Hallazgos recientes sugieren que los motores flagelares bacterianos detectan una variedad de señales ambientales y se remodelan en respuesta. Se espera que los ensayos de perlas discutidos aquí ayuden a explicar el papel de la remodelación en la adaptación celular a los factores estresantes ambientales.
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Artículo de método
Caracterización biofísica de las funciones de motor flagelar
En este artículo
Resumen
Resumen
El papel de los motores flagelares en la motilidad y la quimiotaxis bacteriana es bien conocido. Descubrimientos recientes sugieren que los motores flagelares son capaces de remodelarse en respuesta a una variedad de estímulos ambientales y se encuentran entre los desencadenantes de la colonización de la superficie y las infecciones. Los mecanismos precisos por los cuales los motores se remodelan y promueven la adaptación celular probablemente dependan de los atributos motores clave. La técnica de seguimiento de cuentas basada en fotomultiplicadores que se presenta aquí permite una caracterización biofísica precisa de las funciones motoras, incluidas las adaptaciones en las velocidades del motor y la dinámica de los interruptores. Este enfoque ofrece la ventaja del seguimiento en tiempo real y la capacidad de sondear el comportamiento motor durante períodos prolongados. Los protocolos discutidos pueden extenderse fácilmente para estudiar los motores flagelares en una variedad de especies bacterianas.
Introducción
motores flagelares permiten a las células a nadar girando filamentos helicoidales extracelulares. La cantidad de par de torsión que el motor puede generar para una longitud dada del flagelo (es decir, la carga viscosa) determina las velocidades de natación. Por otro lado, su capacidad para cambiar el sentido de giro controla la migración de células en respuesta a productos químicos, un proceso conocido como la quimiotaxis. La quimiotaxis y la motilidad ser factores de virulencia 1-3, motores flagelares han sido bien caracterizado en los años 4. La evidencia creciente sugiere ahora que el motor actúa como un MechanoSensor - detecta mecán....
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Protocolo
1. Preparación de la célula
- Crecer cultivos de una noche de la cepa deseada que lleva el alelo pegajosa fliC 15,22 en triptona Broth (TB, 1% de peptona, 0,5% de NaCl), seguido de la inoculación a 1: 100 dilución en 10 ml de TB fresco. Mantener el cultivo a 33 ° C en un incubador con agitación hasta una DO600 = 0,5.
- Sedimentar las células a 1500 x g durante 5-7 min y re-dispersar el sedimento vigorosamente en 10 ml de tampón de motilidad filtro esterilizado (MB; tampón fosfato 10 mM: NaCl 0,05 a 0,06 M, 10 -4 M EDTA, 1 mM de metionina, pH 7,0).
- Repita el paso 1.2 dos veces más y volver a dispersa....
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Resultados
La configuración fotomultiplicador se muestra en la Figura 1A. Es importante que los PMT tienen altas sensibilidades más de la gama de longitudes de onda dispersas por las perlas de interés. Los EGP empleadas aquí operan en los rangos visible e infrarrojo cercano, y fueron capaces de detectar la luz dispersada por bolas iluminadas por una fuente de luz halógena. Las condiciones de iluminación óptimas y tensiones de alimentación varían de una configuración a otra. Para la.......
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Discusión
Con el fin de facilitar el atado de talones de seguimiento y correcta estimación de los pares de motor, la siguiente información debe ser revisada. Al realizar estas mediciones con células flageladas, esquila es un paso crítico. Shearing reduce el filamento flagelar a un simple trozo, garantizando de este modo que la carga viscosa en el motor se debe principalmente a la perla y se puede estimar dentro del 10% de error 16. Shearing también mejora las posibilidades de encontrar trayectorias circulares con excen.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Howard Berg por el regalo del microscopio/fotomultiplicador de seguimiento de perlas y a la Estación Experimental de Ingeniería de Texas A&M por los fondos.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de poli-L-lisina (0,1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Microesferas de perlas de polietileno | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 mL Jeringa Luer Slip Tip | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Adaptador Luer-Stub Intramedic calibre 23 | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Tubo de polietileno | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Fotomultiplicador Tubos | Hamamatsu | R7400U-20 | Rango de respuesta espectral de 300 a 920 nm, longitud de onda máxima de 630 nm, tiempo de respuesta de 0,78 ns; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 ranuras de precisión de 1 mm | Edmund Optics | NT39-908 | 2 ranuras montadas en ángulo recto entre sí en tubos fotomultiplicadores |
| Osciloscopio | Tektronix | TBS 1032B | Se aceptan marcas alternativas. Osciloscopio Digital, Serie TBS 1000B, 2 Analógicos, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| Filtro LP/HP de 8 polos | Krohn-Hite | 3384 | Se aceptan marcas alternativas. Se recomienda un rango de frecuencia de 0,1 Hz a 200 kHz. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Microscopio Optiphot | Nikon | NA | Se puede utilizar cualquier microscopio de fase vertical o invertida. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Divisor de haz cúbico | ThorLabs | BS013 |
Referencias
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun<....
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