Hallazgos recientes sugieren que los motores flagelares bacterianos detectan una variedad de señales ambientales y se remodelan en respuesta. Se espera que los ensayos de perlas discutidos aquí ayuden a explicar el papel de la remodelación en la adaptación celular a los factores estresantes ambientales.
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Artículo de método
Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar
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Resumen
Resumen
El papel de los motores flagelares en la motilidad y la quimiotaxis bacteriana es bien conocido. Descubrimientos recientes sugieren que los motores flagelares son capaces de remodelarse en respuesta a una variedad de estímulos ambientales y se encuentran entre los desencadenantes de la colonización de la superficie y las infecciones. Los mecanismos precisos por los cuales los motores se remodelan y promueven la adaptación celular probablemente dependan de los atributos motores clave. La técnica de seguimiento de cuentas basada en fotomultiplicadores que se presenta aquí permite una caracterización biofísica precisa de las funciones motoras, incluidas las adaptaciones en las velocidades del motor y la dinámica de los interruptores. Este enfoque ofrece la ventaja del seguimiento en tiempo real y la capacidad de sondear el comportamiento motor durante períodos prolongados. Los protocolos discutidos pueden extenderse fácilmente para estudiar los motores flagelares en una variedad de especies bacterianas.
Introducción
motores flagelares permiten a las células a nadar girando filamentos helicoidales extracelulares. La cantidad de par de torsión que el motor puede generar para una longitud dada del flagelo (es decir, la carga viscosa) determina las velocidades de natación. Por otro lado, su capacidad para cambiar el sentido de giro controla la migración de células en respuesta a productos químicos, un proceso conocido como la quimiotaxis. La quimiotaxis y la motilidad ser factores de virulencia 1-3, motores flagelares han sido bien caracterizado en los años 4. La evidencia creciente sugiere ahora que el motor actúa como un MechanoSensor - detecta mecánicamente la presencia de sustratos sólidos 5,6. Esta capacidad ayuda a probable en el desencadenamiento de la colonización de la superficie y las infecciones de 5,7. Como resultado, los mecanismos por los que el motor sentidos superficies e iniciados de señalización son de importancia 8,9.
El motor flagelar se puede estudiar fácilmente por la inmovilización del flagellum a un sustrato y la observación de la rotación de la célula. Dicha inmovilización se logró por primera vez por Silverman y Simon, que trabajó con un mutante polyhook en E. coli y ganchos conectados correctamente a sustratos de vidrio con anticuerpos anti-gancho 10. El ensayo de células tethered permitió a los investigadores estudiar las respuestas del motor-switch a una variedad de estímulos químicos. Por ejemplo, Segall y compañeros de trabajo estimularon células químicamente atados con la ayuda de pipetas iontoforéticos. Los cambios correspondientes en el sesgo de CW (la fracción de los motores giran las manecillas del reloj de tiempo, CW) les permitió medir la cinética de la adaptación en la red quimiotaxis 11,12. Si bien el ensayo de células tethered fue eficaz en el estudio de las respuestas de conmutación, sólo fue capaz de ofrecer una visión de la mecánica de motor en un intervalo limitado de cargas viscosos 13. Para superar este problema, Ryu y compañeros de trabajo conectado al ordenador, perlas de látex esféricas al filamento talones en las células pegadas a las superficies. Las perlas sea continuación, seguido utilizando interferometría de back-focal con trampas ópticas débiles 14. Al trabajar con los granos de diferentes tamaños, los investigadores pudieron estudiar el motor a través de una gama mucho más amplia de cargas. Este ensayo fue mejorada por Yuan y Berg, quien desarrolló una técnica de talones de seguimiento basado en fotomultiplicador combinado con iluminación láser de campo oscuro. Su método de seguimiento habilitado de nanobeads atados de oro que eran tan pequeña (~ 60 nm) que las resistencias externas viscosos eran más bajos en comparación con las resistencias internas viscosos a la rotación 15,16. Esto dio lugar a las mediciones de las velocidades máximas alcanzables en E. coli (~ 300 Hz). En V. Alginolyticus, ensayos de cuentas habilitadas similares mediciones de las velocidades de giro en cargas intermedias viscosos (~ 700 Hz) 17. Al permitir que las mediciones de las respuestas motoras sobre toda la gama posible de cargas viscosas (de carga cero a casi parada), el cordón-ensayos proporcionados en una importante herramienta de biofísico para entender la torque proceso de generación 18,19.
