      1. Rocíe etanol al 70% en la pata del ratón y retire la piel que cubre la pierna. Haga una incisión en la parte superior de la pierna con unas tijeras y luego tire de la piel con firmeza. Aísla el tendón de Aquiles de la tibia y luego corta el tendón de Aquiles con unas tijeras.
      2. Sujete firmemente el tendón con un par de pinzas y tire suavemente del músculo gastrocnemio junto con el sóleo. Una vez que el tendón proximal del sóleo esté expuesto, corte toda la pantorrilla con unas tijeras mientras aún sostiene el tendón de Aquiles. Coloque inmediatamente la muestra de tejido en el baño de tejido preparatorio.
      3. Coloque el baño preparatorio bajo el microscopio estereoscópico y fije la pantorrilla a la placa de silicona con clavijas de acero inoxidable de 0,20 mm de diámetro. Con un par de pinzas, sujete el tendón proximal del sóleo y tire suavemente de él para exponer la inervación ciática.
      4. Una vez expuesta la inervación (Figura 1), retire con cuidado el tejido circundante para exponer unos 5 mm del nervio. Usa unas tijeras finas para cortar el nervio. Mientras sujeta firmemente el sóleo en el tendón proximal con un par de pinzas, tire de él nuevamente y excíralo cortando el tendón de Aquiles con unas tijeras.
      5. Pase un cable de nailon a través del orificio del brazo de palanca del actuador/transductor. Cree una soga en el extremo del alambre y agarre el tendón de Aquiles antes de tirar del cable hacia atrás hasta que el músculo llegue al baño del aparato de montaje. Sujete el tendón proximal dentro de la abrazadera fija y ate el alambre de nailon alrededor del brazo de la palanca. Permita que el músculo se equilibre en la solución.
      6. Determine la longitud óptima inicial (L₀).
         1. Primero, estire el músculo para precargarlo a 10 mN (este valor garantiza la fuerza de contracción máxima (según la experiencia)). A continuación, estira suavemente el músculo para cambiar la precarga y estimularlo con una serie de pulsos individuales. La longitud óptima se alcanza cuando se mide la fuerza de contracción máxima.
   3. Preparación, disección y montaje del diafragma y el frénico
      1. Rocíe etanol al 70% sobre la piel del ratón. Retire la piel que cubre el músculo del diafragma haciendo una incisión sobre el esternón con unas tijeras y tirando de la piel con firmeza.
      2. Con unas tijeras, corte el abdomen horizontalmente por debajo del esternón y retire suavemente el intestino y los órganos con un par de pinzas. Usa un par de tijeras gruesas para cortar el lomo.
      3. Corta las costillas aproximadamente 1 cm sobre el esternón y procede horizontalmente. Retire suavemente los órganos externos con un par de pinzas y corte la columna vertebral para obtener un anillo circular de costillas que contenga el diafragma.
      4. Lave la preparación en un plato que contenga el tampón Krebs Ringer y luego colóquelo en el plato de silicona dentro del baño de pañuelos preparatorio, con la parte superior hacia arriba y el esternón hacia adelante.
      5. Usando el microscopio estereoscópico, extraiga cuidadosamente los pulmones y los órganos restantes; el nervio frénico será visible en el lado derecho (Figura 2A).
      6. Recorta las costillas para dejar un anillo de unos 2 mm a lo largo del diafragma.
      Con ayuda de
      7. pinzas, fije un pasador de acero inoxidable de 0,20 mm de diámetro en el tendón central del diafragma en el punto correspondiente a la inervación del nervio frénico, y otro clavo en las costillas del mismo eje para identificar la tira de diafragma de interés.
      8. Fije dos clavijas adicionales en el tendón central y otras dos clavijas en las nervaduras a cada lado de la tira seleccionada para colocar el diafragma. Si es necesario, limpie el nervio frénico del tejido conectivo circundante con fórceps.
      9. Con una cuchilla curva, corte el diafragma a ambos lados de la inervación para identificar una tira de tendón-músculo-costilla como se muestra en Figura 2B.
      10. Pase un cable de nailon a través del orificio del brazo de palanca del actuador/transductor. Cree una soga en el extremo del cable y agarre el tendón antes de tirar del cable hacia atrás hasta que el músculo llegue al baño del aparato de montaje.
      11. Sujete las costillas dentro de la abrazadera fija y ate el alambre de nailon alrededor del brazo de la palanca.
      12. Permita que el músculo se equilibre en la solución y determine la longitud óptima inicial (L0).
          1. Estire el músculo para precargarlo a 5 mN. Estirar suavemente el músculo para cambiar la precarga y estimularlo con una serie de pulsaciones individuales. La longitud óptima se alcanza cuando se mide la fuerza de contracción máxima.

