Artículo de método

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

DOI:

10.3791/55227

⸱

6 de agosto de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una evaluación funcional de la placa neuromuscular (NMJ) puede proporcionar información esencial sobre la comunicación entre el músculo y del nervio. Aquí se describe un protocolo para evaluar exhaustivamente el NMJ y músculo funcionalidad utilizando dos preparaciones diferentes músculo-nerviosa, es decir, sóleo-ciático y frénico-diafragma.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funcionalidad de la placa neuromuscular (NMJ) desempeña un papel fundamental al estudiar enfermedades en que la comunicación entre neurona motora y músculo se deteriora, como el envejecimiento y esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Aquí describimos un protocolo experimental que puede utilizarse para medir funcionalidad NMJ combinando dos tipos de estimulación eléctrica: dirigir la estimulación de la membrana muscular y la estimulación a través del nervio. La comparación de la respuesta del músculo a estos dos estímulos diferentes puede ayudar a definir, a nivel funcional, posibles alteraciones en el NMJ que conducen a deterioro funcional en el músculo.

Preparaciones dex vivo E son adecuadas para estudios bien controlados. Aquí describimos un protocolo intensivo para medir varios parámetros de funcionalidad NMJ para la preparación del nervio ciático en sóleo y para la preparación del nervio frénico-diafragma y músculo. El protocolo dura aproximadamente 60 minutos y se lleva a cabo ininterrumpidamente por medio de una medida software que mide las propiedades de la cinética de contracción, la relación de la frecuencia de la fuerza para estimulación de músculo y nervio y dos parámetros específicos a la funcionalidad de la NMJ, es decir falta de neurotransmisión y fatiga intratetanic. Esta metodología fue utilizada para detectar daños en preparaciones de nervio Músculo sóleo y el diafragma mediante el uso de ratón transgénico de SOD1G93A , un modelo experimental de esclerosis lateral amiotrófica que ubicuo overexpresses del mutante antioxidante enzima superóxido dismutasa 1 (SOD1).

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Unión neuromuscular (NMJ) es una sinapsis química formada por la conexión entre la placa motora de la fibra muscular y el axón de la neurona motora terminal. El NMJ ha demostrado jugar un papel crucial cuando la comunicación entre el músculo y el nervio se deteriora, como ocurre en el envejecimiento o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Como músculo y del nervio se comunican en forma bidireccional1,2, pudiendo medir NMJ defectos por separado de defectos músculo puede proporcionar nuevas perspectivas sobre su interrelación fisiopatológica. De hecho, esta evaluación funcional puede ayudar a evaluar si alteraciones morfológicas o bioquímicas reducen la funcionalidad de señalización de la neurotransmisión.

La comparación de la respuesta contráctil muscular provocada por estimulación del nervio y la respuesta del músculo mismo evocado por estimulación directa de su membrana se ha propuesto como una medida indirecta de la funcionalidad de la NMJ. De hecho, desde membrana estímulo por pases neurotransmisión señalización, cualquier diferencia en las dos respuestas contráctiles puede atribuirse a los cambios en el NMJ. Este enfoque ha sido ampliamente propuesto para las ratas3,4,5,6,7y también se utiliza para recopilar información sobre los modelos de ratón8,9,10,11,12.

Aquí, describimos en detalle un procedimiento para suprimir dos preparaciones de músculo-nerviosa, e. i. los preparativos sóleo-ciático y frénico-diafragma. Mediante una medida software, diseñamos un protocolo de pruebas continuado que combina la medición de varios parámetros que caracterizan la funcionalidad de NMJ y músculo, lo que rinde una evaluación comprensiva del daño NMJ por separado del músculo. En particular, el protocolo mide la fuerza de contracción, la cinética muscular, la curva de frecuencia de la fuerza directa y estímulos del nervio, la neurotransmisión falta13 para un disparo y las frecuencias tetánicas y la fatiga intratetanic7.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Unidad de Histología y Embriología Médica de la Universidad La Sapienza de Roma y se realizaron de acuerdo con la versión actual de la Ley Italiana sobre la Protección de los Animales.