Recientemente, hemos modificado el ensayo de Yuan-Berg incluir pinzas ópticas que nos permitieron aplicar estímulos mecánicos precisos para motores individuales 6. Usando esta técnica, hemos demostrado que la fuerza de los generadores que giran el motor son mechanosensors dinámicos - se remodelan en respuesta a los cambios en las cargas viscosas. Es posible que tal de detección de carga provoca la diferenciación celular en bacterias que pululan, aunque los mecanismos no están claros. También es probable que los motores flagelares en otras especies también son mechanosensitive 20, aunque se carece de evidencia directa. A continuación, se discute el enfoque basado en el fotomultiplicador (PMT) para el seguimiento de la rotación de cuentas de látex atados a los filamentos flagelares 15. En comparación con el seguimiento con cámaras ultrarrápidos, el fotomultiplicador-configuración es ventajosa debido a que es relativamente sencillo para realizar el seguimiento perlas individuales en tiempo real y más largo duraciones. Es particularmente útil en el estudio de la remodelación a largo tiempo en los complejos de motor flagelar debido a los estímulos del medio ambiente 21. A pesar de que los protocolos de detalle específicamente para E. coli, que pueden adaptarse fácilmente para el estudio de motores flagelares en otras especies.
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Protocolo
1. Preparación de la célula
- Crecer cultivos de una noche de la cepa deseada que lleva el alelo pegajosa fliC 15,22 en triptona Broth (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguido de la inoculación a 1: 100 dilución en 10 ml de TB fresco. Mantener el cultivo a 33 ° C en un incubador con agitación hasta una DO600 = 0,5.
- Sedimentar las células a 1500 x g durante 5-7 min y re-dispersar el sedimento vigorosamente en 10 ml de tampón de motilidad filtro esterilizado (MB; tampón fosfato 10 mM: NaCl 0,05 a 0,06 M, 10 -4 M EDTA, 1 mM de metionina, pH 7,0).
- Repita el paso 1.2 dos veces más y volver a dispersar el sedimento final en 1 ml MB.
- Cizallar la suspensión mediante el paso de ida y vuelta ~ 75 veces entre dos jeringas con 21 a 23 adaptadores de calibre conectados por un tubo de polietileno (7 - 12 cm de largo, 0,58 mm de diámetro interno). Limitar el tiempo total para cizallar a 30 - 45 s.
- Centrifugar las células cortadas a 1.500 xg durante 5-7 minutos y volver a dispersar elprecipitado en 100 - 500 l de MB.
2. Preparación de los portaobjetos
- Preparar una cámara de imágenes intercalando dos cintas adhesivas de doble cara entre un cubre y un portaobjetos de microscopio. Para los ensayos de quimiotaxis, emplear cualquier cámara de microfluidos que permite el intercambio de MB y estimulantes químicos.
- Añadir 0,01% de solución de poli-L-lisina en la cámara y después de 5 min enjuagar suavemente las superficies con MB (80 - 100 L).
- Añadir 40 l de la suspensión celular en la cámara y permitir el tiempo suficiente para la unión a la superficie de vidrio (7-8 min). Flujo de salida células unstuck mediante la adición de 100 l MB en un lado de la cámara, mientras que absorbe la solución con un papel de filtro desde el otro lado.
- Añadir 10 - 15 l de perlas de látex en la cámara y permitir que las perlas de tiempo adecuado para asentarse y unirse a las células (7 - 8 min). Enjuague suavemente con 100 l de MB, tal como se describe en el paso 2.3, para eliminar los granos despegarse. Use una variedad de grano-sizes para los experimentos tan largos como un buen contraste está disponible.