Figura 1 - Preparación del nervio sóleo-ciático. Nervio sóleo-ciático durante la intervención quirúrgica para las pruebas funcionales. La ciática se expone con un par de pinzas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 - Preparación del nervio diafragma-frénico. La imagen muestra una fase de la escisión de la preparación del nervio diafragma-frénico (A) y la tira que se montará para las pruebas funcionales (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Medición de las propiedades de la NMJ por separado de la contractilidad muscular
   1. Establezca la mejor intensidad de corriente para la estimulación a través del nervio y verifique que los impulsos de corriente entregados a través del electrodo de succión no provoquen una contracción muscular por la propagación de la corriente en el baño.
      1. Coloque el electrodo de succión cerca del músculo y tire del nervio hacia adentro. Mientras aumenta suavemente la intensidad de la corriente (a partir de 5 mA), estimule el músculo con una serie de pulsos individuales. El valor óptimo de corriente se determina cuando la fuerza de contracción es máxima.
      2. Empuje el nervio fuera del electrodo y administre unos pocos pulsos individuales. Asegúrese de que el músculo no se contraiga debido a la superposición con la estimulación de la membrana por medio de la solución. Vuelve a meter el nervio.
   2. Inicie el programa y seleccione el archivo de entrada para ejecutar el protocolo de prueba deseado.
      NOTA: El archivo de entrada incluye todos los parámetros de estimulación necesarios para ejecutar todo el protocolo. Aunque se utiliza la misma estructura de protocolo para los dos músculos, los parámetros de estimulación difieren según el protocolo, se refiere a los músculos sóleo o diafragma.
      1. Estimulación del nervio ciático sóleo (ver tabla 1)
         1. Utilice los siguientes anchos de pulso para todas las estimulaciones eléctricas: 1,4 ms para la estimulación del nervio ciático y 0,1 ms para la estimulación directa del sóleo. El protocolo completo tiene una duración aproximada de 65 min.
      2. Estimulación del nervio diafragma-frénico (ver Tabla 2)
         1. Utilice los siguientes anchos de pulso para todas las estimulaciones eléctricas: 1,8 ms para la estimulación del nervio frénico y 0,2 ms para la estimulación directa del diafragma. El protocolo completo tiene una duración aproximada de 55 min.
      3. Al final del protocolo experimental, mida la longitud y el peso húmedo del músculo utilizando un calibrador analógico con una precisión de 0,05 mm y una escala de precisión con una precisión de 0,1 mg, respectivamente.
         1. Calcule el área de la sección transversal (CSA) dividiendo la masa muscular por el producto de la longitud óptima de la fibra (L_f) y la densidad del músculo esquelético de los mamíferos (1.06 mg/mm³)¹⁶.
            NOTA: L_f se obtiene multiplicando L₀ por la relación entre la longitud de la fibra y la longitud del músculo (0,71 para el músculo sóleo¹⁶ y 1 para el músculo del diafragma¹⁷).

Tabla 1 - Protocolo de estimulación del nervio sóleo-ciático. La tabla enumera la secuencia de pruebas que forman el protocolo completo para evaluar las preparaciones del nervio ciático sóleo.

Tabla 2 - Protocolo de estimulación del nervio diafragma-frénico. La tabla enumera la secuencia de pruebas que forman el protocolo completo para probar las preparaciones del nervio diafragma-frénico.

3. Análisis de datos

NOTA: Al final del protocolo, calcule todos los parámetros deseados de la siguiente manera.

1. A partir de la estimulación de un solo pulso
   1. Calcule la fuerza de contracción (mN; fuerza activa máxima generada durante la contracción) y la fuerza de contracción específica (mN/mm²). Se calcula restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza de contracción específica como la fuerza de contracción dividida por el CSA muscular.
   2. Calcule el tiempo hasta la tensión máxima (TTP) (ms) como el tiempo desde la liberación del pulso hasta la fuerza de contracción.
   3. Calcule el tiempo de relajación medio (1/2RT) (ms) como el tiempo desde la fuerza de contracción hasta el 50% de la fuerza de contracción.
   4. Calcule dF/dt (mN/ms) como el valor máximo de la derivada de fuerza durante la fase contráctil.
   5. Calcule -dF/dt (mN/ms) como el valor máximo de la derivada de fuerza durante la fase de relajación.
2. De las estimulaciones del tren de pulsos
   1. Calcule la fuerza no fusionada (mN) y la fuerza específica no fusionada (mN/mm²). Se calcula restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza no fusionada específica como la fuerza no fusionada dividida por el músculo CSA.
      NOTA: La fuerza no fusionada es la fuerza activa máxima generada durante un tren de pulsos con una frecuencia inferior a la frecuencia tetánica.
   2. Calcule la fuerza tetánica (mN) y la fuerza tetánica específica (mN/mm2); la fuerza máxima es la fuerza activa máxima generada durante un tren de pulsos administrado a frecuencia tetánica. Se calcula restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcula la fuerza tetánica específica como la fuerza tetánica dividida por el músculo CSA.
   3. Calcular la curva fuerza-frecuencia. Trace el valor de la fuerza (o fuerza específica) obtenida para cada estimulación en comparación con la frecuencia creciente de la estimulación. Por lo general, comienza con la estimulación de pulso único y termina con la frecuencia tetánica.
3. De los paradigmas de la fatiga
   1. Calcule la falla de neurotransmisión (NF) como:
      
