Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

Summary

Una evaluación funcional de la placa neuromuscular (NMJ) puede proporcionar información esencial sobre la comunicación entre el músculo y del nervio. Aquí se describe un protocolo para evaluar exhaustivamente el NMJ y músculo funcionalidad utilizando dos preparaciones diferentes músculo-nerviosa, es decir, sóleo-ciático y frénico-diafragma.

Abstract

Funcionalidad de la placa neuromuscular (NMJ) desempeña un papel fundamental al estudiar enfermedades en que la comunicación entre neurona motora y músculo se deteriora, como el envejecimiento y esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Aquí describimos un protocolo experimental que puede utilizarse para medir funcionalidad NMJ combinando dos tipos de estimulación eléctrica: dirigir la estimulación de la membrana muscular y la estimulación a través del nervio. La comparación de la respuesta del músculo a estos dos estímulos diferentes puede ayudar a definir, a nivel funcional, posibles alteraciones en el NMJ que conducen a deterioro funcional en el músculo.

Preparaciones dex vivo E son adecuadas para estudios bien controlados. Aquí describimos un protocolo intensivo para medir varios parámetros de funcionalidad NMJ para la preparación del nervio ciático en sóleo y para la preparación del nervio frénico-diafragma y músculo. El protocolo dura aproximadamente 60 minutos y se lleva a cabo ininterrumpidamente por medio de una medida software que mide las propiedades de la cinética de contracción, la relación de la frecuencia de la fuerza para estimulación de músculo y nervio y dos parámetros específicos a la funcionalidad de la NMJ, es decir falta de neurotransmisión y fatiga intratetanic. Esta metodología fue utilizada para detectar daños en preparaciones de nervio Músculo sóleo y el diafragma mediante el uso de ratón transgénico de SOD1^G93A , un modelo experimental de esclerosis lateral amiotrófica que ubicuo overexpresses del mutante antioxidante enzima superóxido dismutasa 1 (SOD1).

Introduction

La Unión neuromuscular (NMJ) es una sinapsis química formada por la conexión entre la placa motora de la fibra muscular y el axón de la neurona motora terminal. El NMJ ha demostrado jugar un papel crucial cuando la comunicación entre el músculo y el nervio se deteriora, como ocurre en el envejecimiento o la esclerosis lateral amiotrófica (ELA). Como músculo y del nervio se comunican en forma bidireccional^1,2, pudiendo medir NMJ defectos por separado de defectos músculo puede proporcionar nuevas perspectivas sobre su interrelación fisiopatológica. De hecho, esta evaluación funcional puede ayudar a evaluar si al....

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de ética de la Unidad de Histología y Embriología Médica de la Universidad La Sapienza de Roma y se realizaron de acuerdo con la versión actual de la Ley Italiana sobre la Protección de los Animales.

1. Configuración experimental

1. Puesta en marcha del sistema experimental compuesto por 1 actuador/transductor, 2 estimuladores, 1 aparato muscular in vitro, 1 baño de tejido preparatorio, 1 electrodo de aspiración, 1 osciloscopio digital, 1 microscopio estereoscópico, 1 iluminador de luz fría, 1 placa de adquisición, 1 bloque conector y un ordenador personal<....

Results

El protocolo que se describe proporciona información sobre la denervación funcional en varias enfermedades neuromusculares o envejecimiento-sarcopenia. Este protocolo puede utilizarse para determinar si (y, en caso afirmativo, en qué nivel) alteraciones de la musculatura se deben a cambios selectivos que ocurren en el músculo sí mismo o en la transmisión neuromuscular. Los datos que se muestran a continuación son los resultados de un trabajo previo por nuestro grupo¹⁸

Discussion

El protocolo experimental descrito proporciona una manera ideal de medir y discriminar alteraciones funcionales que se han producido directamente en el músculo o indirectamente en el nivel de placa neuromuscular. Puesto que esta técnica se basa en una medición indirecta de la funcionalidad de la NMJ, no puede utilizarse para establecer si un defecto está relacionado con cambios morfológicos o a cambios bioquímicos. Por el contrario, proporciona una manera eficaz de determinar si las alteraciones morfológicas o bioquímica.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema de palanca de modo dual	Aurora Científica Inc.	300B	actuador/transductor
Estimulador bifásico de alta potencia	Aurora Científica Inc.	701B	(nervio)
Estimulador bifásico de alta potencia	Aurora Científica Inc.	701C	estimulador de pulso (músculo)
Aparato muscular in vitro	Aurora Científica Inc.	800A
Baño de tejido preparatorio	Radnoti	158400
Electrodo de succión monopolar	A-M Systems	573000	con una referencia casera
Osciloscopio	Tektronix	TDS2014
Microscopio estereoscópico	Nikon	SMZ 800
Iluminador de luz fría	Photonic Optics	PL 3000
Placa de adquisición	National Instruments	NI PCIe-6353
Bloque de conectores	National Instruments	NI 2110
Ordenador personal	AMD Phenom II x4 970		Procesador 3.50 Ghz con Windows 7
Software LabView 2012	National Instruments
Krebs-Ringer Bicarbonato Búfer	Sigma-Aldrich	K4002	tampón fisiológico
Bicarbonato de sodio	Sigma-Aldrich	S5761
Cloruro de calcio CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901	anhidro, polvo, ≥ 97%
Tampón HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	≥ 99.5% (titulación)
Platos 60mm x 15mm	Falcon	353004	Poliestireno
Silicona	Sylgard	184 Silicona	Kit de elastómeros  0.5Kg.
Termostato	Dennerle	DigitalDuomat 1200
Bomba	Newa Mini	MN 606	para acuario
Resistencia al calor Thermocable	Lucky Reptile	61403-1	50/60Hz 50W
Cubo	cualquiera 10 litros		Polipropileno
O2 + 5%CO2	siad		Mezcla de gas
#5 Pinzas	Fine Science Tools	11252-20	2 unidades
Tijeras de resorte - 8 mm Cuchillas	Fine Science Tools	15024-10	escisión de nervios
Tijeras afiladas	Herramientas de Bellas Ciencias	14059-11	extirpación de músculo
Tijeras delicadas	Wagner	02.06.32	externo del animal
Mango de bisturí de estudiante #3	Herramientas de ciencia fina	91003-12
Hojas de bisturí # 10	Herramientas de ciencia fina	10010-00
Hojas de bisturí #11	Herramientas de ciencia fina	10011-00
alambre de nylon y Oslash; 0,16 mm	cualquiera