Los mutantes de deleción genética generados a través de la recombinación homóloga son el patrón oro para estudios de la función génica. Se describe el método OSCAR (construcción de un solo paso de Agrobacterium-recombinación-listo-plásmidos) para la generación rápida de construcciones de deleción. Sigue la transformación de hongos mediada por Agrobacterium. Finalmente, se presenta un método de confirmación basado en PCR de deleciones de genes en transformantes fúngicos.
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Artículo de método
Producción de eliminación rápida en hongos vía
En este artículo
Resumen
Resumen
La deleción precisa de los genes de interés, dejando el resto del genoma sin cambios, proporciona el producto ideal para determinar la función de ese gen particular en el organismo vivo. En este protocolo se describe el método OSCAR de construcción de plásmidos de deleción precisa y rápida. OSCAR se basa en el sistema de clonación en el que se lleva a cabo una única reacción de recombinasa que contiene los flancos 5 'y 3' amplificados por PCR purificados del gen de interés y dos plásmidos, pA-Hyg OSCAR (el vector marcador) y pOSCAR vector). La confirmación del vector de deleción correctamente ensamblado se lleva a cabo por mapeo de digestión de restricción seguido por secuenciación. Agrobacterium tumefaciens se utiliza entonces para mediar la introducción de la construcción de deleción en esporas de hongos (denominado ATMT). Por último, se describe un ensayo de PCR para determinar si la construcción de deleción se integra mediante recombinación homóloga o no homóloga, indicando deleción de gen oEctópica, respectivamente. Este enfoque se ha utilizado con éxito para la deleción de numerosos genes en Verticillium dahliae y en Fusarium verticillioides entre otras especies.
Introducción
La disección genética es una poderosa metodología para determinar la importancia funcional de individuos o combinaciones de genes. Un enfoque estándar para comprender el papel de genes específicos es la producción de mutantes de un solo gen inalterados en cualquier otro gen. El enfoque más potente y menos potencialmente confuso es la supresión completa y precisa del marco de lectura abierto de un gen de interés (GOI ORF) sin dañar ninguna otra función génica.
Debido a que los enfoques de ligación estándar para la generación de plásmidos de deleción requieren múltiples etapas, el racional para OSCAR 1 era producir u....
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Protocolo
1. Diseño del cebador para la amplificación por PCR de los flancos génicos
- Descargar a un archivo de procesamiento de texto la región genómica del gen de interés (GOI) incluyendo el marco de lectura abierto (ORF) y al menos 2 kb que flanquean el gen en cada lado de FungiDB u otro recurso de datos genómicos.
- Resalte el ORF destinado a la deleción y los codones de inicio y fin de la etiqueta.
- Identificar y resaltar ORFs adyacentes dentro de la secuencia descargada.
- Utilice el extremo 5 'de 2 kb del ORF de GOI y la herramienta de diseño de cebadores (ver Lista de Materiales) para diseñar el par de cebadores de PCR O1 ....
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Resultados
El método OSCAR, en una única reacción, genera un plásmido que contiene los flancos del gen diana que se ha de deletar rodeando el casete marcador seleccionable. La producción de construcciones de deleción usando OSCAR es muy eficiente. Sin embargo, el sistema puede producir construcciones parciales que contienen algunos pero no todos los tres fragmentos (los dos flancos del gen y el marcador seleccionable). Generalmente, la mayoría de los transformantes de E. coli contienen la .......
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Discusión
La construcción en un solo paso de los plásmidos preparados con recombinación de Agrobacterium (OSCAR) se ha empleado con éxito con un número cada vez mayor de hongos Ascomycota. El método también debe ser fácilmente aplicable a Basidiomycota y especies de otros phylas de hongos (con promotores apropiados que conducen genes marcadores seleccionables), suponiendo que la transformación mediada por Agrobacterium y la recombinación homóloga son posibles. Se han generado vectores marcadore.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los siguientes estudiantes de pregrado y secundaria su trabajo para generar mutantes OSCAR en Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie y Manny Hernández Ashly Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, María Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| FungiDB | / http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer diseño de software en línea/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Manipulación de archivos de secuencia | ||
| Low Na LB Spec 100 medio | E. coli selección de transformantes, composición: 1% triptona, 0,05% NaCl, 0,5% extracto de levadura, 1,5% agar si es para medio sólido | ||
| de cocultivo | Inducción de transformación ATMT (Referencia 12) | ||
| Aspergillus medio mínimo con higromicina | Selección de transformadores fúngicos | ||
| Medio PDA | Acumedia | 7149A | Tubos inclinados de |
| esporas simplesMedio PDA-Hyg-Kan | Aislamiento de ransformante fúngico, PDA que contiene 150 μ g/mL de higromicina B y 100 μ g/mL Kanamicina | ||
| Perlas de vidrio | Genlantis | C400100 | Esparcimiento de placas |
| Filtros de nitrocelulosa (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-cultivo para ATMT |
| Varios tubos de centífugos | preparaciones múltiples | ||
| Placas de Petri (varios) | Cultivo de bacterias y hongos | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Vector marcador seleccionable |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Vector de ensamblaje |
| DH5α Un disparo competente E. coli | em Life Technologies | 12297-016 | Transformación de la reacción de BP |
| ccdB supervivencia Células de E. coli | Life Technologies | A10460 | Mantenimiento de pOSCAR |
| Varillas de transferencia de madera | Rayado de colonias | ||
| Palillos de dientes | Selección de colonias | ||
| Microcentrífuga | Peletización Bacterias, etc. | ||
| Centrífuga | Recolección de esporas fúngicas | ||
| Microscopio | Individual aislamiento de esporas | ||
| Contador de células automatizado Cálculo | suspensión de esporas | ||
| Microscopio | Hemocitómetro Recuento de células | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gen flanco purificación de productos |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polimerasa para la generación de flanco OSCAR |
| Higromicina B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Espectinomicina | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxima | TCI América | C2224 | |
| Kanamicina | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Geles de agarosa post-tinción |
| Qiagen QIAquick PCR Kit (Cat. Nº 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R o One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R de Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific C862003 | ||
| Gateway BP Clonasa II Mezcla de enzimas | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Se utiliza para ensamblar la construcción de deleción en pOSAR |
Referencias
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, ....
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Reimpresiones y permisos