      donde MF es la disminución de la fuerza después de la estimulación muscular y F es la disminución de la fuerza después de la estimulación nerviosa, medida en el primer tren de pulso después de la estimulación muscular.
   2. Calcule la fatiga intratética (IF) como:
      
      donde F_lp es la fuerza generada por el músculo en el último pulso de estimulación, y F_m es la fuerza máxima generada por el músculo durante el mismo tren de pulsos. En cuanto a la estimulación nerviosa, calcular la fatiga intratética en el primer tren de pulsos inmediatamente después de la estimulación directa.

4. Análisis estadístico

NOTA: Los modelos de análisis estadístico deben elegirse de acuerdo con si la respuesta muscular a las estimulaciones nerviosas y de membrana se compara dentro del mismo modelo animal o entre 2 modelos animales diferentes^18,19.

1. Utilice la prueba t de Student para TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt si compara solo las respuestas musculares a las estimulaciones directas e indirectas. Si se comparan preparaciones musculares obtenidas de 2 cepas de ratón diferentes, utilice el ANOVA de 2 vías con el tipo de estimulación y la deformación del ratón como factores fijos. Cuando el ANOVA de 2 factores arroje un resultado significativo, utilice varias pruebas de comparación para buscar diferencias estadísticas.
2. Para la curva fuerza-frecuencia (si se comparan solo las respuestas musculares con las estimulaciones directas e indirectas), utilice el ANOVA de 2 vías con el tipo de estimulación y la frecuencia de la estimulación como factores fijos. Utilice varias pruebas de comparación si es necesario.
   1. Si compara preparaciones musculares obtenidas de 2 cepas diferentes de ratón, utilice el ANOVA de 3 vías con el tipo de estimulación, la frecuencia de estimulación y la deformación del ratón como factores fijos.
      1. Cuando el ANOVA de 3 vías produce un efecto significativo de los factores cepa animal y tipo de estimulación, utilice el ANOVA de 2 vías para identificar diferencias significativas entre 2 grupos a la vez. Por ejemplo, se pueden evaluar las diferencias entre la respuesta muscular de los 2 grupos a la estimulación de membrana, o entre la respuesta muscular a las estimulaciones directas e indirectas dentro de un grupo.
3. Fatiga intratrática
   NOTA: Dado que el protocolo fue diseñado para inducir fatiga en respuesta a la estimulación nerviosa incluso en ratones de control, este parámetro solo se puede usar para investigar las diferencias entre 2 cepas de ratones, y un análisis estadístico dentro de un solo grupo siempre arrojaría diferencias significativas.
   1. Para comparar dos grupos, utilice el ANOVA de 3 vías con el tipo de estimulación, el tiempo y la tensión del ratón como factores fijos. Cuando el ANOVA de 3 vías produce un efecto significativo de los factores cepa animal y tipo de estimulación, utilice el ANOVA de 2 vías para identificar diferencias significativas entre 2 grupos a la vez, como para la curva fuerza-frecuencia.
4. Para el fallo de la neurotransmisión, utilice el ANOVA de 2 vías con la deformación animal y el tiempo como factores fijos. Si devuelve resultados significativos, utilice varias pruebas de comparación para buscar diferencias estadísticas.
   NOTA: Dado que este parámetro solo devuelve un valor para cada cepa de ratón, permite comparar diferentes modelos de ratón.
5. Para el peso, la longitud y el CSA de los músculos, utilice la prueba t de Student para investigar las diferencias al comparar las preparaciones de músculo-nervio de diferentes modelos animales.