1. Configuración experimental

  1. Puesta en marcha del sistema experimental compuesto por 1 actuador/transductor, 2 estimuladores, 1 aparato muscular in vitro, 1 baño de tejido preparatorio, 1 electrodo de aspiración, 1 osciloscopio digital, 1 microscopio estereoscópico, 1 iluminador de luz fría, 1 placa de adquisición, 1 bloque conector y un ordenador personal
    NOTA: Aquí el software de comando fue programado en LabView y fue diseñado para garantizar una alta flexibilidad, precisión y repetibilidad de las estimulaciones. Para cada estimulación, el usuario puede seleccionar el ancho de pulso, la frecuencia, la duración y decidir si se administra a la membrana o a través del nervio. El usuario también puede seleccionar la duración del período de descanso antes de cada estimulación.

2. Evaluaciones de las propiedades contráctiles NMJ de los músculos del sóleo y el diafragma

  1. Calentamiento del sistema
    1. Prepare el tampón Krebs Ringer14 y colóquelo en un baño del aparato de montaje y el baño de tejido preparatorio. Coloque un plato de 60 mm preparado con 4 ml de silicona en el baño de pañuelos preparatorio.
    2. Abra el baño de agua circulante y ajuste la temperatura a 30 °C para el músculo sóleo y a 27 °C para el músculo diafragma.
    3. Permita que la mezcla de 95% de O2 - 5% de CO2 fluya en ambos baños.
    4. Encienda el actuador/transductor y los dos estimuladores de impulsos y ajuste los valores de corriente a 300 mA para la estimulación de membrana y a 5 mA para la estimulación nerviosa.
      NOTA: Se ha demostrado previamente que el valor de corriente de 300 mA no induce ninguna contracción significativa en las ramas nerviosas cuando se añade D-tubocurarina a la solución15. El valor de corriente de 5 mA corresponde a la cantidad de corriente requerida para estimular el músculo a través del nervio sin crear una superposición con la estimulación de la membrana inducida por medio de la solución. Dado que la distancia entre el electrodo de succión y el músculo depende de la longitud del nervio, este valor de corriente debe ajustarse cuidadosamente antes de cada experimento, como se describe a continuación.
  2. Disección de sóleo y diafragma
    1. Sacrifique al ratón por dislocación cervical para minimizar el sufrimiento, e inmediatamente extirpe los músculos para realizar la prueba de la siguiente manera.
    2. Preparación, disección y montaje sóleo-ciático
      1. Rocíe etanol al 70% en la pata del ratón y retire la piel que cubre la pierna. Haga una incisión en la parte superior de la pierna con unas tijeras y luego tire de la piel con firmeza. Aísla el tendón de Aquiles de la tibia y luego corta el tendón de Aquiles con unas tijeras.
      2. Sujete firmemente el tendón con un par de pinzas y tire suavemente del músculo gastrocnemio junto con el sóleo. Una vez que el tendón proximal del sóleo esté expuesto, corte toda la pantorrilla con unas tijeras mientras aún sostiene el tendón de Aquiles. Coloque inmediatamente la muestra de tejido en el baño de tejido preparatorio.
      3. Coloque el baño preparatorio bajo el microscopio estereoscópico y fije la pantorrilla a la placa de silicona con clavijas de acero inoxidable de 0,20 mm de diámetro. Con un par de pinzas, sujete el tendón proximal del sóleo y tire suavemente de él para exponer la inervación ciática.
      4. Una vez expuesta la inervación (Figura 1), retire con cuidado el tejido circundante para exponer unos 5 mm del nervio. Usa unas tijeras finas para cortar el nervio. Mientras sujeta firmemente el sóleo en el tendón proximal con un par de pinzas, tire de él nuevamente y excíralo cortando el tendón de Aquiles con unas tijeras.
      5. Pase un cable de nailon a través del orificio del brazo de palanca del actuador/transductor. Cree una soga en el extremo del alambre y agarre el tendón de Aquiles antes de tirar del cable hacia atrás hasta que el músculo llegue al baño del aparato de montaje. Sujete el tendón proximal dentro de la abrazadera fija y ate el alambre de nailon alrededor del brazo de la palanca. Permita que el músculo se equilibre en la solución.
      6. Determine la longitud óptima inicial (L0).
        1. Primero, estire el músculo para precargarlo a 10 mN (este valor garantiza la fuerza de contracción máxima (según la experiencia)). A continuación, estira suavemente el músculo para cambiar la precarga y estimularlo con una serie de pulsos individuales. La longitud óptima se alcanza cuando se mide la fuerza de contracción máxima.
    3. Preparación, disección y montaje del diafragma y el frénico
      1. Rocíe etanol al 70% sobre la piel del ratón. Retire la piel que cubre el músculo del diafragma haciendo una incisión sobre el esternón con unas tijeras y tirando de la piel con firmeza.
      2. Con unas tijeras, corte el abdomen horizontalmente por debajo del esternón y retire suavemente el intestino y los órganos con un par de pinzas. Usa un par de tijeras gruesas para cortar el lomo.
      3. Corta las costillas aproximadamente 1 cm sobre el esternón y procede horizontalmente. Retire suavemente los órganos externos con un par de pinzas y corte la columna vertebral para obtener un anillo circular de costillas que contenga el diafragma.
      4. Lave la preparación en un plato que contenga el tampón Krebs Ringer y luego colóquelo en el plato de silicona dentro del baño de pañuelos preparatorio, con la parte superior hacia arriba y el esternón hacia adelante.
      5. Usando el microscopio estereoscópico, extraiga cuidadosamente los pulmones y los órganos restantes; el nervio frénico será visible en el lado derecho (Figura 2A).
      6. Recorta las costillas para dejar un anillo de unos 2 mm a lo largo del diafragma.
        7. Con ayuda de
      7. pinzas, fije un pasador de acero inoxidable de 0,20 mm de diámetro en el tendón central del diafragma en el punto correspondiente a la inervación del nervio frénico, y otro clavo en las costillas del mismo eje para identificar la tira de diafragma de interés.
      8. Fije dos clavijas adicionales en el tendón central y otras dos clavijas en las nervaduras a cada lado de la tira seleccionada para colocar el diafragma. Si es necesario, limpie el nervio frénico del tejido conectivo circundante con fórceps.
      9. Con una cuchilla curva, corte el diafragma a ambos lados de la inervación para identificar una tira de tendón-músculo-costilla como se muestra en Figura 2B.
      10. Pase un cable de nailon a través del orificio del brazo de palanca del actuador/transductor. Cree una soga en el extremo del cable y agarre el tendón antes de tirar del cable hacia atrás hasta que el músculo llegue al baño del aparato de montaje.
      11. Sujete las costillas dentro de la abrazadera fija y ate el alambre de nailon alrededor del brazo de la palanca.
      12. Permita que el músculo se equilibre en la solución y determine la longitud óptima inicial (L0).
        1. Estire el músculo para precargarlo a 5 mN. Estirar suavemente el músculo para cambiar la precarga y estimularlo con una serie de pulsaciones individuales. La longitud óptima se alcanza cuando se mide la fuerza de contracción máxima.

