Se demuestran modelos de infección sistémica y localizada del pez cebra por el virus de la influenza A humana. Utilizando un modelo de infección sistémica, el pez cebra se puede utilizar para detectar medicamentos antivirales. Utilizando un modelo de infección localizada, el pez cebra puede utilizarse para caracterizar las respuestas de las células inmunitarias del huésped.
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Artículo de método
El uso de modelos de pez cebra de Infecciones por Virus de la Influenza Humana A a la pantalla medicamentos antivirales y caracterizar inmune del huésped respuestas de las células
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Resumen
Resumen
Cada año, los brotes de gripe estacional afectan profundamente a las sociedades de todo el mundo. A pesar de los esfuerzos mundiales, la gripe sigue siendo una carga sanitaria intratable. La principal estrategia para reducir las infecciones es la vacunación anual. En las personas que han contraído influenza, los medicamentos antivirales pueden mitigar los síntomas. Existe una necesidad clara e insatisfecha de desarrollar estrategias alternativas para combatir la gripe. Se han creado varios modelos animales para modelar las interacciones entre el huésped y la influenza. Aquí se describen los protocolos para generar modelos de pez cebra para la infección sistémica y localizada por el virus de la influenza humana A (IAV). Utilizando un modelo de infección sistémica por IAV, se pueden cribar moléculas pequeñas con potencial actividad antiviral. Como prueba de principio, se describe un protocolo que demuestra la eficacia del fármaco antiviral Zanamivir en el pez cebra infectado por IAV. Muestra cómo se pueden cuantificar los fenotipos de la enfermedad para determinar la eficacia relativa de los posibles antivirales en el pez cebra infectado por IAV. En los últimos años, ha habido un mayor aprecio por el papel fundamental que desempeñan los neutrófilos en la respuesta del huésped humano a la infección por gripe. El pez cebra ha demostrado ser un modelo indispensable para el estudio de la biología de los neutrófilos, con impactos directos en la medicina humana. Se describe un protocolo para generar una infección localizada por IAV en la línea de pez cebra Tg(mpx:mCherry) para estudiar la biología de los neutrófilos en el contexto de una infección viral localizada. El reclutamiento de neutrófilos a sitios de infección localizados proporciona un fenotipo cuantificable adicional para evaluar manipulaciones experimentales que pueden tener aplicaciones terapéuticas. Ambos protocolos de pez cebra descritos recapitulan fielmente aspectos de la infección por IAV humano. El modelo de pez cebra posee numerosas ventajas inherentes, incluida la alta fecundidad, la claridad óptica, la facilidad para el cribado de fármacos y la disponibilidad de líneas transgénicas, incluidas aquellas en las que las células inmunitarias como los neutrófilos están marcadas con proteínas fluorescentes. Los protocolos detallados aquí explotan estas ventajas y tienen el potencial de revelar información crítica sobre las interacciones entre el host y la IAV que, en última instancia, puede traducirse en la clínica.
Introducción
De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS), virus de la gripe infectan a un 5-10% de los adultos y un 20-30% de los niños al año y causan 3-5 millones de casos de enfermedades graves y hasta 500.000 muertes en todo el mundo 1. vacunas anuales contra la gripe siguen siendo la mejor opción para prevenir la enfermedad. Esfuerzos como el Plan de Acción Mundial de la OMS han aumentado el uso de la vacuna estacional, la capacidad de producción de vacunas, y la investigación y el desarrollo de estrategias de vacunas más potentes con el fin de reducir la morbilidad y la mortalidad asociadas con brotes de gripe estacional
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Protocolo
Todo el trabajo debe realizarse con nivel de bioseguridad 2 (o BSL2) normas descritas por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) y de conformidad con las directrices establecidas por Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comités (IACUC). Por favor, consultar con los funcionarios adecuados para garantizar la seguridad y el cumplimiento.