El protocolo que se describe proporciona información sobre la denervación funcional en varias enfermedades neuromusculares o envejecimiento-sarcopenia. Este protocolo puede utilizarse para determinar si (y, en caso afirmativo, en qué nivel) alteraciones de la musculatura se deben a cambios selectivos que ocurren en el músculo sí mismo o en la transmisión neuromuscular. Los datos que se muestran a continuación son los resultados de un trabajo previo por nuestro grupo18, llevó a cabo en el modelo de ratón transgénico de SOD1G93A de esclerosis de lateral amiotrófica en la fase final de la enfermedad20. El ratón transgénico de SOD1G93A ubicuo overexpresses del mutante antioxidante enzima superóxido dismutasa 1 (SOD1). Figuras 3 y 4 muestran los valores de la fuerza tetánica para el nervio ciático soleus (izquierda) y para la preparación del nervio frénico-diafragma (derecha) y dF/dt. Estos resultados demuestran la capacidad de la técnica propuesta aquí para detectar los defectos funcionales en los músculos transgénicos relacionados con NMJ en contraposición a las estrictamente relacionadas con el músculo sí mismo. De hecho, para dF/dt y la fuerza tetánica, los músculos de soleus SOD1G93A muestran una disminución en la respuesta contráctil, en comparación con el músculo de control, directamente estimulado, y aparezca una nueva reducción al ser estimulados a través del nervio. Por el contrario, suaves se observaron alteraciones en estos dos parámetros cuando tiras de músculo diafragma fueron estimuladas a través de la membrana, mientras que se detectaron alteraciones significativas cuando se estimula el músculo del diafragma a través del nervio.

Figura 3 - Cinética contráctil. Media ± SEM de dF/dt para el sóleo (A) y diafragma (B) las preparaciones. Muestras de sóleo muestran una desaceleración significativa hacia abajo cuando estimula directamente (-27%) y otra disminución cuando estimulan a través del nervio (-58%). Muestras de diafragma muestran un retraso sólo cuando se estimula a través del nervio (-30%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 - Fuerza tetánica. Media ± SEM de tetánica fuerza específica para el sóleo (A) y diafragma (B) las preparaciones. Muestras de sóleo muestran una desaceleración significativa hacia abajo cuando estimula directamente (-26%) y otra disminución cuando estimulan a través del nervio (-50%). Muestras de diafragma muestran una disminución de la fuerza sólo cuando se estimula a través del nervio (-44%). Adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La evaluación de fatiga de intratetanic y fracaso de neurotransmisión permite parámetros específicos NMJ a medir. La figura 5 muestra los valores promedio de fatiga intratetanic (si) se mide en el paradigma de fatiga tetánica de los músculos sóleo (figura 5A) y tiras de diafragma (figura 5B). Como se informó en la sección de protocolo, el paradigma de fatiga que se aplicó fue desarrollado de tal manera al estrés aunque el NMJ no el músculo. Como resultado, el IF medido para la estimulación muscular directa nunca fue alterada. De hecho, el IF computada para la estimulación del nervio es el parámetro que debe ser considerado para las comparaciones entre las cepas de ratón diferente. Nuestros resultados muestran que el si fue significativamente menor en transgénico sóleo y músculos del diafragma que en las contrapartes de control. Esta diferencia fue mayor en el diafragma, en la que se detectó un defecto de músculos pequeños, y menor en el sóleo, en el que ya había medido daño muscular importante. Debe tenerse en cuenta que puesto que el músculo de soleus transgénicos fue dañado considerablemente, la evaluación de la NMJ sólo estaba correcta para hasta 8 minutos de estimulación, que es el tiempo que tarda para que músculo transgénico devolver el valor null de la fuerza al ser estimulados. Sóleo transgénico si valores después de 8 minutos de estimulación expresan básicamente ruido.

Figura 5 - Fatiga intratetanic. Intratetanic fatiga para el sóleo (A) y diafragma (B) los músculos muestra una disminución significativa en la funcionalidad NMJ transgénico. Los valores son promedio ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La figura 6 muestra el fracaso de la neurotransmisión en la frecuencia tetánica en el sóleo (figura 6A) y muestras de diafragma (Figura 6B). En consonancia con los resultados de la IF, ningún defecto en la neurotransmisión se detectó en el músculo sóleo, mientras que las muestras de músculo del diafragma muestran un aumento significativo en la fatigabilidad de la Unión neuromuscular.

Figura 6 -Neurotransmisión falta. Falta de neurotransmisión no mostró alteraciones en los músculos sóleo (A), mientras que destacó una disminución significativa en la funcionalidad de la NMJ de transgénicos tiras de membrana (B). Los valores son promedio ± SEM. adaptado de Rizzuto et al. 18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.