figure-protocol-1
Figura 1 - Preparación del nervio sóleo-ciático. Nervio sóleo-ciático durante la intervención quirúrgica para las pruebas funcionales. La ciática se expone con un par de pinzas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-2
Figura 2 - Preparación del nervio diafragma-frénico. La imagen muestra una fase de la escisión de la preparación del nervio diafragma-frénico (A) y la tira que se montará para las pruebas funcionales (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Medición de las propiedades de la NMJ por separado de la contractilidad muscular
    1. Establezca la mejor intensidad de corriente para la estimulación a través del nervio y verifique que los impulsos de corriente entregados a través del electrodo de succión no provoquen una contracción muscular por la propagación de la corriente en el baño.
      1. Coloque el electrodo de succión cerca del músculo y tire del nervio hacia adentro. Mientras aumenta suavemente la intensidad de la corriente (a partir de 5 mA), estimule el músculo con una serie de pulsos individuales. El valor óptimo de corriente se determina cuando la fuerza de contracción es máxima.
      2. Empuje el nervio fuera del electrodo y administre unos pocos pulsos individuales. Asegúrese de que el músculo no se contraiga debido a la superposición con la estimulación de la membrana por medio de la solución. Vuelve a meter el nervio.
    2. Inicie el programa y seleccione el archivo de entrada para ejecutar el protocolo de prueba deseado.
      NOTA: El archivo de entrada incluye todos los parámetros de estimulación necesarios para ejecutar todo el protocolo. Aunque se utiliza la misma estructura de protocolo para los dos músculos, los parámetros de estimulación difieren según el protocolo, se refiere a los músculos sóleo o diafragma.
      1. Estimulación del nervio ciático sóleo (ver tabla 1)
        1. Utilice los siguientes anchos de pulso para todas las estimulaciones eléctricas: 1,4 ms para la estimulación del nervio ciático y 0,1 ms para la estimulación directa del sóleo. El protocolo completo tiene una duración aproximada de 65 min.
      2. Estimulación del nervio diafragma-frénico (ver Tabla 2)
        1. Utilice los siguientes anchos de pulso para todas las estimulaciones eléctricas: 1,8 ms para la estimulación del nervio frénico y 0,2 ms para la estimulación directa del diafragma. El protocolo completo tiene una duración aproximada de 55 min.
      3. Al final del protocolo experimental, mida la longitud y el peso húmedo del músculo utilizando un calibrador analógico con una precisión de 0,05 mm y una escala de precisión con una precisión de 0,1 mg, respectivamente.
        1. Calcule el área de la sección transversal (CSA) dividiendo la masa muscular por el producto de la longitud óptima de la fibra (Lf) y la densidad del músculo esquelético de los mamíferos (1.06 mg/mm3)16.
          NOTA: Lf se obtiene multiplicando L0 por la relación entre la longitud de la fibra y la longitud del músculo (0,71 para el músculo sóleo16 y 1 para el músculo del diafragma17).
Tipo de experimentofrecuenciaduraciónRepeticionesEstimulación muscular o nerviosapropósito
(Hz)(s)
ticPulso único1músculoFuerza y cinética de contracción
reposo30
ticPulso único1nervio
reposo30
ticPulso único1músculo
reposo30
ticPulso único1nervio
reposo120
Tétanos no fusionado400.81nervioCurvas de fuerza/frecuencia para estimulaciones nerviosas y musculares
reposo180
Tétanos no fusionado600.81músculo
reposo180
Tétanos fusionado800.81nervio
reposo180
Tétanos no fusionado200.81músculo
reposo180
Tétanos no fusionado600.81nervio
reposo180
Tétanos fusionado800.81músculo
reposo180
Tétanos no fusionado200.81nervio
reposo180
Tétanos no fusionado400.81músculo
reposo300
Paradigma de la fatiga350.81 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de descanso de 1,2 s cada una, repetidas 20 vecesFallo de la neurotransmisión (NF)
reposo900
Paradigma de la fatiga800.81 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de descanso de 1,2 s cada una, repetidas 20 vecesFallo de neurotransmisión (NF) y fatiga intratetánica (IF)