1. El pez cebra Cuidado y mantenimiento
- Desovar pez cebra y recoger el número necesario de embriones para los experimentos. Cuando sea necesario, los tanques de cría en masa, como los descritos por Adatto et al. 32, se puede emplear para recoger....
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Resultados
Aquí, se proporcionan datos que muestran cómo la infección sistémica IAV en el pez cebra se puede utilizar para probar la eficacia del fármaco (Figura 1A). Los embriones en 48 horas después de la fertilización se inyectan con APR8 (figuras 1C, 1F), X-31 (figuras 1D, 1G), o NS1-GFP (Figuras 1H-1i) a través del conducto de Cuvier para iniciar una infección viral. Otra cohorte de embriones en 48 horas después de la fertiliz.......
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Discusión
Para maximizar los beneficios obtenidos por el uso de un pequeño animal para modelar las interacciones huésped-patógeno humano, es importante formular preguntas e hipótesis de investigación prueba que aprovechan las ventajas inherentes del sistema modelo. Como modelo para la infección IAV humana, el pez cebra tiene varios puntos fuertes, incluyendo una alta fecundidad, la claridad óptica, receptividad en la detección de drogas, y la disponibilidad de líneas transgénicas que etiquetan las células inmunes como los neutróf.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Mark Nilan por el cuidado y mantenimiento del pez cebra y a Meghan Breitbach y Deborah Bouchard por propagar NS1-GFP y determinar los títulos de IAV. Esta investigación fue apoyada por la subvención de NIGMS, NIH P20GM103534 y la Estación Experimental Agrícola y Forestal de Maine (Publicación Número 3493).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Instant Ocean | Spectrum Brands | SS15-10 | |
| 100 mm x 25 mm placas de Petri desechables estériles | VWR | 89107-632 | |
| Pipetas de transferencia | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| Tricaine-S (MS-222) | |||
| con filamento | Instrumento Sutter | BF120-69-10 | |
| Extractor de micropipetas flameado/marrón | Instrumento Sutter | P-97 | |
| Agarosa | Lonza | 50004 | |
| Zanamivir | AK Scientific | G939 | |
| Dumont #5 pinzas | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 72700-D | |
| Puntas de microcargador | Eppendorf | 930001007 | |
| Aceite de inmersión para microscopio | Olympus | IMMOIL-F30CC | |
| Portaobjetos de calibración de la etapa del microscopio | Inyector de presión AmScope | MR095 | |
| MPPI-3 | Instrumentación | ||
| Aplicada Microscopio estereoscópico | Olympus | SZ61 | |
| Unidad de contrapresión | Instrumentación Científica Aplicada Kit de soporte de | BPU | |
| Instrumentación Científica Aplicada | MPIP | ||
| Interruptor de pie | Instrumentación Científica Aplicada | Micromanipulador FSW | |
| Instrumentación Científica Aplicada | MM33 | ||
| Base magnética | Instrumentación Científica Aplicada | Base Magnética Rojo | |
| de fenol | Sigma-Aldrich | P-4758 | |
| Incubadora de baja temperatura | VWR | 2020 | |
| SteREO Discovery.V12 | Zeiss | ||
| CL6000 LED | |||
| Placa multipocillo con fondo de cristal, 24 pocillos | Mattek | P24G-0-13-F | |
| Microscopio confocal | Olympus | IX-81 con sistema confocal de escaneo láser FV-1000 | |
| Río Charles | 490710 | ||
| Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2) | Río Charles | ||
| Influenza NS1-GFP | Referenciado en Manicassamy et al. 2010 | ||
| Tg(mpx:mCherry) | Referenciado en Lam et al. 2013 |
Referencias
- W.H.O. Influenza (Seasonal). , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs211/en/ (2014).
- W.H.O. W.H.O. Global Action Plan.. , Available from: http://www.who.int/influenza_vaccines_plan/en/ (2011).
- De Clercq, E. Antiviral agents active against influenza A viruses. Nat Rev Drug Discov
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