3. Seguimiento del grano
- Coloque la muestra en una platina del microscopio y escanear la superficie de los granos unidos a motores. Utilice un objetivo de 40X fase para hacer observaciones a pesar de la microscopía de fase no es necesario. Alternativamente, emplear imágenes de campo brillante, siempre que suficiente contraste se mantiene distinguir claramente un cordón brillante sobre un fondo oscuro.
- Una vez que una perla ha sido seleccionado, mover la etapa de posicionar lateralmente el cordón en una esquina predeterminado como se muestra en la Figura 1B. perlas de posición en la misma esquina para asegurar que la dirección de rotación de la perla se conoce correctamente. La trayectoria del grano ideal es aproximadamente circular, pero las trayectorias elípticas son admisibles.
- Mantener la frecuencia de muestreo superior al doble de la frecuencia de rotación del motor para evitar los errores asociados con aliasing. En este trabajo, utilizar un motor que estaba girando a50 Hz y la muestra en las frecuencias que eran 10 veces más alta (500 Hz), para obtener una señal lisa.
Análisis 4. Datos
- Centro y escalar las tensiones de salida del PMT y elipticidad correcta en las trayectorias con transformaciones afines si es necesario 23. Use un análisis de espectro de potencia para determinar las tasas de rotación 17.
- Determinar ángulos polares, θ (t) = atan (Y (t) / x (t)). Determinar las variaciones en las velocidades del motor y el cambio en el tiempo mediante el cálculo de ω
14. - Emplear un filtro de mediana para suavizar los datos de velocidad del motor. Una ventana de filtro más de dos rotaciones completas se recomienda 23,24.
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Resultados
La configuración fotomultiplicador se muestra en la Figura 1A. Es importante que los PMT tienen altas sensibilidades más de la gama de longitudes de onda dispersas por las perlas de interés. Los EGP empleadas aquí operan en los rangos visible e infrarrojo cercano, y fueron capaces de detectar la luz dispersada por bolas iluminadas por una fuente de luz halógena. Las condiciones de iluminación óptimas y tensiones de alimentación varían de una configuración a otra. Para la...
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Discusión
Con el fin de facilitar el atado de talones de seguimiento y correcta estimación de los pares de motor, la siguiente información debe ser revisada. Al realizar estas mediciones con células flageladas, esquila es un paso crítico. Shearing reduce el filamento flagelar a un simple trozo, garantizando de este modo que la carga viscosa en el motor se debe principalmente a la perla y se puede estimar dentro del 10% de error 16. Shearing también mejora las posibilidades de encontrar trayectorias circulares con excen...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Howard Berg por el regalo del microscopio/fotomultiplicador de seguimiento de perlas y a la Estación Experimental de Ingeniería de Texas A&M por los fondos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de poli-L-lisina (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Microesferas de perlas de polietileno | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Jeringa Luer Slip Tip | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Adaptador Luer-Stub Intramedic calibre 23 | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Tubo de polietileno | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Fotomultiplicador Tubos | Hamamatsu | R7400U-20 | Rango de respuesta espectral de 300 a 920 nm, longitud de onda máxima de 630 nm, tiempo de respuesta de 0,78 ns; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 ranuras de precisión de 1 mm | Edmund Optics | NT39-908 | 2 ranuras montadas en ángulo recto entre sí en tubos fotomultiplicadores |
| Osciloscopio | Tektronix | TBS 1032B | Se aceptan marcas alternativas. Osciloscopio Digital, Serie TBS 1000B, 2 Analógicos, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| Filtro LP/HP de 8 polos | Krohn-Hite | 3384 | Se aceptan marcas alternativas. Se recomienda un rango de frecuencia de 0,1 Hz a 200 kHz. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Microscopio Optiphot | Nikon | NA | Se puede utilizar cualquier microscopio de fase vertical o invertida. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Divisor de haz cúbico | ThorLabs | BS013 |
Referencias
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