Tabla 1 - Protocolo de estimulación del nervio sóleo-ciático. La tabla enumera la secuencia de pruebas que forman el protocolo completo para evaluar las preparaciones del nervio ciático sóleo.

Tipo de experimentofrecuenciaduraciónRepeticionesEstimulación muscular o nerviosapropósito
(Hz)(s)
ticPulso único1músculoFuerza y cinética de contracción
reposo30
ticPulso único1nervio
reposo30
ticPulso único1músculo
reposo30
ticPulso único1nervio
reposo120
Tétanos no fusionado600.51nervioCurvas de fuerza/frecuencia para estimulaciones nerviosas y musculares
reposo120
Tétanos fusionado1000.51músculo
reposo180
Tétanos no fusionado400.51nervio
reposo120
Tétanos no fusionado200.51músculo
reposo120
Tétanos no fusionado800.51nervio
reposo150
Tétanos no fusionado800.51músculo
reposo150
Tétanos no fusionado200.51nervio
reposo120
Tétanos fusionado1000.51músculo
reposo150
Tétanos fusionado1000.51nervio
reposo180
Tétanos no fusionado600.51músculo
reposo300
Paradigma de la fatiga350.331 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de reposo de 0,67 s cada una, repetidas 20 vecesFallo de la neurotransmisión (NF)
reposo900
Paradigma de la fatiga800.331 estimulación muscular seguida de 14 estimulaciones nerviosas con un tiempo de reposo de 0,67 s cada una, repetidas 20 vecesFallo de neurotransmisión (NF) y fatiga intratetánica (IF)

Tabla 2 - Protocolo de estimulación del nervio diafragma-frénico. La tabla enumera la secuencia de pruebas que forman el protocolo completo para probar las preparaciones del nervio diafragma-frénico.

3. Análisis de datos

NOTA: Al final del protocolo, calcule todos los parámetros deseados de la siguiente manera.

  1. A partir de la estimulación de un solo pulso
    1. Calcule la fuerza de contracción (mN; fuerza activa máxima generada durante la contracción) y la fuerza de contracción específica (mN/mm2). Se calcula restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza de contracción específica como la fuerza de contracción dividida por el CSA muscular.
    2. Calcule el tiempo hasta la tensión máxima (TTP) (ms) como el tiempo desde la liberación del pulso hasta la fuerza de contracción.
    3. Calcule el tiempo de relajación medio (1/2RT) (ms) como el tiempo desde la fuerza de contracción hasta el 50% de la fuerza de contracción.
    4. Calcule dF/dt (mN/ms) como el valor máximo de la derivada de fuerza durante la fase contráctil.
    5. Calcule -dF/dt (mN/ms) como el valor máximo de la derivada de fuerza durante la fase de relajación.
  2. De las estimulaciones del tren de pulsos
    1. Calcule la fuerza no fusionada (mN) y la fuerza específica no fusionada (mN/mm2). Se calcula restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcule la fuerza no fusionada específica como la fuerza no fusionada dividida por el músculo CSA.
      NOTA: La fuerza no fusionada es la fuerza activa máxima generada durante un tren de pulsos con una frecuencia inferior a la frecuencia tetánica.
    2. Calcule la fuerza tetánica (mN) y la fuerza tetánica específica (mN/mm2); la fuerza máxima es la fuerza activa máxima generada durante un tren de pulsos administrado a frecuencia tetánica. Se calcula restando el valor inicial de la precarga a la fuerza máxima generada por el músculo. Calcula la fuerza tetánica específica como la fuerza tetánica dividida por el músculo CSA.
    3. Calcular la curva fuerza-frecuencia. Trace el valor de la fuerza (o fuerza específica) obtenida para cada estimulación en comparación con la frecuencia creciente de la estimulación. Por lo general, comienza con la estimulación de pulso único y termina con la frecuencia tetánica.
  3. De los paradigmas de la fatiga
    1. Calcule la falla de neurotransmisión (NF) como:
      figure-protocol-3
      donde MF es la disminución de la fuerza después de la estimulación muscular y F es la disminución de la fuerza después de la estimulación nerviosa, medida en el primer tren de pulso después de la estimulación muscular.
    2. Calcule la fatiga intratética (IF) como:
      figure-protocol-4
      donde Flp es la fuerza generada por el músculo en el último pulso de estimulación, y Fm es la fuerza máxima generada por el músculo durante el mismo tren de pulsos. En cuanto a la estimulación nerviosa, calcular la fatiga intratética en el primer tren de pulsos inmediatamente después de la estimulación directa.

4. Análisis estadístico

NOTA: Los modelos de análisis estadístico deben elegirse de acuerdo con si la respuesta muscular a las estimulaciones nerviosas y de membrana se compara dentro del mismo modelo animal o entre 2 modelos animales diferentes18,19.

  1. Utilice la prueba t de Student para TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt si compara solo las respuestas musculares a las estimulaciones directas e indirectas. Si se comparan preparaciones musculares obtenidas de 2 cepas de ratón diferentes, utilice el ANOVA de 2 vías con el tipo de estimulación y la deformación del ratón como factores fijos. Cuando el ANOVA de 2 factores arroje un resultado significativo, utilice varias pruebas de comparación para buscar diferencias estadísticas.
  2. Para la curva fuerza-frecuencia (si se comparan solo las respuestas musculares con las estimulaciones directas e indirectas), utilice el ANOVA de 2 vías con el tipo de estimulación y la frecuencia de la estimulación como factores fijos. Utilice varias pruebas de comparación si es necesario.
    1. Si compara preparaciones musculares obtenidas de 2 cepas diferentes de ratón, utilice el ANOVA de 3 vías con el tipo de estimulación, la frecuencia de estimulación y la deformación del ratón como factores fijos.
      1. Cuando el ANOVA de 3 vías produce un efecto significativo de los factores cepa animal y tipo de estimulación, utilice el ANOVA de 2 vías para identificar diferencias significativas entre 2 grupos a la vez. Por ejemplo, se pueden evaluar las diferencias entre la respuesta muscular de los 2 grupos a la estimulación de membrana, o entre la respuesta muscular a las estimulaciones directas e indirectas dentro de un grupo.
  3. Fatiga intratrática
    NOTA: Dado que el protocolo fue diseñado para inducir fatiga en respuesta a la estimulación nerviosa incluso en ratones de control, este parámetro solo se puede usar para investigar las diferencias entre 2 cepas de ratones, y un análisis estadístico dentro de un solo grupo siempre arrojaría diferencias significativas.
    1. Para comparar dos grupos, utilice el ANOVA de 3 vías con el tipo de estimulación, el tiempo y la tensión del ratón como factores fijos. Cuando el ANOVA de 3 vías produce un efecto significativo de los factores cepa animal y tipo de estimulación, utilice el ANOVA de 2 vías para identificar diferencias significativas entre 2 grupos a la vez, como para la curva fuerza-frecuencia.
  4. Para el fallo de la neurotransmisión, utilice el ANOVA de 2 vías con la deformación animal y el tiempo como factores fijos. Si devuelve resultados significativos, utilice varias pruebas de comparación para buscar diferencias estadísticas.
    NOTA: Dado que este parámetro solo devuelve un valor para cada cepa de ratón, permite comparar diferentes modelos de ratón.
  5. Para el peso, la longitud y el CSA de los músculos, utilice la prueba t de Student para investigar las diferencias al comparar las preparaciones de músculo-nervio de diferentes modelos animales.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo que se describe proporciona información sobre la denervación funcional en varias enfermedades neuromusculares o envejecimiento-sarcopenia. Este protocolo puede utilizarse para determinar si (y, en caso afirmativo, en qué nivel) alteraciones de la musculatura se deben a cambios selectivos que ocurren en el músculo sí mismo o en la transmisión neuromuscular. Los datos que se muestran a continuación son los resultados de un trabajo previo por nuestro grupo18

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo experimental descrito proporciona una manera ideal de medir y discriminar alteraciones funcionales que se han producido directamente en el músculo o indirectamente en el nivel de placa neuromuscular. Puesto que esta técnica se basa en una medición indirecta de la funcionalidad de la NMJ, no puede utilizarse para establecer si un defecto está relacionado con cambios morfológicos o a cambios bioquímicos. Por el contrario, proporciona una manera eficaz de determinar si las alteraciones morfológicas o bioquímica...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trabajo en laboratorio de los autores fue apoyada por Fondazione Roma y Teletón (no de la concesión. GGP14066).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema de palanca de modo dual Aurora Científica Inc.300Bactuador/transductor
Estimulador bifásico de alta potencia Aurora Científica Inc.701B(nervio)
Estimulador bifásico de alta potencia Aurora Científica Inc.701Cestimulador de pulso (músculo)
Aparato muscular in vitro Aurora Científica Inc.800A
Baño de tejido preparatorioRadnoti158400
Electrodo de succión monopolarA-M Systems573000con una referencia casera 
Osciloscopio TektronixTDS2014
Microscopio estereoscópicoNikonSMZ 800
Iluminador de luz fría Photonic OpticsPL 3000
Placa de adquisiciónNational InstrumentsNI PCIe-6353
Bloque de conectoresNational InstrumentsNI 2110
Ordenador personalAMD Phenom II x4 970Procesador 3.50 Ghz con Windows 7
Software LabView 2012National Instruments
Krebs-Ringer Bicarbonato Búfer Sigma-AldrichK4002 tampón fisiológico
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761 
Cloruro de calcio CaCl2Sigma-AldrichC4901anhidro, polvo, ≥ 97%
Tampón HEPESSigma-AldrichH3375≥ 99.5% (titulación)
Platos 60mm x 15mmFalcon353004Poliestireno
SiliconaSylgard 184 Silicona Kit de elastómeros  0.5Kg.
TermostatoDennerleDigitalDuomat 1200
BombaNewa MiniMN 606para acuario
Resistencia al calor ThermocableLucky Reptile61403-150/60Hz 50W
Cubocualquiera 10 litrosPolipropileno
O2 + 5%CO2siadMezcla de gas
#5 Pinzas Fine Science Tools11252-202 unidades
Tijeras de resorte - 8 mm CuchillasFine Science Tools15024-10escisión de nervios
Tijeras afiladas Herramientas de Bellas Ciencias 14059-11extirpación de músculo
Tijeras delicadasWagner02.06.32externo del animal
Mango de bisturí de estudiante #3Herramientas de ciencia fina 91003-12 
Hojas de bisturí # 10Herramientas de ciencia fina 10010-00
Hojas de bisturí #11Herramientas de ciencia fina 10011-00
alambre de nylon y Oslash; 0,16 mmcualquiera
Estimulador de pulso

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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